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1、(10)申请公布号 CN 103965346 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103965346 A (21)申请号 201310526225.6 (22)申请日 2013.10.29 C07K 14/56(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (71)申请人 王明丽 地址 230032 安徽省合肥市梅山路 81 号安 徽医科大学 申请人 赵俊 (72)发明人 王明丽 赵俊 何磊 (74)专利代理机构 安徽合肥华信知识产权代理 有限公司 34112 代理人 余成俊 (54) 发明名称 一种 rPoIFN1 的分离纯化方。
2、法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 重 组 猪 干 扰 素 1 （recombinantporcineinterferon1， rPoIFN1) 规模化生产过程中的蛋白质分离纯 化方法。根据 rPoIFN1 带有 his-tag 标记蛋 白以及蛋白质间电荷差异的原理， 采用了包括镍 离子螯合层析、 强阳离子交换层析、 强阴离子交 换层析三步层析方法， 解决了大肠杆菌表达的 rPoIFN1 中含有大量宿主菌蛋白的问题， 大幅 度地提高了 rPoIFN1 的蛋白质纯度 （纯度可高 达 98.8%） ， 增加了其临床应用的安全性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 。
3、4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103965346 A CN 103965346 A 1/1 页 2 1. 一种 rPoIFN1 的分离纯化方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 金属螯合层析 ； （2） 强阳离子交换层析 ； （3） 强阴离子交换层析。 2. 根据权利要求 1 所述的一种 rPoIFN1 的分离纯化方法， 其特征在于所述的金属螯 合层析为镍离子螯合层析， 平衡液是含 545mM 咪唑的磷酸盐缓冲液。 3. 根据权利要求 1 所述的一种 rPoIFN1 的分离纯。
4、化方法， 其特征在于所述的强阳离 子交换层析所用纯化柱是 SP Sepharose FF， 平衡液是 pH4.06.0 的醋酸盐缓冲液。 4. 根据权利要求 1 所述的一种 rPoIFN1 的分离纯化方法， 其特征在于所述的阴离子 交换层析所用纯化柱是 Q Sepharose FF， 平衡液是含 025mM 氯化钠的缓冲液。 权 利 要 求 书 CN 103965346 A 2 1/4 页 3 一种 rPoIFN1 的分离纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及生物制药领域， 尤其涉及药用干扰素蛋白的纯化， 特别适用于工程菌 发酵得到的带 his-tag 标记基因工程重组干扰素规模化生产过程中。
5、的蛋白质分离纯化。 背景技术 0002 干扰素 （interferon， IFN）是由病毒或其他干扰素诱导剂刺激机体后产生的一 种小分子量糖蛋白， 具有广谱地抗病毒、 抗肿瘤及免疫调节等功能， 根据来源等不同， 可分 IFN-， IFN-， IFN- 三种。其中 IFN- 可刺激机体产生抗病毒蛋白质， 且具有广谱的 抗病毒作用。重组人 IFN- 已广泛用于临床， 治疗各种病毒性疾病， 其疗效已被各国学者 所公认， 但动物干扰素的临床应用却相对缓慢。 0003 我国是世界上养猪大国， 猪的疾病种类繁多， 特别是病毒性传染病造成的发病率 和死亡率最高， 每年给养猪业造成巨大的经济损失， 有些病毒性。
6、疾病还威胁到人类健康。 因 此具有良好抗病毒作用的重组猪干扰素， 不仅对我国养猪业的健康发展有重要意义， 也为 人类的生命健康提供了重要保障。 0004 本课题组采用基因工程原核表达技术， 已成功构建出可高效、 稳定表达具 有高活性 rPoIFN1 的E.coli BL21 工程菌 （重组猪 干扰素的制备方法， 专利号 2008100201804） ， 具有工艺流程短、 生产成本低等优点。 应用此工程菌进行高密度发酵后的 纯化目的蛋白是一道非常重要的工艺过程 ： 即将 rPoIFN1 从复杂的细菌表达环境中提取 出来， 去除各种杂质， 包括颗粒、 细菌、 内毒素、 核酸和各种杂蛋白等非目标蛋白。
7、物， 以达到 政府药品监督管理部门对该种生物制品要求的各项质量标准， 才能满足临床需求。 0005 目前国内外有一些对重组猪干扰素分离纯化报道， 但其重组猪干扰素制备工艺各 不相同， 因此生产过程中蛋白质纯化工艺也完全不同。 中国专利 （CN 101570757A） 构建的猪 干扰素 / 白细胞介素 2 融合蛋白是以包涵体形式表达， 采用包涵体变性复性的方法初步 纯化猪 干扰素 / 白细胞介素 2 融合蛋白， 该纯化工艺尚达不到生物制品生产要求 ； 中国 专利 （CN 102732587A） 采用真核载体构建表达重组猪干扰素 ， 该工艺生产周期较长， 规 模化生产成本高。因此探索建立本课题构建。
8、的 rPoIFN1 蛋白规模化生产分离纯化工艺， 具有重要的理论意义和实践价值。 0006 目前， 利用重组工程菌株表达生产级用生物制品， 在后期的分离纯化过程中一般 都要使用价值昂贵的单克隆抗体亲和层析纯化柱， 纯度才能达到 95% 以上。而本室自行构 建的工程菌所表达的 rPoIFN1， 市场上并无对应的单克隆抗体亲和层析纯化柱可供用于 纯化。因此， 自行建立一种经济、 快速和高效的纯化方法， 以得到高纯度的 rPoIFN1， 尤为 重要。 0007 本发明采用了包括镍离子螯合层析、 强阳离子交换层析、 强阴离子交换层析三步 层析方法， 大幅度地提高了 rPoIFN1 的纯度 （纯度高达 。
9、98.8%） 。 发明内容 说 明 书 CN 103965346 A 3 2/4 页 4 0008 本发明目的就是为了提供一种 rPoIFN1 的分离纯化方法。 0009 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 一种 rPoIFN1 的分离纯化方法， 包括以下步骤 ： （1） 金属螯合层析 ； （2） 强阳离子交换层析 ； （3） 强阴离子交换层析。 0010 所述的金属螯合层析为镍离子螯合层析， 平衡液是含 545mM 咪唑的磷酸盐缓冲 液 ； 强阳离子交换层析所用纯化柱是SP Sepharose FF， 平衡液是pH4.06.0的醋酸盐缓冲 液 ； 阴离子交换层析所用纯化柱是 Q Sephar。
10、ose FF， 平衡液是含 025mM 氯化钠的缓冲液。 0011 本发明的优点是 ： 使用本发明提供的纯化方法， 得到的 rPoIFN1 蛋白纯度高达 98.8%， 达到生物制品注 射用重组干扰素质量标准要求， 适合规模化生产用。 附图说明 0012 图 1 rPoIFN1 蛋白层析纯化色谱图 ; 图 1 A: rPoIFN1 蛋白亲和层析色谱图， 其中纵坐标 mAu 表示 A280 紫外吸收值， 横坐 标为体积 ; 图 1 B: rPoIFN1 蛋白阳离子交换层析色谱图， 其中纵坐标 mAu 表示 A280 紫外吸收 值， 横坐标为体积 ; 图 1 C: rPoIFN1 蛋白阴离子交换层析。
11、色谱图， 其中纵坐标 mAu 表示 A280 紫外吸收 值， 横坐标为体积 ; 图 2 rPoIFN1 纯化蛋白 Western blot 检测结果 M ： 蛋白质分子量 Marker ； 泳道 1 ： rPoIFN1 蛋白纯化后结果 ； 泳道 2 ： rPoIFN1 蛋白纯化前对照 ； 泳道 3 ： BL21 工程菌蛋白对照。 0013 图 3rPoIFN1 纯化蛋白 SDS-PAGE 检测结果 ; M ： 蛋白分子标准 ; 泳道 1 ： rPoIFN1 蛋白纯化前对照 ； 泳道 2 ： 亲和层析纯化洗去的杂蛋白 ； 泳道 3 ： 亲和层析纯化收集的目的蛋白 ； 泳道 4 ： 阴离子交换层析。
12、后收集的目的蛋白 ； 图 4:rPoIFN1 纯化蛋白 RP-HPLC 检测色谱图 其中纵坐标 Au 表示 A280 紫外吸收值， 横坐标为保留时间。 具体实施方式 0014 实施例 1 说 明 书 CN 103965346 A 4 3/4 页 5 rPoIFN1 规模化生产中蛋白质纯化工艺的建立 利用该重组蛋白带 his-tag 标记基因， 采用镍离子交换层析， 首先去除大部分的杂蛋 白。其次选择两次离子交换的层析方法， 先用强阳离子交换层析， 去除大量内毒素， 后用强 阴离子交换层析， 进一步纯化。 0015 1. 材料与仪器 Chelating Separose Fast Flow 填料。
13、(GE healthcare公司产品) ； SP Sepharose FF 填料 (GE healthcare 公司产品 ) ； Q Sepharose FF 填料 (GE healthcare 公司产品 ) ； Column XK16/20(GE healthcare 公司产品 ) ； AKTA exploer100 层析系统 (GE healthcare 公司产品 )。 0016 2. 实验方法 2.1 金属镍螯合亲和层析法纯化 rPoIFN1 蛋白 1） 清洗 ： 用超纯水洗去纯化系统管道中的保存液， 再用35个柱体积的双蒸水清洗Ni2+ 螯合亲和层析柱， 流速为 3ml/min ； 2。
14、） 平衡 ： 用 35 个柱体积的 Binding Buffer 1（20mM Na2HPO4， 500 mM NaCl， 545 mM Imidazole, pH 7.510.5） 平衡层析柱， 流速为 3ml/min ； 3） 上样 ： 将用 0.22m 孔径滤膜过滤处理过的样品过层析柱， 流速为 5ml/min ； 4） 洗杂 ： 用 4 个柱体积以上的 Binding Buffer 1 过层析柱， 洗去未与层析柱结合的杂 蛋白， 直到检测不到蛋白吸收峰， 流速 3ml/min ； 5） 洗脱 ： 用 Elution Buffer 1（20mM Na2HPO4， 500 mM NaCl，。
15、 300-500mM Imidazole， pH 7.510.5） ， 阶段洗脱， 流速 3ml/min ； 6） 收集 ： 收集洗脱下来的蛋白吸收峰 ； 7） 洗柱 ： 用双蒸水清洗层析柱， 流速为 3ml/min ； 8） 保存 ： 用 20乙醇过层析柱， 流速为 3ml/min。 0017 2.2 SP Sepharose FF 阳离子交换层析进一步纯化 rPoIFN-1 蛋白 1） 平衡 ： 用 23 个柱体积的 Binding Buffer （50mM 醋酸钠 ， pH 4.06.0） 平衡阳 离子交换柱， 流速为 2ml/min ； 2） 上样 ： 将上述亲和层析收集的样品用Bin。
16、ding Buffer 透析过滤， 上到阳离子交换 层析柱中， 流速为 1ml/min ； 3） 淋洗 ： 用 Binding Buffer 洗去大部分杂蛋白， 直至紫外基线稳定， 流速为 2ml/ min ； 4） 洗杂 ： 用 50% Elution Buffer （50mM 醋酸钠 ， 1M NaCl， pH 4.06.0） 洗去结合力弱的杂蛋白， 直至紫外基线稳定， 流速为 2ml/min ； 5） 洗脱 ： 用 Elution Buffer ， 以 2ml/min 的流速洗脱， 收集蛋白吸收峰 ； 6） 洗柱 ： 用双蒸水清洗柱子， 流速 2ml/min ； 7） 保存 ： 用 20。
17、乙醇过柱， 流速为 2ml/min。 0018 2.3、 Q Sepharose FF 阴离子交换层析纯化 rPoIFN1 蛋白 1）平衡 ： 用 2-3 个柱体积的 Binding Buffer(50mM Tris-HCl ， 25mM NaCl， pH 6.09.0) 平衡阴离子交换柱， 流速为 2ml/min ； 2） 上样 ： 将上一步纯化收集的样品用 Binding Buffer透析过滤， 上到阴离子交换层 说 明 书 CN 103965346 A 5 4/4 页 6 析柱中， 流速为 1ml/min ； 3） 淋洗 ： 用 10% 的 Elution Buffer， 洗去大部分杂蛋。
18、白， 直至紫外基线稳定， 流速为 2ml/min ； 4） 洗脱 ： 用 Elution Buffer冲洗， 以 2ml/min 的流速洗脱， 收集蛋白吸收峰 ； 5） 洗柱 ： 用双蒸水清洗柱子， 流速 2ml/min ； 6） 保存 ： 用 20乙醇过柱， 流速为 2ml/min。 0019 rPoIFN1 纯化蛋白的检测 1） Western blot 检测 对分离纯化后的rPoIFN1进行Western blot 鉴定， 一抗 ： 猪干扰素单克隆抗体购 自 ABcam 等公司， 使用前 1000 倍稀释， 二抗 ： HRP 标记羊抗鼠 IgG， 使用前 1000 倍稀释。纯 化后的 r。
19、PoIFN1 经 Western blot 检测表明 ： 纯化前后 rPoIFN1 均可与猪干扰素 单 克隆抗体发生特异性反应， 在 35KD 处出现特异性条带。具体结果如图 2 所示。 0020 2） SDS-PAGE 检测 将分离纯化的蛋白样品进行 SDS-PAGE 分析， SDS-PAGE 分析结果如图 3 所示， 经过纯化 去除杂蛋白后 SDS-PAGE 上只看到单一条带。 0021 3） RP-HPLC 检测 重组菌诱导表达破碎后收集到的上清依次经镍亲和层析、 强阳离子交换层析和强阴离 子交换层析， 最后得到的纯化蛋白经RPC C18 ST 4.6/100反相层析柱进行分析检测蛋白 。
20、纯度， 流动相A ： 0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液 ； B:0.08%TFA+80%乙腈(CAN)， 流速0.8ml/min， 连续梯度洗脱， 30min 从 100%A 到 100%B。根据 A280nm 吸收峰的峰面积计算样品纯度。 0022 纯化后的 rPoIFN1 经 RPC C18 ST 4.6/100 反相层析柱进行分析只得到一个 主吸收峰 ， 其他 4 个峰为杂峰。通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的 98.8%。 说 明 书 CN 103965346 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103965346 A 7 2/2 页 8 图 4 说 明 书 附 图 CN 103965346 A 8 。