取代的苯磺酰胺 发明领域 本发明涉及如本文描述和定义的取代的苯磺酰胺 ( 下文中称为 “通式 (I) 化合 物” )， 制备所述化合物的方法， 包含所述化合物的药物组合物和组合， 以及所述化合物作为 单独活性剂或者与其他活性组分一起在制备用于治疗或预防疾病， 特别是高增殖性病症和 / 或血管生成病症的药物组合物中的应用。
发明背景 癌症是组织的异常生长所导致的疾病。一些癌症有可能侵袭到局部组织内， 并且还有 可能转移至远程器官。癌症可以在多种多样的不同器官、 组织和细胞类型中发展。因此， 术 语 “癌症” 是指一千多种不同疾病的合称。
在 2002 年， 在世界范围内有超过四百四十万人被诊断为患有乳腺癌、 结肠癌、 卵 巢癌、 肺癌或前列腺癌， 并且有超过二百五十万人死于这些毁灭性疾病 ((Globocan 2002 Report)。 单单在美国， 预计在 2005 年有超过一百二十五万的新病例和超过 500,000 人死于 癌症。预计这些新病例中大部分是结肠癌 ( ～ 100,000)、 肺癌 ( ～ 170,000)、 乳腺癌 ( ～
210,000) 和前列腺癌 ( ～ 230,000)。预计下一个 10 年中癌症的发病率和流行率会提高大 约 15%， 反映为 1.4% 的平均增长速度 [1]。
越来越多的证据表明， 癌症可以 “信号传导疾病” 来研究， 其中影响致癌基因和肿 瘤抑制基因的表达和 / 或功能的细胞基因组改变最终影响信号传导， 这些信号通常调节细 胞生长、 分化和程序化细胞死亡 （细胞凋亡） 。揭示在人类癌症中失调的信号传导途径已经 使得设计出了越来越多的基于机理的治疗剂 [2]。 最近， 作为人类恶性肿瘤治疗策略的信号 传导抑制已取得了显著成功， 例如 Gleevec 在治疗慢性骨髓性白血病 (CML) 和胃肠道基质 肿瘤 (GIST) 发明取得了进展， 开创了 “分子 - 靶向” 治疗的新纪元 [3-5]。
促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 组件是沿着信号传导级联的关键整合点， 其将各 种细胞外刺激与增殖、 分化和存活联系起来。过去 20 年来的科学研究已经使得对该途径有 了相当详细的分子水平上的了解， 现在该途径已经发展到包括 5 种不同 MAPK 亚家族 [ 细胞 外信号调节激酶 ERK-1/2， c-Jun-N- 末端激酶 (JNKs)， p38 激酶， ERK-3/4 和 ERK-5]， 这5种 不同 MAPK 亚家族具有不同的分子和功能特征 [6-8]。虽然一些亚家族， 例如 p38 亚家族正 在成为炎性和变性疾病的治疗靶目标， 但是从 Ras 到 ERK-1/2 的 MAPK 级联 ( 由肽生长因子 引发的主要促分裂途径 ) 正开始成为不同类型人类癌症的分子治疗的主要靶目标 [9-11]。 作为遗传和外遗改变的结果， MAPK 途径在很多人类肿瘤中被异常活化， 导致增殖增强以及 对凋亡刺激的抗性增强。特别是， 在 50% 的结肠癌以及超过 90% 的胰腺癌中发现了 Ras 的 突变的致癌形式 [12]。最近， 已经在超过 60% 的恶性黑素瘤中发现了 BRAF 突变 [13]。这 些突变导致组成性活化的 MAPK 途径。此外， 一些受体酪氨酸激酶的过度表达或突变活化也 可以导致 Raf-MEK-ERK 途径的活化增强。
Raf/MEK/ERK 级联的分子性质在由 MEK 调控的交叉点变得较不多向性 [14]。除了 ERK-1/2 之外， 没有鉴定出 MEK 的任何底物。磷酸化 ERK 是 MEK 活性的产物， 因此其在癌细 胞和肿瘤组织中的检测是 MEK 抑制的直接测量。 MEK 对于 ERK1/2 的选择性以及双重磷酸化和活化形式的 ERK 的可用性使得 MEK 成为抗癌药物开发的有吸引力的靶标。此外， 最近有 人表明， MEK 活化调节基质矿化 (Blood 2007, 40 , 68)， 由此 MEK 活性的调节也可用于治疗 由组织矿化失控引起或伴随组织矿化失控的疾病， 更具体来说， 可用于治疗由骨矿化失控 引起或伴随骨矿化失控的疾病。
第一代 MEK 抑制剂， PD98059 [15] 和 U0126 [16] 似乎不与 ATP 竞争， 因此可能 在 MEK 上具有不同结合位点 ； 这些化合物已经广泛用于体外和体内模型系统中以将生物活 性归结于 ERK1/2。第二代 MEK1/2 抑制剂 PD184352 ( 现在称为 CI-1040) 具有低纳摩尔范 围的 IC50， 提高的生物利用度， 并且似乎经由变构、 非 ATP- 竞争性机制来起作用 [17]。已 经有人表明， 在小鼠模型中， 用 CI-1040 口服治疗在体内抑制结肠癌生长 [18]， 并且在 I/ II 期人临床试验中评估了该化合物， 最终由于效力不足而失败 [19]。最近， 另外的变构 MEK 抑制剂已进入了临床， 但是发现这些抑制剂具有局限例如不良暴露特性， 有限的效力和 / 或毒性问题。已经公开了小分子 MEK 抑制剂， 包括公开于 US 专利公开号 2003/0232869， 2004/0116710， 2003/0216420 以 及 US 专 利 公 开 号 10/654,580 和 10/929,295 中， 每一 这些文献引入本文以供参考。在过去几年， 出现了多个另外的专利申请， 包括 US 专利 5,525,6625 ； WO 98/43960 ； WO 99/01421 ； WO 99/01426 ； WO 00/41505 ； WO 00/41994 ； WO 00/42002 ； WO 00/42003 ； WO 00/42022 ； WO 00/42029 ； WO 00/68201 ； WO 01/68619 ； WO 02/06213 ； WO 03/077914 ； WO 03/077855 ； WO 04/083167 ； WO 05/0281126 ； WO 05/051301 ； WO 05/121142 ； WO 06/114466 ； WO 98/37881 ； WO 00/35435 ； WO 00/35436 ； WO 00/40235 ； WO 00/40237 ； WO 01/05390 ； WO 01/05391 ； WO 01/05392 ； WO 01/05393 ； WO 03/062189 ； WO 03/062191 ； WO 04/056789 ； WO 05/000818 ； WO 05/007616 ； WO 05/009975 ； WO 05/051300 ； WO 05/051302 ； WO 05/028426 ； WO 06/056427 ； WO 03/035626 ； 和 WO 06/029862。
尽管在本领域取得了这些进展， 但是仍然需要癌症治疗和抗癌化合物。更具体来 说， 仍然需要具有均衡的效力 - 性质特性的结构上新的 MEK 抑制剂。 尤其希望获得新的 MEK 抑制剂， 所述抑制剂引入了现有技术中没有例示过并且与有效的 MEK 抑制相容的结构基 元。如果这些结构基元能够进一步容许改善 MEK 效力和 / 或调节化合物性质 （包括物化性 质、 药效学性质和药动学性质） ， 这将是特别有利的。
WO 2008/138639 (Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft) 涉及取代的苯 基氨基苯化合物， 包含所述化合物的药物组合物， 以及所述化合物或组合物在治疗高增殖 和 / 或血管增殖病症中的应用。发现所述化合物是有效的选择性 MEK 抑制剂。所述化合物 衍生自 1- 取代的 -2- 苯基氨基 - 苯基构架， 其在苯基构架的 6- 位具有进一步特定取代的 侧链。该发现是令人惊讶的， 因为对于公开的苯基构架衍生的 MEK 抑制剂的分析和以前结 构 - 活性关系分析 ( 参见例如 Haile Tecle/Pfizer Global Research:“MEK inhibitors” , th presented at Drew University, 15 June 2006) 表明， 在基于苯基构架的 MEK 抑制剂中， 较大的 6- 取代基对于实现高 MEK 抑制效力是有害的。所述化合物是有效的 MEK 抑制剂并 且抑制 MEK-ERK 途径的活化。
然而， 上面的现有技术都没有描述如本文所述的本发明所选择的通式 (I) 化合物 或其立体异构体、 互变异构体、 N- 氧化物、 水合物或盐， 或其混合物， 或其药理活性， 所述化 合物在中央苯基环上携带选择的取代基 ( 通式 –NHS(O)2R3 所示选择的磺酰胺基团 )， 并且 在西边苯基环的 3- 位上携带选择的取代基 ( 通式 –NHS(O)2R4 所示特定选择的磺酰胺基团 )， 并且所述化合物在下文中称为 “本发明化合物” 。
现在已经发现， 并且这构成了本发明的基础， 所述本发明化合物具有令人惊奇的 有利性质。
特别是， 已经惊奇地发现， 不仅在 B-Raf 突变的人 A375 黑素瘤细胞中， 而且在 K-Ras 突变的人 A549 非小细胞肺癌中以及在 K-Ras 突变的人 HCT116 结肠直肠癌细胞中， 所述本发明化合物强而有效地抑制癌细胞增殖。更令人惊奇的是， 与现有技术文件 WO 2008/138639 中的化合物相比， 本发明化合物表现出更强的癌细胞增殖抑制。
鉴于此， 本发明通式 (I) 化合物可因此用于治疗或预防失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活， 不适当的细胞免疫反应， 或不适当的细胞炎性反应的疾病， 或者伴随失控的细胞 生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的细胞免疫反应或不适当的细胞炎性反应的疾病， 特别是其 中失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的细胞免疫反应或不适当的细胞炎性反应是 通过促分裂原活化蛋白激酶 (MEK-ERK) 途径介导的那些疾病， 例如血液学肿瘤， 实体瘤和 / 或其转移瘤， 例如白血病和骨髓增生异常综合征， 恶性淋巴瘤， 头和颈肿瘤， 包括脑肿瘤和 脑转移瘤， 胸部肿瘤， 包括非小细胞和小细胞肺肿瘤， 胃肠道肿瘤， 内分泌肿瘤， 乳腺肿瘤和 其他妇科肿瘤， 泌尿系统肿瘤， 包括肾肿瘤、 膀胱肿瘤和前列腺肿瘤， 皮肤肿瘤， 和肉瘤， 和/ 或其转移瘤。
发明详述 根据第一个方面， 本发明涉及通式 (I) 化合物 ：(I) 其中 R1 是氢原子或氟原子 ； R2 是卤素原子或 C2- 炔基 ； R3 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基 或 -C3-C6- 环烷基 ； R4 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基 或 -C3-C6- 环烷基 ； R5 是卤素原子或 -C1-C6- 烷基或 –O-C1-C6- 烷基 ； A 是 –(CH2)n-， 其中 n = 0 或 1 ； 或其互变异构体、 立体异构体、 N- 氧化物、 盐、 水合物、 溶剂化物、 代谢物或前药。
定义 在本申请中提及的术语优选具有以下含义 ： 应当理解， 术语 “卤素原子” 或 “卤代” 是指氟、 氯、 溴或碘原子。应当理解， 术语 “C1-C10- 烷基” 优选是指具有 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个碳原子， 特别是 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个碳原子的直链或支链饱和单价烃基， 例如甲基、 乙基、 丙基、 丁基、 戊基、 己基、 异丙基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 异戊基、 2- 甲基丁基、 1- 甲基丁基、 1- 乙基丙 基、 1,2- 二甲基丙基、 新戊基、 1,1- 二甲基丙基、 4- 甲基戊基、 3- 甲基戊基、 2- 甲基戊基、 1- 甲基戊基、 2- 乙基丁基、 1- 乙基丁基、 3,3- 二甲基丁基、 2,2- 二甲基丁基、 1,1- 二甲基丁 基、 2,3- 二甲基丁基、 1,3- 二甲基丁基或 1,2- 二甲基丁基或其异构体。特别是， 所述基团 具有 1、 2 或 3 个碳原子 (“C1-C3- 烷基” )， 甲基、 乙基、 正丙基或异丙基。
应当理解， 术语 “卤代 -C1-C10- 烷基” 优选是指直链或支链饱和单价烃基， 其中术 语 “C1-C10- 烷基” 如上所定义， 并且其中一个或多个氢原子被卤素原子替代， 所述原子是相 同或不同的， 即一个卤素原子独立于另一个卤素原子。特别是， 所述卤素原子是 F。所述卤 代 -C1-C10- 烷基是例如 –CF3、 -CHF2、 -CH2F、 -CF2CF3 或 -CH2CF3。
应当理解， 术语 “C1-C10- 烷氧基” 优选是指式 –O- 烷基的直链或支链饱和单价烃 基， 其中术语 “烷基” 如上所定义， 例如甲氧基、 乙氧基、 正丙氧基、 异丙氧基、 正丁氧基、 异丁 氧基、 叔丁氧基、 仲丁氧基、 戊氧基、 异戊氧基或正己氧基或其异构体。
应当理解， 术语 “卤代 -C1-C10- 烷氧基” 优选是指如上所定义的直链或支链饱和单 价 C1-C10- 烷氧基， 其中一个或多个氢原子被相同或不同的卤素原子替代。 特别是， 所述卤素 原子是 F。所述卤代 -C1-C10- 烷氧基是例如 –OCF3、 -OCHF2、 -OCH2F、 -OCF2CF3 或 -OCH2CF3。
应当理解， 术语 “C1-C10- 烷氧基 -C1-C10- 烷基” 优选是指如上所定义的直链或支链 饱和单价烷基， 其中一个或多个氢原子被相同或不同的如上所定义的 C1-C10- 烷氧基替代， 例如甲氧基烷基、 乙氧基烷基、 丙氧基烷基、 异丙氧基烷基、 丁氧基烷基、 异丁氧基烷基、 叔 丁氧基烷基、 仲丁氧基烷基、 戊氧基烷基、 异戊氧基烷基、 己氧基烷基， 其中术语 “C1-C10- 烷 基” 如上所定义， 或其异构体。
应当理解， 术语 “卤代 -C1-C10- 烷氧基 -C1-C10- 烷基” 优选是指如上所定义的直链 或支链饱和单价 C1-C10- 烷氧基 -C1-C10- 烷基， 其中一个或多个氢原子被相同或不同的卤素 原子替代。特别是， 所述卤素原子是 F。所述卤代 -C1-C10- 烷氧基 -C1-C10- 烷基是例如 –CH -CH2CH2OCHF2、 -CH2CH2OCH2F、 -CH2CH2OCF2CF3 或 -CH2CH2OCH2CF3。 2CH2OCF3、
应当理解， 术语 “C2-C10- 链烯基” 优选是指直链或支链单价烃基， 其含有一个或多 个双键， 并且具有 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个碳原子， 特别是 2 或 3 个碳原子 (“C2-C3- 链 烯基” )， 应当理解， 当所述链烯基含有一个以上双键时， 所述双键可以是孤立的形式， 或者 彼此之间是共轭的。所述链烯基是例如乙烯基、 烯丙基、 (E)-2- 甲基乙烯基、 (Z)-2- 甲基 乙烯基、 高烯丙基、 (E)- 丁 -2- 烯基、 (Z)- 丁 -2- 烯基、 (E)- 丁 -1- 烯基、 (Z)- 丁 -1- 烯 基、 戊 -4- 烯 基、 (E)- 戊 -3- 烯 基、 (Z)- 戊 -3- 烯 基、 (E)- 戊 -2- 烯 基、 (Z)- 戊 -2- 烯 基、 (E)- 戊 -1- 烯基、 (Z)- 戊 -1- 烯基、 己 -5- 烯基、 (E)- 己 -4- 烯基、 (Z)- 己 -4- 烯基、 (E)- 己 -3- 烯基、 (Z)- 己 -3- 烯基、 (E)- 己 -2- 烯基、 (Z)- 己 -2- 烯基、 (E)- 己 -1- 烯基、 (Z)- 己 -1- 烯基、 异丙烯基、 2- 甲基丙 -2- 烯基、 1- 甲基丙 -2- 烯基、 2- 甲基丙 -1- 烯基、 (E)-1- 甲基丙 -1- 烯基、 (Z)-1- 甲基丙 -1- 烯基、 3- 甲基丁 -3- 烯基、 2- 甲基丁 -3- 烯基、 1- 甲基丁 -3- 烯基、 3- 甲基丁 -2- 烯基、 (E)-2- 甲基丁 -2- 烯基、 (Z)-2- 甲基丁 -2- 烯 基、 (E)-1- 甲基丁 -2- 烯基、 (Z)-1- 甲基丁 -2- 烯基、 (E)-3- 甲基丁 -1- 烯基、 (Z)-3- 甲 基丁 -1- 烯基、 (E)-2- 甲基丁 -1- 烯基、 (Z)-2- 甲基丁 -1- 烯基、 (E)-1- 甲基丁 -1- 烯基、(Z)-1- 甲基丁 -1- 烯基、 1,1- 二甲基丙 -2- 烯基、 1- 乙基丙 -1- 烯基、 1- 丙基乙烯基、 1- 异 丙基乙烯基、 4- 甲基戊 -4- 烯基、 3- 甲基戊 -4- 烯基、 2- 甲基戊 -4- 烯基、 1- 甲基戊 -4- 烯 基、 4- 甲基戊 -3- 烯基、 (E)-3- 甲基戊 -3- 烯基、 (Z)-3- 甲基戊 -3- 烯基、 (E)-2- 甲基 戊 -3- 烯基、 (Z)-2- 甲基戊 -3- 烯基、 (E)-1- 甲基戊 -3- 烯基、 (Z)-1- 甲基戊 -3- 烯基、 (E)-4- 甲基戊 -2- 烯基、 (Z)-4- 甲基戊 -2- 烯基、 (E)-3- 甲基戊 -2- 烯基、 (Z)-3- 甲基 戊 -2- 烯基、 (E)-2- 甲基戊 -2- 烯基、 (Z)-2- 甲基戊 -2- 烯基、 (E)-1- 甲基戊 -2- 烯基、 (Z)-1- 甲基戊 -2- 烯基、 (E)-4- 甲基戊 -1- 烯基、 (Z)-4- 甲基戊 -1- 烯基、 (E)-3- 甲基 戊 -1- 烯基、 (Z)-3- 甲基戊 -1- 烯基、 (E)-2- 甲基戊 -1- 烯基、 (Z)-2- 甲基戊 -1- 烯基、 (E)-1- 甲基戊 -1- 烯基、 (Z)-1- 甲基戊 -1- 烯基、 3- 乙基丁 -3- 烯基、 2- 乙基丁 -3- 烯基、 1- 乙基丁 -3- 烯基、 (E)-3- 乙基丁 -2- 烯基、 (Z)-3- 乙基丁 -2- 烯基、 (E)-2- 乙基丁 -2- 烯 基、 (Z)-2- 乙基丁 -2- 烯基、 (E)-1- 乙基丁 -2- 烯基、 (Z)-1- 乙基丁 -2- 烯基、 (E)-3- 乙基 丁 -1- 烯基、 (Z)-3- 乙基丁 -1- 烯基、 2- 乙基丁 -1- 烯基、 (E)-1- 乙基丁 -1- 烯基、 (Z)-1- 乙 基丁 -1- 烯基、 2- 丙基丙 -2- 烯基、 1- 丙基丙 -2- 烯基、 2- 异丙基丙 -2- 烯基、 1- 异丙基 丙 -2- 烯基、 (E)-2- 丙基丙 -1- 烯基、 (Z)-2- 丙基丙 -1- 烯基、 (E)-1- 丙基丙 -1- 烯基、 (Z)-1- 丙基丙 -1- 烯基、 (E)-2- 异丙基丙 -1- 烯基、 (Z)-2- 异丙基丙 -1- 烯基、 (E)-1- 异 丙基丙 -1- 烯基、 (Z)-1- 异丙基丙 -1- 烯基、 (E)-3,3- 二甲基丙 -1- 烯基、 (Z)-3,3- 二甲基 丙 -1- 烯基、 1-(1,1- 二甲基乙基 ) 乙烯基、 丁 -1,3- 二烯基、 戊 -1,4- 二烯基、 己 -1,5- 二 烯基或甲基己二烯基。特别是， 所述基团是乙烯基或烯丙基。
应当理解， 术语 “C2-C10- 炔基” 优选是指直链或支链单价烃基， 其含有一个或多个 三键， 并且含有 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个碳原子， 特别是 2 或 3 个碳原子 ( “C2-C3- 炔基” )。 所述 C2-C10- 炔基是例如乙炔基、 丙 -1- 炔基、 丙 -2- 炔基、 丁 -1- 炔基、 丁 -2- 炔基、 丁 -3- 炔 基、 戊 -1- 炔基、 戊 -2- 炔基、 戊 -3- 炔基、 戊 -4- 炔基、 己 -1- 炔基、 己 -2- 炔基、 己 -3- 炔 基、 己 -4- 炔基、 己 -5- 炔基、 1- 甲基丙 -2- 炔基、 2- 甲基丁 -3- 炔基、 1- 甲基丁 -3- 炔基、 1- 甲基丁 -2- 炔基、 3- 甲基丁 -1- 炔基、 1- 乙基丙 -2- 炔基、 3- 甲基戊 -4- 炔基、 2- 甲基 戊 -4- 炔基、 1- 甲基戊 -4- 炔基、 2- 甲基戊 -3- 炔基、 1- 甲基戊 -3- 炔基、 4- 甲基戊 -2- 炔 基、 1- 甲基戊 -2- 炔基、 4- 甲基戊 -1- 炔基、 3- 甲基戊 -1- 炔基、 2- 乙基丁 -3- 炔基、 1- 乙 基丁 -3- 炔基、 1- 乙基丁 -2- 炔基、 1- 丙基丙 -2- 炔基、 1- 异丙基丙 -2- 炔基、 2,2- 二甲基 丁 -3- 炔基、 1,1- 二甲基丁 -3- 炔基、 1,1- 二甲基丁 -2- 炔基或 3,3- 二甲基丁 -1- 炔基。 特别是， 所述炔基是乙炔基、 丙 -1- 炔基或丙 -2- 炔基。
应当理解， 术语 “C3-C10- 环烷基” 优选是指饱和单价单环或二环烃环， 其含有 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个碳原子， 特别是 3、 4、 5 或 6 个碳原子 ( “C3-C6- 环烷基” )。所述 C3-C10- 环 烷基是例如单环烃环， 例如环丙基、 环丁基、 环戊基、 环己基、 环庚基、 环辛基、 环壬基或环癸 基， 或二环烃环， 例如全氢并环戊二烯 (perhydropentalenylene) 或十氢化萘环。所述环 烷基环可任选含有一个或多个双键， 例如环烯基， 如环丙烯基、 环丁烯基、 环戊烯基、 环己烯 基、 环庚烯基、 环辛烯基、 环壬烯基或环癸烯基， 其中所述环与分子其余部分之间的键可以 连接在所述环的任何碳原子上， 无论其是饱和或还是不饱和的。
应当理解， 术语 “亚烷基” 优选是指具有 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个碳原子的任选取代的烃 链(或 “系链” )， 即任选取代的 –CH2- ( “亚甲基” 或 “单元系链” 或例如 -C(Me)2-)、 -CH2-CH2(“亚乙基” 、 “二亚甲基” 或 “二元系链” )、 -CH2-CH2-CH2- (“亚丙基” 、 “三亚甲基” 或 “三元系链” )、 -CH2-CH2-CH2-CH2- (“亚丁基” 、 “四亚甲基” 或 “四元系链” )、 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2(“亚戊基” 、 “五亚甲基” 或 “五元系链” ) 或 –CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- (“亚己基” 、 “六 亚甲基” 或 “六元系链” )。特别是， 所述亚烷基系链具有 1、 2、 3、 4 或 5 个碳原子， 更特别是 1 或 2 个碳原子。
应当理解， 在本申请中使用的术语 “C1-C6” ， 例如在 “C1-C6- 烷基” 、 “C1-C6- 卤代烷 基” 、 “C1-C6- 烷氧基” 或 “C1-C6- 卤代烷氧基” 的定义中使用的术语 “C1-C6” 是指具有 1-6 个 有限数目碳原子， 即 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个碳原子的烷基。 还应当理解， 所述术语 “C1-C6” 是包括 在其中的任何亚范围， 例如 C1-C6、 C2-C5、 C3-C4、 C1-C2、 C1-C3、 C1-C4、 C1-C5 C1-C6 ； 特别是 C1-C2、 C1-C3、 C1-C4、 C1-C5、 C1-C6 ； 更特别是 C1-C4 ； 在 “C1-C6- 卤代烷基” 或 “C1-C6- 卤代烷氧基” 中， 甚至更特别是 C1-C2。
类似地， 应当理解， 如本申请中使用的术语 “C2-C6” ， 例如在 “C2-C6- 链烯基”和 “C2-C6- 炔基” 的定义中使用的术语 “C2-C6” 是指具有 2-6 个有限数目碳原子， 即 2、 3、 4、 5或 6 个碳原子的链烯基或炔基。还应当理解， 所述术语 “C2-C6” 是包括在其中的任何亚范围， 例如 C2-C6、 C3-C5、 C3-C4、 C2-C3、 C2-C4、 C2-C5 ； 特别是 C2-C3。
此外， 应当理解， 如本申请中使用的术语 “C3-C10” ， 例如在 “C3-C10- 环烷基” 的定义 中使用的术语 “C3-C10” 是指具有 3-10 个有限数目碳原子， 即 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个碳原 子， 特别是 3、 4、 5 或 6 个碳原子的环烷基 。还应当理解， 所述术语 “C3-C10” 是包括在其中 的任何亚范围， 例如 C3-C10、 C4-C9、 C5-C8、 C6-C7 ； 特别是 C3-C6。
应当理解， 如在本文中使用的术语 “一次或多次” ， 例如在本发明通式化合物的取 代基的定义中使用的术语 “一次或多次是指 “一次、 两次、 三次、 四次或五次， 特别是一次、 两 次、 三次或四次， 更特别是一次、 两次或三次， 甚至更特别是一次或两次” 。
当在本文中， 词语化合物、 盐、 多晶型物、 水合物、 溶剂化物等以复数形式使用时， 其也包括单一化合物、 盐、 多晶型物、 异构体、 水合物、 溶剂化物等。
本发明化合物可以含有一个或多个不对称中心， 这取决于所需不同取代基的位置 和性质。不对称碳原子可以以 (R) 或 (S) 构型存在， 当存在一个不对称中心时， 这导致外消 旋混合物， 大明湖存在多个不对称中心时， 这导致存在非对映异构体混合物。在一些情况 下， 不对称还有可能是由于围绕给定键的旋转受到限制而存在， 例如连接特定化合物的两 个取代的芳环的中央键。
在环上的取代基可以以顺式或反式形式存在。所有这样的构型 ( 包括对映体和非 对映体 ) 都包括在本发明范围内。
优选的化合物是产生更期望生物活性的化合物。本发明化合物的单独的、 纯或部 分纯的异构体和立体异构体或外消旋或非对映体混合物也包括在本发明范围内。 这样的材 料的纯化和分离可以通过本领域已知的标准技术来完成。
旋光异构体可以通过以下方法获得 ： 根据常规方法， 例如通过使用旋光性酸或碱 形成非对映体盐或者形成共价的非对映体来拆分外消旋混合物。合适的酸的实例有酒石 酸、 二乙酰基酒石酸、 二甲苯甲酰基酒石酸和樟脑磺酸。可以基于其物理和 / 或化学差异， 通过本领域已知方法， 例如通过色谱法或分步结晶， 将非对映体的混合物分离成其单独的 非对映体。然后将旋光性碱或酸从分离的非对映体盐上释放下来。分离旋光异构体的不同 方法包括使用手性色谱 ( 例如手性 HPLC 柱 )， 进行或不进行常规衍生化， 作出最佳选择以将对映体的分离最大化。合适的手性 HPLC 柱是通过 Diacel， 例如 Chiracel OD 和 Chiracel OJ 等制备的， 所有都是可例行选择的。进行或不进行衍生化的酶法分离也是有用的。本发 明的旋光性化合物也可以通过使用旋光性原料进行手性合成来获得。
为了将不同类型异构体彼此限定， 请参见 IUPAC Rules Section E (Pure Appl Chem 45, 11-30, 1976)。
本发明包括本发明化合物的所有可能的立体异构体， 所述立体异构体层单一立体 异构体形式， 或者所述立体异构体的任何比例的混合物。本发明化合物的单独立体异构体 例如单独的对映体或单独的非对映体的分离可以通过任何适当状态的现有技术方法， 例如 色谱法， 尤其是手性色谱法来完成。
此外， 本发明化合物可以作为互变异构体存在。 例如， 含有吡唑基作为杂芳基的任 何本发明化合物都可以例如作为 1H- 互变异构体或 2H- 互变异构体或甚至任何量的这两种 互变异构体的混合物存在， 或含有三唑基的任何本发明化合物都可以例如作为 1H- 互变异 构体， 2H- 互变异构体或 4H- 互变异构体或甚至任何量的所述 1H、 2H 和 4H- 互变异构体的混 合物存在， 即：1H- 互变异构体 2H- 互变异构体 4H- 互变异构 体。
本发明包括本发明化合物的所有可能的互变异构体， 所述互变异构体以单独的互 变异构体或任何比例的所述互变异构体的任何混合物的形式存在。
此外， 本发明化合物可以作为 N- 氧化物存在， N- 氧化物定义为本发明化合物的至 少一个氮被氧化。本发明包括所有这样的可能 N- 氧化物。
本发明还包括本文所公开的化合物的有用形式， 例如代谢物， 水合物， 溶剂化物， 前药， 盐， 特别是可药用盐， 以及共沉淀。
本发明化合物可以作为水合物或溶剂化物存在， 其中本发明化合物含有极性溶 剂， 特别是例如水、 甲醇或乙醇作为化合物晶格的结构成分。极性溶剂， 特别是水的量可以 以化学计量或非化学计量比例存在。对于化学计量的溶剂化物例如水合物， 分别的半 -、 ( 半 -)、 一 -、 倍半 -、 二 -、 三 -、 四 -、 五 - 等溶剂化物或水合物是可能的。本发明包括所有 这样的水合物或溶剂化物。
此外， 本发明化合物可以以游离形式， 例如作为游离碱或作为游离酸或作为两性 离子存在， 或者可以以盐形式存在。所述盐可以是任何盐， 有机或无机加成盐， 特别是制药 业中常用的任何可药用有机或无机加成盐。
术语 “可药用盐” 是指本发明化合物的相对没有毒性的无机酸或有机酸加成盐。 例如， 参见 S. M. Berge, 等人 , “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19。
本发明化合物的合适的可药用盐可以是例如在链中或者环中携带例如具有足够 碱性的氮原子的本发明化合物的酸加成盐， 例如与无机酸形成的酸加成盐， 所述无机酸是例如盐酸、 氢溴酸、 氢碘酸、 硫酸、 bisulfuric acid、 磷酸或硝酸， 或者例如与有机酸形成的 酸加成盐， 所述有机酸是例如甲酸、 乙酸、 乙酰乙酸、 丙酮酸、 三氟乙酸、 丙酸、 丁酸、 己酸、 庚 酸、 十一烷酸、 月桂酸、 苯甲酸、 水杨酸、 2-(4- 羟基苯甲酰基 )- 苯甲酸、 樟脑酸、 肉桂酸、 环 戊烷丙酸、 二葡糖酸、 3- 羟基 -2- 萘甲酸、 烟酸、 双羟萘酸、 果胶酸、 过硫酸、 3- 苯基丙酸、 苦 味酸、 新戊酸、 2- 羟基乙烷磺酸、 衣康酸、 氨基磺酸、 三氟甲烷磺酸、 十二烷基硫酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 对甲苯磺酸、 甲磺酸、 2- 萘磺酸、 萘二磺酸、 樟脑磺酸、 柠檬酸、 酒石酸、 硬脂酸、 乳 酸、 草酸、 丙二酸、 琥珀酸、 苹果酸、 己二酸、 藻酸、 马来酸、 富马酸、 D- 葡糖酸、 扁桃酸、 抗坏血 酸、 葡庚糖酸、 甘油磷酸、 天冬氨酸、 磺基水杨酸、 半硫酸或硫氰酸。
此外， 具有足够酸性的本发明化合物的另一合适的可药用盐是碱金属盐， 例如钠 盐或钾盐， 碱土金属盐， 例如钙盐或镁盐， 铵盐或者与提供生理可接受阳离子的有机碱形成 的盐， 例如与以下碱形成的盐 ： N- 甲基 - 葡糖胺、 二甲基 - 葡糖胺、 乙基 - 葡糖胺、 赖氨酸、 二环己基胺、 1,6- 己二胺、 乙醇胺、 葡糖胺、 肌氨酸、 丝氨醇、 tris- 羟基 - 甲基 - 氨基甲烷、 氨基二丙醇、 sovak- 碱、 1- 氨基 -2,3,4- 丁三醇。此外， 含有碱性氮的基团可以用试剂季铵 化， 所述试剂是例如低级烷基卤化物例如甲基、 乙基、 丙基和丁基氯化物、 溴化物和碘化物 ； 硫酸二烷基酯， 例如硫酸二甲酯、 二乙酯和二丁酯 ； 和硫酸二戊酯， 长链卤化物例如癸基、 月 桂基、 十四烷基和硬脂基氯化物、 溴化物和碘化物， 芳烷基卤化物例如苄基和苯乙基溴化物 等。
本领域技术人员将进一步认识到， 本发明化合物的酸加成盐可以通过将本发明化 合物与合适的无机酸或有机酸经由任何多种已知方法进行反应来制得。或者， 本发明酸性 化合物的碱金属和碱土金属盐是通过将本发明化合物与合适的碱经由多种已知方法进行 反应而制得的。
本发明包括本发明化合物的所有可能的盐， 所述盐以单独盐或者任何比例的盐混 合物的形式存在。
应当理解， 本文所用术语 “体内可水解的酯” 是指含有羧基或羟基的本发明化合物 的体内可水解的酯， 例如在人体或动物体内水解以生成母酸或醇的可药用酯。 对于羧基， 合 适的可药用酯包括例如烷基、 环烷基和任选取代的苯基烷基， 特别是苄基酯， C1-C6 烷氧基甲 基酯， 例如甲氧基甲基、 C1-C6 链烷酰氧基甲基酯， 例如新戊酰氧基甲基、 2- 苯并 [c] 呋喃酮 亚基 (phthalidyl) 酯， C3-C8 环烷氧基 - 羰基氧基 -C1-C6 烷基酯， 例如 1- 环己基羰基氧基 乙基 ； 1,3- 二氧杂环戊烯 -2- 酮基甲基酯， 例如 5- 甲基 -1,3- 二氧杂环戊烯 -2- 酮基甲基 酯； 和 C1-C6- 烷氧基羰基氧基乙基酯， 例如 1- 甲氧基羰基氧基乙基酯， 并且可以在本发明化 合物中的任何羧基上形成。
含有羟基的本发明化合物的体内可水解的酯包括无机酯例如磷酸酯和 [α]- 酰 氧基烷基醚以及作为该酯裂解的体内水解以生成母羟基的结果的相关化合物 [α]- 酰氧 基烷基醚的实例包括乙酰氧基甲氧基和 2,2- 二甲基丙酰氧基甲氧基。对于羟基， 体内可 水解的酯形成基团的选择包括链烷酰基、 苯甲酰基和苯基乙酰基以及取代的苯甲酰基和 苯基乙酰基、 烷氧基羰基 ( 以生成烷基碳酸酯 )、 二烷基氨基甲酰基和 N-( 二烷基氨基乙 基 )-N- 烷基氨基甲酰基 ( 以生成氨基甲酸酯 )， 二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。本发明 包括所有这样的酯。
此外， 本发明包括本发明化合物的所有可能的晶形或多晶型物， 作为单独的多晶型物或者作为任何比例的一种以上多晶型物的混合物存在。
根据第二个方面， 本发明包括上述通式 (I) 化合物， 其中 R1 是氢原子或氟原子 ； R2 是氟原子或 C2- 炔基 ； R3 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基或 -C3-C6- 环烷基 ； R4 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基或 -C3-C6- 环烷基 ； R5 是氟原子或甲基 ； A 是 –(CH2)n-， 其中 n = 0 或 1 ； 或其互变异构体、 立体异构体、 N- 氧化物、 盐、 水合物、 溶剂化物、 代谢物或前药。
根据第三个方面， 本发明包括上述通式 (I) 化合物， 其中 ： R1 是氢原子或氟原子 ； R2 是氟原子或 C2- 炔基 ； R3 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基或 -C3-C6- 环烷基 ； R4 是 –NH2、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基或环丙基或环丁基 ； R5 是氟原子或甲基 ； A 是 –(CH2)n-， 其中 n = 0 或 1 ； 或其互变异构体、 立体异构体、 N- 氧化物、 盐、 水合物、 溶剂化物、 代谢物或前药。
根据第四个方面， 本发明包括上述通式 (I) 化合物， 其中 ： R1 是氢原子或氟原子 ； R2 是氟原子或 C2- 炔基 ； R3 是 –NH2、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 环丙基或环丁基 ； R4 是 –NH2、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 环丙基或环丁基 ； ; R5 是氟原子或甲基 ； A 是 –(CH2)n-， 其中 n = 0 或 1 ； 或其互变异构体、 立体异构体、 N- 氧化物、 盐、 水合物、 溶剂化物、 代谢物或前药。
在上述方面的一个进一步实施方案中， 本发明涉及式 (I) 化合物， 其中 R1 是氢原 子或氟原子。
在上述方面的一个进一步实施方案中， 本发明涉及式 (I) 化合物， 其中 R2 是卤素 原子或 C2- 炔基。
在 上 述 方 面 的 一 个 进 一 步 实 施 方 案 中， 本 发 明 涉 及 式 (I) 化 合 物， 其 中 R3 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基或 -C3-C6- 环烷基。
在 上 述 方 面 的 一 个 进 一 步 实 施 方 案 中， 本 发 明 涉 及 式 (I) 化 合 物， 其 中 R4 是 –NH2、 -NH(C1-C6- 烷基 )、 -N(C1-C6- 烷基 )2、 -C1-C6- 烷基或 -C3-C6- 环烷基。
在上述方面的一个进一步实施方案中， 本发明涉及式 (I) 化合物， 其中 R5 是卤素 原子或 -C1-C6- 烷基或 –O-C1-C6- 烷基。
在 上 述 方 面 的 一 个 进 一 步 实 施 方 案 中， 本 发 明 涉 及 式 (I) 化 合 物， 其中 A 是 –(CH2)n-， 其中 n = 0。
在 上 述 方 面 的 一 个 进 一 步 实 施 方 案 中， 本 发 明 涉 及 式 (I) 化 合 物， 其中 A 是 –(CH2)n-， 其中 n = 1。在上述方面的一个进一步实施方案中， 本发明涉及式 (I) 化合物， 其中 R5 是氟原 子或甲基。
在 上 述 方 面 的 一 个 进 一 步 实 施 方 案 中， 本 发 明 涉 及 式 (I) 化 合 物， 其 中 R4 是 –NH2、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 环丙基或环丁基。
在 上 述 方 面 的 一 个 进 一 步 实 施 方 案 中， 本 发 明 涉 及 式 (I) 化 合 物， 其 中 R3 是 –NH2、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 环丙基或环丁基。
应当理解， 本发明涉及在上述通式 (I) 化合物的任何本发明实施方案内的任何亚 组合。
在另一个方面， 本发明包括在下文实施例部分中公开的通式 (I) 化合物。
根据另一方面， 本发明包括制备本发明化合物的方法， 所述方法北京本文中描述 的步骤。
根据另一方面， 本发明包括用于制备通式 (I) 的本发明化合物， 特别是用于本文 所述方法的中间体化合物。特别是， 本发明包括通式 (4) 化合物 ：其中 R1、 R2、 R4、 R5 和 A 如上文关于通式 (I) 中所定义， 和通式 (8) 化合物 ：其中 R1、 R2、 R3、 R5 和 A 如上文关于通式 (I) 中所定义， 和通式 (12) 化合物 ：其中 R1、 R2、 R3、 R5 和 A 如上文关于通式 (I) 中所定义， 并且 PG 代表对酸不稳定的保护基。 根据另一个方面， 本发明涉及上述通式 (4) 中间体化合物或上述通式 (8) 中间体 化合物或上述通式 (12) 中间体化合物在制备上述通式 (I) 化合物中的应用。
实验详述和一般方法 缩写和首字母缩写 ACS Style Guide ( 第 三 版 ) 或 Guidelines for Authors for the Journal of Organic Chemistry 中列出了有机化学领域技术人员使用的缩写的综合列表。本文将所述 列表中包括的缩写以及有机化学领域技术人员使用的所有缩写都引入本文以供参考。 对于 本发明目的， 化学元素是根据 Periodic Table of the Elements, CAS 版 , Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87 来确定的。
更具体来说， 当在本文中使用下列缩写时， 这些缩写具有以下含义 ： Ac2O 乙酸酐 CAN 乙腈 AcO( 或 OAc) 乙酸酯 Anhyd 无水 Aq 水的 Ar 芳基 Atm 大气 ATP 三磷酸腺苷 b.i.d. 一天两次 Biotage 硅胶柱色谱系统， Biotage Inc. Bn 苄基 Bp 沸点 Bz 苯甲酰基 BOC 叔丁氧基羰基 n-BuOH 正丁醇 t-BuOH 叔丁醇 t-BuOK 叔丁醇钾 calcd 计算的 CDI 羰基二咪唑 CD3OD 甲醇 -d 4 ® Celite 硅藻土过滤剂， Celite Corp. CI-MS 化学电离质谱 13 CNMR 碳酸 -13 核磁共振 Conc 浓缩的 DCC 二环己基碳二亚胺 DCE 二氯乙烷 DCM 二氯甲烷 dec 分解
DIBAL DMAP DME DMF DMSO DTT E e.g. EI ELSD Eq ERK ESI ES-MS etal. EtOAc EtOH EtSH Et2O Et3N GC GC-MS H 1 HNMR HCl HEPES Hex HMPA HMPT HPLC IC50 i.e. insol IPA IR J LAH LC LC-MS二异丁基氢氧化铝 4-(N,N - 二甲基氨基 ) 吡啶 1,2- 二甲氧基乙烷 N,N - 二甲基甲酰胺 二甲亚砜 二硫苏糖醇 entgegen ( 构型 ) 例如 电子轰击 蒸发光散射检测器 当量 细胞外信号调控激酶 电喷雾离子化 电喷雾质谱 等人 乙酸乙酯 乙醇 (100%) 乙硫醇 乙醚 三乙胺 气相色谱 气相色谱 - 质谱 小时 质子核磁共振 盐酸 4-(2- 羟基乙基 )-1- 哌嗪乙烷磺酸 己烷 六甲基磷酰胺 六甲基磷酰三胺 高效液相色谱 50% 抑制所需的药物浓度 即 不溶的 异丙基胺 红外 偶合常数 (NMR 光谱 ) 氢化锂铝 液相色谱 液相色谱 - 质谱LDA MAPK MeCN MEK MHz min μL mL μM mp MS Msm/zNBS nM NMM Obsd p PBS pp PdCl2dppf Pd(OAc)2 pH pK pKa PS-DIEA q qt Rf RT rt TBAF TBST TEA THF TFA TFFH TLC TMAD二异丙基氨基锂 促分裂原活化蛋白激酶 乙腈 MAPK/ERK 激酶 兆赫 分钟 微升 毫升 微摩尔 熔点 质谱 甲磺酰基 质荷比 N - 溴琥珀酰亚胺 纳摩尔 4- 甲基吗啉 实测的 页 磷酸盐缓冲盐水 页 [1,1’ - 二 ( 二苯基膦基 ) 二茂铁 ] 二氯化钯 (II) 乙酸钯 氢离子浓度的负对数 平衡常数的负对数 对于解离， 平衡常数的负对数 聚苯乙烯结合的二异丙基乙胺 四重峰 (nmr) 五重峰 (nmr) 保留因子 (TLC) 保留时间 (HPLC) 室温 氟化四正丁基铵 含有 tween 的 tris 缓冲盐水 三乙胺 四氢呋喃 三氟乙酸 六氟磷酸氟 -N,N,N’ ,N ’ - 四甲基甲脒 薄层色谱 N,N,N’ ,N’- 四甲基乙二胺TMSCl 三甲基甲硅烷基氯 Ts p- 甲苯磺酰基 v/v 体积体积比 w/v 重量体积比 w/w 重量重量比 Z Zusammen ( 构型 )
一般方法 在下面的段落中， 详细描述了用于合成本发明的关键中间体和化合物的一般方法。
下面描述的反应方案和方法举例说明了本发明通式 (I) 化合物的一般合成途径， 但不是限制性的。对于本领域技术人员来说显而易见的所， 在这些反应方案中举例说明的 转化顺序可以以多种不同方式进行调整。因此， 在这些反应方案中举例说明的转化顺序不 是限制性的。此外， 任何取代基 R1、 R2、 R3、 R4 或 R5 的相互转化可以在举例说明的转化之前 和 / 之后来实现。这些修饰可以是引入保护基、 裂解保护基、 官能团的还原或氧化、 卤化、 金 属化、 取代或本领域技术人员已知的其他反应。这些转化包括引入容许取代基的进一步转 化的官能团的那些转化。合适的保护基及其引入和裂解是本领域技术人员众所周知的 ( 参 见例如 T.W. Greene 和 P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis , 3rd edition, Wiley 1999)。下面的段落中描述了具体实例。
反应方案 1 中描述了制备通式 (I) 化合物的一般途径。
反应方案 1反应方案 1 制备通式 (I) 化合物的一般途径， 其中 R1、 R 2、 R 3、 R4、 R5 和 A 具有上文关于通式 (I) 所给出的含义。化合物 G、 B、 C、 D 和 E 可商购获得。
将通式 (G) 所示适当取代的 1,3,5- 三氟 -2- 硝基苯与通式 (B) 所示适当取代 的 2- 氟 - 苯胺在合适的溶剂系统例如 THF 中， 在合适的碱例如六甲基二硅基氨基锂存在 下， 于 -78℃至室温， 优选室温的温度下反应， 以获得通式 (1) 所示 3,5- 二氟 -N-(2- 氟苯 基 )-2- 硝基苯胺中间体。
然后通过以下方法将通式 (1) 的中间体转化成通式 (2) 的中间体 ： 与通式 (C) 所 示适当取代的苯酚， 例如 3- 氨基苯酚在合适的溶剂系统例如 DMF 中， 于合适的碱例如碳酸 钾存在下， 在室温至各自的溶剂沸点的温度下反应。
将通式 (2) 的中间体与合适的通式 (D) 的磺酰氯， 例如乙磺酰氯， 在也起溶剂功能 的合适的碱例如吡啶存在下， 任选在合适的溶剂例如二氯甲烷中， 于 0℃至室温的温度下反 应， 以获得通式 (3) 的中间体。
然后通过以下方法将通式 (3) 的中间体转化成通式 (4) 的中间体 ： 与合适的还原 剂， 例如连二亚硫酸钠， 在合适的溶剂例如 THF/ 水混合物中， 于室温至溶剂沸点的温度下 反应。用于还原硝基的另外的试剂和条件是本领域已知的。
然后通过以下方法将通式 (4) 的中间体转化成通式 (I) 化合物 ： 与合适的通式 (E) 的磺酰氯， 例如环丙烷磺酰氯， 在也起溶剂功能的合适的碱例如吡啶存在下， 任选在合 适的溶剂例如二氯甲烷中， 于 0℃至室温的温度下反应。
或者， 通式 (I) 化合物可以根据反应方案 2 中描述的方法来合成。化合物 D、 E哥 H 是商购获得的或者如下面的具体实验描述中所述制备的。
反应方案 2反应方案 2 制备通式 (I) 化合物的另一一般途径， 其中 R1、 R 2、 R 3、 R4、 R5 和 A 具有上文关于通式 (I) 所给出的含义。PG 代表 “合适的保护基” ， 例如叔丁氧基羰基 (Boc)。
通过以下方法将通式 (1) 的中间体转化成通式 (5) 的中间体 ： 与通式 (H) 所示适 当保护的取代的苯酚， 例如 (3- 羟基苯基 ) 氨基甲酸叔丁酯在合适的溶剂系统例如 DMF 中， 于合适的碱例如碳酸铯存在下， 在室温至各自的溶剂沸点的温度下反应。
然后通过以下方法将通式 (5) 的中间体转化成通式 (6) 的中间体 ： 与合适的还原 剂， 例如连二亚硫酸钠， 在合适的溶剂例如 THF 中， 于室温至溶剂沸点的温度下反应。
然后通过以下方法将通式 (6) 的中间体转化成通式 (7) 的中间体 ： 与合适的通式 (E) 的磺酰氯， 例如环丙烷磺酰氯， 在合适的碱例如吡啶存在下， 在合适的溶剂例如吡啶中， 于 0℃至室温的温度下反应。
通过以下方法将通式 (7) 的中间体转化成通式 (8) 的中间体 ： 利用本领域技术人 员已知的方法将保护基裂解掉， 例如在合适的酸例如 TFA 存在下， 在合适的溶剂例如 DCM中， 于室温至溶剂沸点的温度下将叔丁氧基羰基 (Boc) 裂解。
然后将通式 (8) 的中间体与合适的通式 (D) 的磺酰氯， 例如异丙基磺酰氯， 在合适 的碱例如吡啶存在下， 在合适的溶剂例如吡啶中， 于 0℃至室温的温度下反应， 以生成通式 （I） 化合物。
或者， 通式 (Ic) 的化合物可以根据反应方案 3 中描述的方法来合成。化合物 E 和 J 可商购获得。
反应方案 3反应方案 3. 制备通式 (Ic) 化合物的一般途径， 其中 R1、 R2、 R3、 R5 和 A 具有上文关于通式 (I) 所给出的含义。PG 代表 “合适的保护基” ， 例如叔丁氧基羰基 (Boc)。
通过以下方法将通式 (J) 所示适当取代的苯酚转化成通式 (9) 所示相应的叔丁 氧基羰基 (BOC) 保护的氨基磺酰基衍生物 ： 同样氯磺酰基异氰酸酯和叔丁醇在合适的碱例 如三乙胺存在下， 于 0℃至室温的温度下， 优选在室温反应 [ 参见例如 Tetrahedron 1993, 49, 65-76]。通过以下方法将通式 (9) 的中间体转化成通式 (10) 的中间体 ： 与通式 (1) 的中间 体， 在合适的溶剂系统例如 DMF 中， 于合适的碱例如碳酸铯存在下， 在室温至各自的溶剂沸 点的温度下反应。
然后通过以下方法将通式 (10) 的中间体转化成通式 (11) 的中间体 ： 与合适的还 原剂， 例如连二亚硫酸钠， 在合适的溶剂例如 THF 中， 于室温至溶剂沸点的温度下反应。
然后通过以下方法将通式 (11) 的中间体转化成通式 (12) 的中间体 ： 与合适的通 式 (E) 的磺酰氯， 例如环丙烷磺酰氯， 在合适的碱例如吡啶存在下， 在合适的溶剂例如吡啶 中， 于 0℃至室温的温度下反应。
通过以下方法将通式 (12) 的中间体转化成通式 (Ic) 化合物 ： 利用本领域技术人 员已知的方法将保护基裂解掉， 例如在合适的酸例如 TFA 存在下， 在合适的溶剂例如 DCM 中， 于室温至溶剂沸点的温度下将叔丁氧基羰基 (Boc) 裂解。
可以根据反应方案 4 中描述的方法将通式 (Ia) 转化成通式 (Ib) 化合物。
反应方案 4反应方案 4. 将通式 (Ia) 化合物转化成通式 (Ib) 化合物的一般方法， 其中 R1、 R3、 R4、R5 和 A 具有上文关于通式 (I) 所给出的含义。
通 过 本 领 域 技 术 人 员 已 知 的 偶 联 反 应， 优选通过使用乙炔或乙炔等同物的 Sonogashira 或 Sonogashira- 型偶联反应 ( 见下页 )， 将通式 (Ia) 化合物转化成通式 (Ib) 化合物。
可以将含有碘或溴的中间体， 例如通式 (Ia) 的中间体与乙炔在催化量的 Pd 催化 剂例如 PdCl2(PPh3)2， 催化量的碘化铜存在下， 在溶剂例如 DMF 中， 并且任选在碱例如三烷 基胺碱存在下反应， 以形成相应的炔衍生物 (Ib)。或者， 可以将单 - 三烷基甲硅烷基 - 保 护的乙炔例如三甲基甲硅烷基 (TMS) 乙炔用于上述条件下的 Sonogashira- 型偶联反应， 然 后通过用例如氟化四丁基铵或碳酸钾在甲醇中处理来裂解三烷基甲硅烷基。或者， 通过在 Sonogashira- 型偶联中使用氟化四丁基铵作为碱， TMS 乙炔的偶联和 TMS- 基团的裂解可以 在一罐式转化中完成。( 杂 ) 芳基卤化物与炔以及三烷基甲硅烷基的过渡金属催化的偶联 是本领域技术人员众所周知的 ( 参见例如 (a) Chinchilla, R.; Najera, C. Chem. Rev. 2007, 107 , 874; (b) Negishi, E.-i., Anastasia, L. Chem. Rev. 2003, 103 , 1979; 还参见 : (c) Eur. J. Org. Chem. 2005, 20 , 4256; (d) J. Org. Chem. 2006, 71 , 2535 和其中引用的参考文献 ; (e) Chem. Commun. 2004, 17 , 1934)。科学文献中已经出版了 各种钯催化剂 / 助催化剂 / 配体 / 溶剂组合， 这使得能够精细地调整所需反应条件以在两 个偶联成分上容许宽的另外的官能团设置 ( 参见上面引用的综述 )。 此外， 最近开发的采用 例如乙炔化锌、 炔基镁盐或炔基三氟硼酸盐的方法进一步拓宽了该方法的范围。
具体实验描述在下面的具体实验描述中的 NMR 峰形式是以它们在光谱中出现的方式陈述的， 没有考 虑可能的高级效应。 化合物的名称是使用 ACD/Name Batch version 12.00 命名的。 在某些 情况下， 使用市售试剂的通常所接受的名称。采用微波辐射的反应可以用任选装配有机器 人装置的 Biotage Initator® 微波炉来进行。 应当理解， 所报道的采用微波加热的反应时间 是在达到指定的反应温度之后的固定反应时间。 根据本发明方法制备的化合物和中间体可 能需要纯化。 有机化合物的纯化是本领域技术人员众所周知的， 并且对于同一化合物， 可能 有几种纯化方法。在某些情况下， 可能不需要纯化。在某些情况下， 可以通过结晶来纯化化 合物。在某些情况下， 可以使用合适的溶剂将杂质搅出。在某些情况下， 可以使用色谱法， 特别是快速色谱法来纯化化合物， 所述色谱使用例如预填充的硅胶筒， 例如得自 Separtis， 例如 Isolute® Flash 硅胶或 Isolute® Flash NH2 硅胶， 联合使用 Flashmaster II 自动纯 化器 (Argonaut/Biotage)， 以及洗脱剂例如己烷 / 乙酸乙酯或 DCM/ 乙醇梯度。在某些情 况下， 可以通过制备 HPLC 来纯化化合物， 使用例如装配有二极管阵列检测器和 / 或在线电 喷雾电离质谱仪的 Waters 自动纯化器， 联合使用合适的预填充的反相柱， 和洗脱剂例如可 含有添加剂例如三氟乙酸或氨水的水和乙腈的梯度洗脱剂。在某些情况下， 上述纯化方法 可以提供盐形式的具有足够碱性或酸性官能团的本发明化合物， 例如， 对于具有足够碱性 的本发明化合物， 三氟乙酸盐或甲酸盐形式， 或者， 对于具有足够酸性的本发明化合物， 铵 盐形式。 这类盐可以通过本领域技术人员已知的各自方法分别转化成其游离碱或游离酸形 式， 或者可以以盐的形式用于随后的生物试验。 应当理解， 如本文所述分离的本发明化合物 的特定形式 ( 例如盐、 游离碱等 ) 不是所述化合物用于生物试验以定量确定生物活性所必 须的唯一形式。
在下面的实施例中报道的百分比收率是基于以最小摩尔量使用的原料组分而计 的。气体和水分敏感性液体和溶液是经由注射器或套管来转移的， 并且经由橡胶隔片引入 到反应容器内。商业级的试剂和溶剂不用进一步纯化而直接使用。术语 “减压浓缩” 是指 在大约 15 mm Hg 的最小压力下使用 Buchi 旋转蒸发仪。所有温度都是以为校正的摄氏度 (℃ ) 报道的。
为了更好地理解本发明， 给出下列实施例。 这些实施例仅是为了举例说明， 而不应 理解为以任何方式限制本发明范围。本文中提及的所有出版物都全文引入本文以供参考。
在下面的段落中， 详细描述用于合成本发明关键中间体和化合物的一般方法。
一般方法 1 (GP 1) ： 磺酰胺形成 可 1 当量各自的胺溶解在吡啶 ( 约 4 mL/mmol 胺 ) 用 1.2-2 当量各自的磺酰氯处理。 将该反应混合物在室温搅拌直至 LCMS 分析表明原料消耗完全。任选再加入等分试样的各 自的磺酰氯以使得转化完全。将该反应混合物用水处理， 并且用二氯甲烷萃取几次。将合 并的有机层用盐水洗涤， 过滤并真空浓缩， 获得了粗的目标化合物。通过制备 HPLC 纯化或 快速柱色谱纯化， 获得了各自的目标化合物。
分析 LCMS 条件 A ： 在下面的具体实验描述中给出的 LCMS- 数据是指 ( 除非另有指名 ) 下列条件 ：制备 HPLC 条件 B ： 在下面的具体实验描述中给出的 “通过制备 HPLC 纯化” 是指 ( 除非另有指名 ) 下列条 件：
分析 ：系统 ： WatersAqcuityUPLC-MS ： BinarySolventManager,SampleManager/Organizer,ColumnManager,PDA,ELSD,SQD3001 柱 ： AqcuityBEHC181.750×2.1mm 溶剂 ： A=H2O+0.1%HCOOHB= 乙腈梯度 ： 0-1.6min1-99%B,1.6-2.0min99%B 流速 ： 0.8mL/min 温度 ： 60℃ 注射 ： 2.0µl 检测 ： DAD 扫描范围 210-400nmMSESI+,ESI-, 扫描范围 160-1000m/z ELSD
制备 ：
手性 HPLC 条件 C ： 在下面的具体实验描述中给出的手性 HPLC- 数据是指下列条件 ：分析 ：系统 ： 柱： 溶剂 ： 流速 ： 温度 ： 溶液 ： 注射 ： 检测 ：
Dionex ： Pump680,ASI100,Waters ： UV-Detektor2487 ChiralpakIC5µm150×4.6mm 己烷 / 乙醇 80:20+0.1% 二乙胺 1.0mL/min 25℃ 1.0mg/mLEtOH/MeOH1:1 5.0µl UV280nm制备 ：Agilent ： Prep1200,2×PrepPump,DLA,MWD,PrepFC,ESA ： Corona ChiralpakIC5µm250x30mm 己烷 / 乙醇 80:20+0.1% 二乙胺 40mL/min RT 660mg/5.6mL 乙醇 8×0.7mL UV280nm系统 ： 柱： 溶剂 ： 流速 ： 温度 ： 溶液 ： 注射 ： 检测 ：
快速柱色谱条件 A 在下面的具体实验描述中给出的 “通 过 ( 快 速 ) 柱 色 谱 纯 化”是 指 使 用 Biotage Flashmaster II 或 Isolera (SP4) 纯化系统。关于技术说明书， 请参见 www.biotage.com 中的 “Biotage 产品目录” 。
确定旋光条件 旋光是在 DMSO 中， 于 589 nm 波长， 20℃， 1.0000 g/100ml 浓度， 10 s 积分时间 , 薄膜 厚度 100.00 mm 测定的。
合成中间体 中间体 1.A 制备 3,5- 二氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺将 25 g 1,3,5- 三氟 -2- 硝基苯 (141.2 mmol, 1 eq.) 和 33.5 g 2- 氟 -4- 碘苯胺 (141.2 mmol. 1 eq.) 溶解在 250 mL 无水 THF 中， 并且用冰 - 盐冷却至 -10 至 0℃， 然后 经由 1 小时缓慢地加入 424 mL 六甲基二硅基氨基锂 (LiHMDS) 溶液 (1M 在 THF 中的溶液 ; 424 mmol, 3. eq.)。碱的加入完成之后， 将该反应混合物温热至室温并且继续搅拌 5 天。 将该反应混合物用 0.5N 盐酸处理， 并且用乙酸乙酯稀释。加入饱和氯化铵溶液以促进相分 离。将分离的水相用乙酸乙酯再萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥， 过 滤并真空浓缩， 获得了暗色固体残余物。通过快速硅胶柱色谱纯化残余物， 用己烷和己烷 / 乙酸乙酯 8:2 作为洗脱剂， 获得了 45.8 克 (82% 收率 ) 分析纯目标化合物， 为浅褐色固体。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 8.86 (s, 1 H); 7.73 (dd, 1 H); 7.55 (dd,1 H); 7.13 (t, 1 H); 6.96 (ddd, 1 H); 6.40 – 6.44 (m, 1 H). LC-MS: 保留时间 : 1.5 min + MS ES : 392.9 [M-H]-。
中间体 2.A 制备 3-(3- 氨基苯氧基 )-5- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺将 18.4 g 3,5- 二氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 (46.9 mmol, 1. eq.)、 5.6 g 3- 氨基苯酚 (51.6 mmol. 1.1 eq.) 和 9.7 g 碳酸钾 (70.3 mmol, 1.5 eq.) 称量到圆底 烧瓶内。加入 300 mL 无水 DMF， 并且将所得浆液在室温搅拌 3 天。将该反应混合物通过加 入水来处理， 并且用乙酸乙酯稀释， 并且分离各相。将分离的水层用乙酸乙酯再萃取两次。 将合并的有机层用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥， 过滤并真空浓缩。 通过快速硅胶柱色谱纯化残 余物， 用纯己烷至己烷 / 乙酸乙酯 1:1 作为梯度洗脱剂， 获得了 11.6 g (51% 收率 ) 目标化 合物， 其含有少量的区域异构体 5-(3- 氨基苯氧基 )-3- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基 苯胺。通常， 该区域异构体混合物经过随后的转化而被除去， 并且在最终的转化之后， 通过 制备 HPLC 分离成纯的区域异构体实施例化合物 ( 参见下文 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 8.45 (s, 1 H); 7.68 (dd, 1 H); 7.52 (dd, 1 H); 7.07 (t, 1 H); 7.01 (t, 1 H); 6.38 (dd, 1 H); 6.26 – 6.31 (m, 1 H); 6.16 – 6.24 (m, 3 H); 5.34 (s, 2 H). LC-MS: 保留时间 : 1.56 min + MS ES : 484.20 [M+H]+。
中间体 3.A 制备 N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺将 11.7 g 3-(3- 氨基苯氧基 )-5- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 (24.3 mmol, 1. eq.; 含有少量区域异构体 5-(3- 氨基苯氧基 )-3- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯 胺 ) 溶解在 98 mL 吡啶中， 置于氮气氛下， 然后用 3.4 mL 乙磺酰氯 (36.4 mmol, 1.5 eq.; 溶解在吡啶中 ) 处理。将所得反应混合物在室温搅拌 20 小时， 之后 LCMC 分析表明转化完 全。将该反应混合物通过加入水来处理， 用乙酸乙酯稀释， 并且分离各相。将分离的水层用乙酸乙酯再萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥， 过滤并真空浓缩， 获得 了 14.8 g 粗的目标化合物 ( 含有少量区域异构体 N-(3-{3- 氟 -5-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨 基 ]-2- 硝基苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺 )， 其不用进一步纯化而直接用于随后的转化。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.97 (s, 1 H); 8.52 (s, 1 H); 7.70 (dd, 1 H); 7.52 (br. d, 1 H); 7.34 (t, 1 H); 7.10 (t, 1 H); 7.04 (dd, 1 H); 6.92 (s, 1 H); 6.79 (dd, 1 H); 6.34 – 6.39 (m, 2 H); 3.10 (q, 2 H); 1.15 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.49 min + MS ES : 576.01 [M+H]+。
中间体 4.A 制备 N-(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺将 14.8 g 粗 的 N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘 苯 基 ) 氨 基 ]-2- 硝 基 苯 氧 基 }- 苯 基 ) 乙 磺 酰 胺 ( 中 间 体 3.A) (25.9 mmol, 1. eq.; 含 有 少 量 区 域 异 构 体 N-(3-{3- 氟 -5-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺 ) 溶解在 560 mL THF 中， 加热至 50℃ ( 浴温度 )， 并且用 76 g 连二亚硫酸钠 (440 mmol, 17 eq.) 在 420 mL 水中的溶液于 30 分钟内处理。继续在 50℃浴温搅拌 150 分钟， LCMS 分析表明完 全转化。将该反应混合物冷却至室温， 真空除去 THF， 并且将残余物在饱和碳酸氢钠溶液与 乙酸乙酯之间分配。相分离后， 将分离的水层用乙酸乙酯再萃取两次。将合并的有机层用 盐水洗涤， 用硫酸钠干燥， 过滤并真空浓缩， 获得了粗的目标化合物。通过快速硅胶柱色谱 纯化， 用己烷 / 甲基 - 叔丁基醚作为梯度洗脱剂， 获得了 11.8 g 目标化合物 (21.6 mmol, 84 % 收率 )， 其含有少量区域异构体 N-(3-{2- 氨基 -3- 氟 -5-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.85 (br. s, 1 H); 7.52 (dd, 1 H); 7.42 (s, 1 H); 7.31 (br. d, 1 H); 7.25 (t, 1 H); 6.90 (dd, 1 H); 6.84 (t, 1 H); 6.55 – 6.65 (m, 3 H); 6.48 (dd, 1 H); 4.47 (s, 2 H); 3.07 (q, 2 H); 1.14 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.46 min + MS ES : 546.14 [M+H]+。
中间体 5.A 制备 3-(3- 氨基 -2- 甲基苯氧基 )-5- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺将 3.6 g 3,5- 二氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 ( 中间体 1A; 9.2 mmol, 1 eq.)、 1.1 g 3- 氨基 -2- 甲基苯酚 (9.2 mmol, 1 eq.) 和 4.5 g 碳酸铯 (13.8 mmol, 1.5 eq.) 悬浮在 35 mL DMF 中， 并且在室温搅拌 16 小时。 LCMS 分析表明完全转化。 将该反应混 合物用乙酸乙酯稀释， 用饱和氯化钠溶液处理， 分离各层， 并且将水层用乙酸乙酯萃取。将 合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱纯化粗产物 ( 正己烷 / 乙酸乙酯梯 度 )， 获得了 1.18 所需产物 (26% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 8.44 (s, 1 H); 7.69 (dd, 1 H); 7.52 (dd, 1 H); 7.08 (t, 1 H); 6.92 (t, 1 H); 6.53 (d, 1 H); 6.19 – 6.24 (m, 2 H); 5.84 (dd, 1 H); 5.17 (s, 2 H); 1.84 (s, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.67 min + MS ES : 497.8 [M+H]+。
中间体 6.A 制备 N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 }-2- 甲基苯基 ) 乙 磺酰胺将 1.18 g 3-(3- 氨基 -2- 甲基苯氧基 )-5- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 (2.3 mmol, 1 eq.) 溶解在 9.6 mL 吡啶中冷却至 0℃， 用 292 µL 乙磺酰氯 (3.1 mmol, 1.2 eq.) 处理， 并且在 0℃搅拌 3 小时。将该反应混合物用甲苯稀释， 并真空浓缩。将残余物在 水与乙酸乙酯之间分配。将水层用乙酸乙酯再萃取。将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓 缩， 获得了 1.6 g 粗产物， 将其置于甲苯内， 再次真空浓缩。粗产物不用进一步纯化直接用 于随后的转化。 H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.25 (br. s, 1 H); 8.51 (s, 1 H); 7.70 (dd, 1 H); 7.52 (dd, 1 H); 7.05 – 7.26 (3 H; 被残余甲苯遮掩 ); 6.95 (dd, 1 H); 6.26-6.31 (m, 1 H); 5.99 (dd, 1 H); 3.09 (q, 2 H); 2.12 (s, 3 H); 1.22 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.48 min 587.9 [M-H]-。 MS ES :
31中间体 7.A 制备 N-(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-2- 甲基苯基 ) 乙 磺酰胺将 1.6 g 粗的 N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 }-2- 甲基 苯基 )- 乙磺酰胺 (2.7 mmol, 1 eq.) 溶解在 40 mL THF/EtOH 1:1 中， 用 3.1 g 氯化亚锡 二水合物 (SnCl2 2H2O) (13.6 mmol, 5 eq.) 处理， 将所得混合物回流 16 小时。将该反应 混合物浓缩， 将残余物用 26% NH3 处理， 并且用 DCM 干燥。将合并的有机层用氯化铵溶液和 饱和氯化钠溶液洗涤， 干燥， 过滤并真空浓缩。通过纯化残余物快速柱色谱， 获得了 996 mg 目标化合物 (65 % 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.18 (br. s, 1 H); 7.51 (dd, 1 H); 7.40 (s, 1 H); 7.32 (br. d, 1 H); 7.15 (t, 1 H); 7.06 (d, 1 H); 6.68 (dd, 1 H); 6.61 (t, 1 H); 6.51 (dd, 1 H); 6.18 (dd, 1 H); 4.51 (s, 2 H); 3.07 (q, 2 H); 2.19 (s, 3 H); 1.23 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.47 min + MS ES : 560.14 [M+H]+。
中间体 8.A 制备 (3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 } 苯基 ) 氨基甲酸叔丁 酯将 3.0 g 3,5- 二氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 ( 中间体 1A; 70% 纯度 , 5.3 mmol, 1 eq.)、 1.1 g N-Boc-3- 氨基 - 苯酚 (5.3 mmol, 1 eq.) 和 3.4 g 碳酸铯 (10.7 mmol, 1.5 eq.) 悬浮在 30 mL DMF 中， 并且在室温搅拌 16 小时。LCMS 分析表明完全转化。 将该反应混合物在水与乙酸乙酯之间分配， 分离各层， 并且将水层用乙酸乙酯萃取。 将合并 的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱纯化粗产物 ( 正己烷 / 乙酸乙酯梯度 )，获得了 1.35 所需产物 (44% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.50 (s, 1 H); 8.48 (s, 1 H); 7.69 (dd, 1 H); 7.52 (dd, 1 H); 7.22 – 7.32 (m, 3 H); 7.09 (t, 1 H); 6.69 (dt, 1 H); 6.30 – 6.36 (m, 1 H); 6.26 (dd, 1 H); 1.43 (s, 9 H). LC-MS: 保留时间 : 1.68 min MS ES : 582.0 [M-H]-。
中间体 9.A 制备 (3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 } 苯基 ) 氨基甲酸叔 丁酯将 1.35 g of (3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 } 苯基 ) 氨基 甲酸叔丁酯 (2.3 mmol, 1 eq.) 溶解在 43 mL THF 中， 并且加热至 50℃， 然后加入 6.8 g 连 二亚硫酸钠 (39 mmol, 17 eq.) 在 35 mL 水中的溶液， 并且继续在该温度下搅拌 1 小时。 分 离各层， 并且将水层用乙酸乙酯萃取。 将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。 粗产物 (1.5 g) 不用进一步纯化而直接使用。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.39 (s, 1 H); 7.51 (dd, 1 H); 7.41 (s, 1 H); 7.31 (d, 1 H); 7.09 – 7.23 (m, 3 H); 6.52 – 6.62 (m, 3 H); 6.41 (dd, 1 H); 4.42 (s, 2 H); 1.42 (s, 9 H). LC-MS: 保留时间 : 1.62 min + MS ES : 553.9 [M+H]+。
中间体 10.A 制备 (3-{2-[( 环丙基磺酰基 ) 氨基 ]-5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 } 苯基 ) 氨基甲酸叔丁酯将 1.5 g 粗的 (3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 } 苯基 ) 氨 基甲酸叔丁酯 (2.7 mmol, 1 eq.) 溶解在 10 mL 吡啶和 457 mg 环丙基磺酰氯 (3.3 mmol, 1.2 eq.) 中， 并且继续在该温度下搅拌 16 小时。将该反应混合物用甲苯稀释并真空浓缩。 将残余物在 DCM 与水之间分配， 将水层用 DCM 再萃取。将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓 缩。通过快速柱色谱纯化粗产物， 获得了 1.19 g 目标化合物 (67% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.47 (s, 1 H); 9.11 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H); 7.57 (s, 1 H); 7.44 (d, 1 H); 7.23 – 7.31 (m, 3 H); 7.12 (t, 1 H); 6.68 – 6.73 (m, 1 H); 6.55 (dd, 1 H); 6.04 (dd, 1 H); 2.60 – 2.70 (m, 1 H); 1.42 (s, 9 H); 0.80 – 0.90 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.63 min MS ES : 655.9 [M-H]-。
中间体 11.A 制备 N-{2-(3- 氨基苯氧基 )-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯基 } 环丙烷磺酰 胺将 1.19 g (3-{2-[( 环丙基磺酰基 ) 氨基 ]-5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯 氧基 } 苯基 ) 氨基甲酸叔丁酯 (1.8 mmol, 1 eq.) 溶解在 15 mL DCM 中， 用 2 mL TFA 处理， 并且在室温搅拌 6 小时。 将该反应混合物冷却至 0℃， 并且用 1N 氢氧化钠调节至 pH 10。 分 离各层， 将水层用 DCM 再萃取。将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩， 获得了 776 mg 粗产 物 (77% 收率 )， 其不用进一步纯化而直接使用。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.08 (br. s, 1 H); 7.63 (dd, 1 H); 7.53 (s, 1 H); 7.44 (d, 1 H); 7.11 (t, 1 H); 7.02 (t, 1 H); 6.53 (dd, 1 H); 6.38 (dd, 1 H); 6.28 (t, 1 H); 6.22 (dd, 1 H); 6.03 (dd, 1 H); 5.29 (s, 2 H); 2.60 – 2.67 (m, 1 H); 0.81 – 0.91 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.46 min + MS ES : 557.8 [M+H]+。
中间体 12.A 制备 3-(3- 氨基 -4- 氟苯氧基 )-5- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 .将 1 g 3,5- 二氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 ( 中间体 1A; 2.537 mmol, 1 eq.)、 194 mg 3- 氨基 -4- 氟苯酚 (1.522 mmol, 0.6 eq.) 和 1.240 g 碳酸铯 (3.806 mmol, 1.5 eq.) 悬浮在 12 mL DMF 中， 并且在室温搅拌 72 小时。将该反应混合物在丁 -2- 酮与半 饱和盐水之间分配。分离各层， 并且将水层用乙基丁 -2- 酮再萃取两次。将合并的有机层 用盐水洗涤， 干燥， 过滤并真空浓缩 . 粗产物通过快速柱色谱纯化 ( 正己烷 / 乙酸乙酯梯 度 )， 获得了 450 mg 所需产物与其对位区域异构体的混合物， 该区域异构体以相同保留时 间被洗脱出来 (63% UV 纯度 )。该材料不用进一步纯化而直接使用。 LC-MS: 保留时间 : 1.54 min + MS ES : 502.39 [M+H]+。
中间体 13.A 制备 N-(2- 氟 -5-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 } 苯基 ) 硫二 酰胺 (sulfuric diamide)溶液 A ： 将 254 mg 氯磺酰基异氰酸酯 (1.797 mmol, 2 eq.) 溶解在 0.427 mL DCM 中， 将该混合物加热至 40℃， 然后用甲酸处理， 并且滴加 71 µL 甲酸 (1.887 mmol, 2.1 eq.) 和 1.3 µl DMA (0,014 mmol, 0.016 eq.)， 期间释放出气体。将该混合物加热回流 15 分钟。
将 450 mg 粗的 3-(3- 氨基 -4- 氟苯氧基 )-5- 氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝 基苯胺 (0.898 mmol, 1 eq.) 溶解在 3.5 mL DMA 中， 并且用 235 µL DIPEA (1.348 mmol, 1.5 eq.) 处理。冷却至 0℃之后， 滴加溶液 A， 并且将所得混合物在室温搅拌 18 小时。将该 反应混合物在水与乙醚之间分配， 并且将水层用乙醚再萃取两次。将合并的有机层用半饱 和盐水洗涤一次， 用盐水洗涤一次， 干燥， 过滤并真空浓缩， 获得了 597 mg 粗产物， 其含有目 标化合物与其对位区域异构体的混合物 (71% 邻位 , 11% 对位 )， 其不用进一步纯化直接用 于随后的转化。 LC-MS: 保留时间 : 1.40 min + MS ES : 581.27 [M+H]+。
中间体 14.A 制备 N-(5-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-2- 氟苯基 ) 硫二 酰胺将 597 mg 粗的 N-(2- 氟 -5-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 } 苯 基 ) 硫二酰胺 (1.028 mmol, 1 eq.) 溶解在 20 mL THF 中， 温热至 50℃， 经由 30 分钟滴加 3.044 g 连二亚硫酸钠 (17.484 mmol, 17 eq.) 在 16 ml 水中的溶液。将所得混合物在该 温度下搅拌 5 小时。冷却至室温后， 分离各相。分离出有机层， 真空浓缩， 并且再溶解在乙 酸乙酯中。将水层用饱和碳酸氢钠溶液稀释， 任何用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层 用半饱和盐水洗涤一次， 并且用饱和盐水洗涤一次， 干燥， 过滤并真空浓缩， 获得了 547 mg 粗产物， 其不用进一步纯化直接用于随后的转化。 LC-MS: 保留时间 : 1.34 min + MS ES : 551.41 [M+H]+。
中间体 15.A 制备 [(3- 羟基苄基 ) 氨基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯溶液 A ： 将 6,321 g 氯磺酰基异氰酸酯 (44,659 mmol, 1.1 eq.) 溶解在 60 ml 无水二 氯甲烷中。在室温加入叔丁醇在 30 ml 无水二氯甲烷中的溶液， 并且搅拌 5 分钟。
溶液 B ： 将 5 g 3-( 氨基甲基 ) 苯酚 (40,599 mmol, 1 eq.) 悬浮在 110 mL 无水 二氯甲烷中， 加入 6,791 ml 三乙胺 (48,719 mmol, 1.2 eq.)， 并且将该混合物冷却至 0℃， 然后滴加溶液 A。在室温继续搅拌 1 小时。
通过加入半浓缩的氯化铵溶液来中止该反应混合物的反应， 用二氯甲烷稀释， 并 且分离各相。 将分离的水相用二氯甲烷再萃取两次。 将合并的有机层用盐水洗涤， 用硫酸钠 干燥， 过滤并真空浓缩， 获得了粗产物。通过结晶纯化残余物， 获得了 6.469 克 (53% 收率 ) 目标化合物。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 10.79 (br. s, 1 H); 9.30 (s, 1 H); 8.04 (dd, 1 H); 7.05 (dd, 1 H); 6.72 – 6.65 (m, 2 H); 6.59 (dm, 1 H); 3.89 (d, 2 H); 1.37 (s, 9 H). LC-MS: 保留时间 : 0.88 min MS ES : 301.2 [M-H]-。
中间体 16.A 制备 [(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 } 苄基 ) 氨基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯将 2.0 g 3,5- 二氟 -N-(2- 氟 -4- 碘苯基 )-2- 硝基苯胺 ( 中间体 1A; 64% 纯度 , 3.25 mmol, 1 eq.)、 0.98 g [(3- 羟基苄基 ) 氨基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯 ( 中间体 2A; 3.24 mmol, 1 eq.) 和 1.6 g 碳酸铯 (4.9 mmol, 1.5 eq.) 悬浮在 25 mL DMF 中， 并且在封闭的 瓶中于室温搅拌 3 天。再加入 0.4 eq. [(3- 羟基苄基 ) 氨基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯和 0.4 eq. 碳酸铯， 并且继续搅拌 2 天。将该反应混合物在氯化钠溶液与乙醚之间分配， 分离 各层， 并且将水层用乙醚再萃取。将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩， 获得了 3.08 g 粗 产物 ( 为含有某些未反应的原料的区域异构体混合物 )， 其不用进一步纯化而直接用于随 后的反应。 LC-MS: 保留时间 : 1.55 min MS ES : 674.8 [M-H]-。
中间体 17.A 制备 [(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 } 苄基 ) 氨基磺酰 基 ] 氨基甲酸叔丁酯将 3.08 g [(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2- 硝基苯氧基 } 苄基 ) 氨基磺 酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯 (4.55 mmol, 1 eq.) 溶解在 88 mL THF 中， 并且加热至 50℃， 然后 加入 13.5 g 连二亚硫酸钠 (77.4 mmol, 17 eq.) 在 70 mL 水中的溶液， 并且继续在该温度 下搅拌 5 小时。分离各层， 并且将 THF 层真空浓缩。将残余物置于乙酸乙酯中， 用碳酸氢钠 溶液和氯化钠溶液洗涤， 干燥， 过滤并真空浓缩。将残余物通过快速柱色谱进一步纯化 ( 己烷至己烷 / 乙酸乙酯 1:1 梯度 )， 获得了 886 mg (30% 收率 ) 目标化合物 ( 为 2-3:1 区域 异构体混合物 )。 LC-MS: 保留时间 : 1.51 min + MS ES : 646.9 [M+H]+。
中间体 18.A 制备 [(3-{2-[( 环丙基磺酰基 ) 氨基 ]-5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 } 苄基 ) 氨基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯将 864 mg 粗的 [(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 } 苄基 ) 氨 基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯 (1.37 mmol, 1 eq.) 溶解在 13 mL 吡啶和 250 mg 环丙基磺酰 氯 (1.78 mmol, 1.3 eq.) 中， 并且继续在该温度下搅拌 16 小时。将该反应混合物用甲苯 稀释， 并真空浓缩。将残余物在乙酸乙酯与水之间分配， 将水层用乙酸乙酯再萃取。将合并 的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。将残余物通过快速柱色谱进一步纯化 ( 己烷至己烷 / 乙 酸乙酯 1:1 梯度 )， 获得了 814 mg 目标化合物 (70% UV- 纯度 )， 其用于随后的转化。 LC-MS: 保留时间 : 1.52 min MS ES : 748.8 [M-H]-。
实施例化合物 实施例 1 制备 N-(2-{3-[( 乙基磺酰基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯基 ) 环丙烷磺酰胺将 154 mg N-(3-{2- 氨 基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘 苯 基 ) 氨 基 ] 苯 氧 基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺 ( 中间体 4.A) (0.28 mmol, 1. eq.; 含有少量区域异构体 N-(3-{2- 氨 基 -3- 氟 -5-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺酰胺 ) 溶解在 1 mL 吡啶中， 并且用 79.4 mg 环丙烷磺酰氯 (0.565 mmol, 2 eq.) 处理。 将该反应混合物在室温搅拌 48 小时。将该反应混合物用水处理， 并且用二氯甲烷萃取几次。将合并的有机层用盐水洗涤， 过滤并真空浓缩， 获得了粗的目标化合物。通过制备 HPLC 纯化， 获得了 62 mg 分析纯的目 标化合物 (0.09 mmol, 32 % 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.92 (br. s, 1 H); 9.09 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H); 7.59 (br. s, 1 H); 7.45 (br. d, 1 H); 7.34 (t, 1 H); 7.12 (t, 1 H); 7.00 – 7.04 (m, 1 H); 6.96 (t, 1 H); 6.81 (dd, 1 H); 6.57 (dd, 1 H); 6.15 (dd, 1 H); 3.10 (q, 2 H); 2.63 – 2.71 (m, 1 H); 1.15 (t, 3 H); 0.82 – 0.88 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.51 min + MS ES : 650.17 [M+H]+。
下面的实施例化合物 2-5 是按照类似于制备实施例化合物 1 的方法， 通过在吡啶 存在下用各自的商购获得的磺酰氯处理 N-(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨 基 ] 苯氧基 }- 苯基 )- 乙磺酰胺 ( 中间体 4.A) 而制备的。
实施例 6 制备 N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧基 } 苯 基 ) 乙磺酰胺将 244 mg N-(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }- 苯基 ) 乙磺 酰胺 (0.448 mmol, 1 eq.) 溶解在 10 mL DCM 中， 用 0.781 mL DIPEA (4.5 mmol, 10 eq.) 和 388 mg 氨基磺酰氯 (3.36 mmol, 7.5 eq.) 处理， 并且将所得溶液在室温搅拌 4 天。将 该反应混合物在氯化铵溶液与 DCM 之间分配， 将水层用 DCM 再萃取， 将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱纯化， 获得了 97 mg 目标化合物 (35% 收率 )。将另一产 物级份通过薄层色谱进一步纯化 ( 己烷 / 乙酸乙酯 1:1 作为洗脱剂 )， 又获得了 67 mg 目 标化合物 (22% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.94 (br. s, 1 H); 8.58 (br. s, 1 H); 7.60 – 7.63 (m, 2 H); 7.46 (br. d, 1 H); 7.32 (t, 1 H); 7.14 (t, 1 H); 6.96 – 7.02 (m, 4 H); 6.82 (dd, 1 H); 6.48 (dd, 1 H); 6.01 (dd, 1 H); 3.10 (q, 2 H); 1.16 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.37 min + MS ES : 624.7 [M+H]+。
实施例 7 制备 N-(2-{3-[( 乙基磺酰基 ) 氨基 ]-2- 甲基苯氧基 }-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯基 ) 环丙烷磺酰胺将 185 mg N-(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-2- 甲基 苯基 ) 乙磺酰胺 (0.33 mmol, 1 eq.) 溶解在 3 mL 吡啶中， 用 49 mg 环丙基磺酰氯 (0.33 mmol, 1 eq.) 处理， 并且在室温搅拌 16 小时。再加入 15 mg 环丙基磺酰氯， 并且继续搅拌 4 小时。再加入 15 mg 环丙基磺酰氯， 并且继续搅拌过夜。将该反应混合物用水处理， 用甲 苯稀释并真空浓缩。 将残余物在水与乙酸乙酯之间分配， 将水层用乙酸乙酯再萃取， 将合并 的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。快速柱色谱， 获得了 150 mg 目标化合物 (64% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.16 (br. s, 2 H); 7.62 – 7.65 (m, 2 H); 7.45 (br. d, 1 H); 7.11 – 7.24 (m, 3 H); 6.90 (d, 1 H); 6.51 (dd, 1 H);5.78 (dd, 1 H); 3.10 (q, 2 H); 2.67 – 2.70 (m, 1 H); 2.15 (s, 3 H); 1.23 (t, 3 H); 0.83 – 0.86 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.47 min + MS ES : 663.8 [M+H]+。
实施例 8 制备 N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧基 }-2- 甲 基苯基 ) 乙磺酰胺溶液 A ： 将 65 mg 氯磺酰基异氰酸酯溶解在 0.11 mL DCM 中， 加热至回流， 并且用 18 µL 甲酸和 350 µL DMA 处理。
将 140 mg N-(3-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-2- 甲基 苯基 ) 乙磺酰胺 (0.233 mmol, 1 eq.) 溶解在 0.79 mL DMA 中， 并且用 61 µL DIPEA 处理。 通过注射器加入溶液 A， 并且将所得混合物在室温搅拌 16 小时。将该反应混合物在水与乙 酸乙酯之间分配， 将水层用乙酸乙酯再萃取， 将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。快速 柱色谱， 获得了 53 mg 目标化合物 (34% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.15 (br. s, 1 H); 8.59 (br. s, 1 H); 7.64 – 7.68 (m, 2 H); 7.46 (br. d, 1 H); 7.12 – 7.24 (m, 3 H); 7.05 (s, 2 H); 6.94 (d, 1 H); 6.43 (dd, 1 H); 5.64 (dd, 1 H); 3.10 (q, 2 H); 2.16 (s, 3 H); 1.24 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.35 min MS ES : 636.9 [M-H]-。
实施例 9 制 备 N-(2-{3-[( 乙 基 磺 酰 基 ) 氨 基 ] 苯 氧 基 }-6-[(4- 乙 炔 基 -2- 氟 苯 基 ) 氨 基 ]-4- 氟苯基 ) 环丙烷磺酰胺步骤 1将 100 mg N-(2-{3-[( 乙基磺酰基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯基 )- 氨 基 ] 苯基 ) 环丙烷磺酰胺 (0.154 mmol, 1 eq.)、 3.5 mg Pd(dba)2 (0.006 mmol; 4 mol%)、 1.2 mg 碘化铜 (I) (0.006 mmol; 4 mol%) 和 8 mg 三苯基膦 (0.03 mmol; 20 mol%) 称重 到微波瓶中， 溶解在 1.5 mL 三乙胺中， 设置在氩气氛下， 并且补充 128 µL 三甲基甲硅烷基 乙炔 (0.924 mmol, 6 eq.)。将该瓶盖上盖子， 并且在 60℃加热 3 小时， LCMS 分析表明完 全转化。将该反应混合物真空浓缩， 粗产物不用进一步纯化而直接使用。 LC-MS: 保留时间 : 1.61 min MS ES : 618.0 [M-H]-。
步骤 2 将得自步骤 1 的粗产物溶解在 2 mL THF 中， 用 0.24 mL TBAF 溶液 (1.0 M 在 THF 中的 溶液 ; 0.24 mmol, 1.55 eq.) 处理， 并且在室温搅拌 16 小时。将该反应混合物用乙酸乙 酯稀释， 用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 然后用饱和氯化钠溶液洗涤， 干燥并且过滤。真空浓缩 后， 通过制备薄层色谱 (5 DC 平板 20×20 cm; 己烷 / 乙酸乙酯 1:1 作为洗脱剂 ) 纯化残余 物， 获得了 26 mg 目标化合物 (2 步的收率为 31%)。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.92 (br. s, 1 H); 9.14 (br. s, 1 H); 7.75 (br. s, 1 H); 7.38 (dd, 1 H); 7.34 (dd, 1 H); 7.28 (dd, 1 H); 7.21 (dd, 1 H); 7.02 (dd, 1 H); 6.96 (dd, 1 H); 6.81 (dd, 1 H); 6.71 (dd, 1 H); 6.21 (dd, 1 H); 4.14 (s, 1 H); 3.10 (q, 2 H); 2.63 (m, 1 H); 1.15 (t, 3 H); 0.87 – 0.81 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.35 min + MS ES : 548.0 [M+H]+。
实施例 10 制备 N-(3-{3-[(4- 乙炔基 -2- 氟苯基 ) 氨基 ]-5- 氟 -2-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧基 } 苯基 ) 乙磺酰胺 [ 甲酸盐 ]步骤 1 将 100 mg N-(3-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2-( 氨基磺酰基氨基 )- 苯氧 基 } 苯基 ) 乙磺酰胺 (0.16 mmol, 1 eq.)、 3.7 mg Pd(dba)2 (0.006 mmol; 4 mol%)、 1.2 mg CuI (0.006 mmol; 4 mol%) 和 8.4 mg PPh3 (0.03 mmol; 20 mol%) 称重到微波瓶中， 溶 解在 1.6 mL Et3N 中， 设置在氩气氛下， 并且补充 133 µL 三甲基甲硅烷基乙炔 (0.961 mmol, 6 eq.)。将该瓶盖上盖子， 并且在 60℃加热 3 小时， LCMS 分析表明完全转化。将该反应混 合物真空浓缩， 粗产物 ( 含有未反应的原料 ) 不用进一步纯化而直接使用。 LC-MS: 保留时间 : 1.52 min43CN 102656142 A说MS ES-:明书37/61 页593.4 [M-H]-。步骤 2 将得自步骤 1 的粗产物溶解在 2 mL THF 中， 用 0.24 mL TBAF 溶液 (1.0 M 在 THF 中的 溶液 ; 0.24 mmol, 1.55 eq.) 处理， 并且在室温搅拌 16 小时。将该反应混合物用乙酸乙 酯稀释， 用饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 然后用饱和氯化钠溶液洗涤， 干燥并且过滤。真空浓缩 后， 通过纯化残余物制备 HPLC 纯化， 获得了 2.2 mg 目标化合物 (2 步的收率为 3%)。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 8.61 (br. s, 1 H); 7.82 (s, 1 H); 7.10 – 7.40 (m, 5 H); 6.99 – 7.05 (m , 4 H); 6.83 (d, 1 H); 6.62 (d, 1 H); 6.07 (dd, 1 H); 4.15 (s, 1 H); 3.10 (q, 2 H); 1.16 (t, 3 H). LC-MS: 保留时间 : 1.44 min + MS ES : 545.8 [M+HCO2H]+。
实施例 11 制备 N-{4- 氟 -2-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-6-[3-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧基 ] 苯 基 } 环丙烷磺酰胺
溶液 A ： 将 63 mg 氯磺酰基异氰酸酯溶解在 0.11 mL DCM 中， 加热至回流， 并且用 18 µL 甲酸和 340 µL DMA 处理。
将 125 mg N-{2-(3- 氨基苯氧基 )-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯基 }- 环 丙烷磺酰胺 (0.224 mmol, 1 eq.) 溶解在 0.76 mL DMA 中， 并且用 47 µL DIPEA 处理。通 过注射器加入溶液 A， 并且将所得混合物在室温搅拌 16 小时。将该反应混合物在水与乙酸 乙酯之间分配， 将水层用乙酸乙酯再萃取， 将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。通过快 速柱色谱纯化， 获得了 77 mg 目标化合物 (34% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.66 (br. s, 1 H); 9.12 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H); 7.58 (s, 1 H); 7.44 (d, 1 H); 7.29 (t, 1 H); 7.15 (s, 2 H); 7.11 (t, 1 H); 6.99 (dd, 1 H); 6.91 (t, 1 H); 6.70 (dd, 1 H); 6.56 (dd, 1 H); 6.06 (dd, 1 H); 2.62 – 2.69 (m, 1 H); 0.81 – 0.90 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.36 min MS ES : 636.7 [M-H]-。
实施例 12 制备 N-(4- 氟 -2-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-6-{3-[( 异丙基磺酰基 ) 氨基 ] 苯氧 基 } 苯基 ) 环丙烷磺酰胺将 125 mg N-{2-(3- 氨基苯氧基 )-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯基 }- 环丙 烷磺酰胺 (0.22 mmol, 1 eq.) 溶解在 1 mL 吡啶中， 用 31 µL 异丙基磺酰氯 (0.27 mmol, 1.2 eq.) 处理， 并且在室温搅拌 16 小时。 将该反应混合物用水处理， 用甲苯稀释， 并真空浓 缩。将残余物在水与乙酸乙酯之间分配， 将水层用乙酸乙酯再萃取， 将合并的有机层干燥， 过滤并真空浓缩。通过制备 HPLC 纯化， 然后通过快速柱色谱纯化， 获得了 70 mg 目标化合 物 (47% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.89 (br. s, 1 H); 9.10 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H); 7.59 (br. s, 1 H); 7.44 (d, 1 H); 7.32 (t, 1 H); 7.12 (t, 1 H); 7.03 (dd, 1 H); 6.97 (t, 1 H); 6.79 (dd, 1 H); 6.57 (dd, 1 H); 6.11 (dd, 1 H); 3.21 – 3.28 (m, 1 H); 2.61 – 2.67 (m, 1 H); 1.20 (d, 6 H); 0.80 – 0.88 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.49 min + MS ES : 663.8 [M+H]+。
下面的实施例化合物 13 是按照类似于制备实施例化合物 12 的方法， 通过在吡啶 存在下用各自的商购获得的磺酰氯处理 N-{2-(3- 氨基苯氧基 )-4- 氟 -6-[(2- 氟 -4- 碘苯 基 ) 氨基 ] 苯基 } 环丙烷磺酰胺 ( 中间体 11.A) 而制备的。实施例 14 制备 N-{4- 氟 -2-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-6-[4- 氟 -3-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧 基 ] 苯基 } 环丙烷磺酰胺
将 547 mg 粗的 N-(5-{2- 氨基 -5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-2- 氟苯 基 ) 硫二酰胺 ( 中间体 14.A) (0.993 mmol, 1. eq.) 溶解在 8.5 mL 吡啶中， 冷却至 0℃， 并且用 140 mg 环丙烷磺酰氯 (0.993 mmol, 1 eq.) 处理。将该反应混合物在室温搅拌 18 小时。再加入 70 mg 环丙烷磺酰氯 (0.497 mmol, 0.5 eq.)， 并且继续搅拌 24 小时。将该 反应混合物用甲苯稀释， 并真空浓缩。 将残余物在水与乙酸乙酯之间分配， 并且将水层用乙 酸乙酯再萃取两次。 将合并的有机层用半饱和盐水洗涤一次， 用盐水洗涤因此， 过滤并真空 浓缩。粗产物通过快速柱色谱纯化 ( 正己烷 / 乙酸乙酯梯度 )， 获得了 40 mg 所需产物 (6% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.38 (br. s, 1 H); 9.11 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H); 7.58 (br. s, 1 H); 7.44 (br. d, 1 H); 7.28 – 7.22 (m, 2 H); 7.17 (d, 2 H); 7.11 (dd, 1 H); 6.83 (dm, 1 H); 6.55 (dd, 1 H); 6.07 (dd, 1 H); 2.71 (m, 1 H); 0.89 – 0.82 (m, 4 H). LC-MS: 保留时间 : 1.37 min + MS ES : 655.34 [M+H]+。
实施例 15 制备 N-(5-{2-[( 环丙基磺酰基 ) 氨基 ]-5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧 基 }-2- 氟苯基 ) 环丙烷磺酰胺 .26.06 mg (0.04 mmol, 4 % 收 率 ) N-(5-{2-[( 环 丙 基 磺 酰 基 ) 氨 基 ]-5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯氧基 }-2- 氟苯基 ) 环丙烷磺酰胺是作为副产 物， 从制备实施例化合物 14 的反应混合物中分离出来的。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.79 (br. s, 1 H); 9.09 (br. s, 1 H); 7.65 (dd, 1 H); 7.60 (br. s, 1 H); 7.45 (br. d, 1 H); 7.31 (dd, 1 H); 7.17 – 7.09 (m, 2 H); 6.98 (m, 1 H); 6.55 (dd, 1 H); 6.08 (dd, 1 H); 2.73 – 2.61 (m,2 H); 0.95 - 079 (m, 8 H). LC-MS: 保留时间 : 1.44 min + MS ES : 679.7 [M+H]+。
实施例 16 制备 N-(2- 氟 -5-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-2-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧 基 } 苯基 ) 硫二酰胺 .2.36 mg (3.64 µmol, 0.37 % 收率 ) N-(2- 氟 -5-{5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨 基 ]-2-( 氨基磺酰基氨基 ) 苯氧基 } 苯基 ) 硫二酰胺是作为副产物， 从制备实施例化合物 14 的反应混合物中分离出来的。 1
H-NMR (d6-DMSO; 300 MHz): δ = 9.35 (br. s, 1 H); 8.59 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H); 7.64 (br. s, 1 H); 7.29 – 7.10 (m, 7 H); 6.99 (br. s, 1 H); 6.83 (ddd, 1 H); 6.47 (dd, 1 H); 5.99 (dd, 1 H). LC-MS: 保留时间 : 1.24 min + MS ES : 630.3 [M+H]+。
实施例 17 制备 N-(4- 氟 -2-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ]-6-{3-[( 氨基磺酰基氨基 ) 甲基 ] 苯氧 基 } 苯基 ) 环丙烷磺酰胺将 814 mg [(3-{2-[( 环丙基磺酰基 ) 氨基 ]-5- 氟 -3-[(2- 氟 -4- 碘苯基 ) 氨基 ] 苯 氧基 } 苄基 ) 氨基磺酰基 ] 氨基甲酸叔丁酯 ( 中间体 18A; 1.08 mmol, 1 eq.) 溶解在 30 mL DCM 中， 并且加入 1.67 mL TFA。将该反应混合物在室温搅拌过夜。将该反应混合物在 饱和碳酸氢钠水溶液与二氯甲烷之间分配。使用 2N 氢氧化钠水溶液将 pH 调节至 pH = 8。 分离各层， 并且将水层用二氯甲烷再萃取两次。 将合并的有机层用盐水洗涤一次， 过滤并真 空浓缩。通过制备 HPLC 纯化粗产物， 获得了 322 mg 所需产物 (46% 收率 )。 1
H-NMR (d6-DMSO; 400 MHz): δ = 9.11 (br. s, 1 H); 7.64 (dd, 1 H);H); 7.44 (br. d, 1 H); 7.34 (dd, 1 H); 7.18 (d, 1 H); 7.15 – 6.99 (br. d, 1 H); 6.62 (s, 2 H); 6.55 (dd, 1 H); 6.02 (dd, 1 H); 2.68 (m, 1 H); 0.89 – 0.82 (m, 4 H). 保留时间 : 1.37min + MS ES : 650.8 [M+H]+。
此外， 可以通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的式 (I) 化合物转化成 本文所描述的任何盐。类似地， 可以通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明式 (I) 化合物的任何盐转化成游离化合物。
本发明化合物的药物组合物 本发明还涉及含有一种或多种本发明化合物的药物组合物。 这些组合物可以通过施用 给有此需要的患者来实现所期望的药理作用。对于本发明的目的， 患者是需要治疗特定病 症或疾病的哺乳动物， 包括人。因此， 本发明包括药物组合物， 所述组合物由可药用载体与 药物有效量的本发明化合物或其盐组成。 可药用载体优选是在与活性组分的有效活性一致 的浓度下相对没有毒性， 并且对患者无害的载体， 从而载体所带来的任何副作用不会损害 活性组分的有益作用。 药物有效量的化合物优选是对所治疗的特定病症产生结果或施加影 响的量。可以使用任何有效的常规单位剂型， 包括即释制剂、 缓释制剂和定时释放制剂， 将 本发明化合物与本领域众所周知的可药用载体一起口服施用、 胃肠外施用、 局部施用、 经鼻 施用、 经眼施用、 眼施用、 舌下施用、 直肠施用、 阴道施用等。
对于口服给药， 可以将化合物配制成固体或液体制剂例如胶囊、 丸剂、 片剂、 药片、 锭剂、 熔融物、 粉剂、 溶液剂、 悬浮液或乳剂， 并且可以根据本领域已知的生产药物组合物的 方法来制备。 固体单位剂型可以是胶囊， 所述胶囊可以是常规硬壳或软壳明胶型， 含有例如 表面活性剂、 润滑剂和惰性填充剂例如乳糖、 蔗糖、 磷酸钙和玉米淀粉。
在另一个实施方案中， 可以用以下物质将本发明化合物制成片剂 ： 常规片剂基质 例如乳糖、 蔗糖和玉米淀粉， 联合粘合剂例如阿拉伯胶、 玉米淀粉或明胶， 用于在给药后帮 助片剂崩解和溶解的崩解剂例如马铃薯淀粉、 藻酸、 玉米淀粉和瓜尔胶， 黄蓍胶， 阿拉伯胶， 用于改善片剂制粒的流动和防止片剂材料与片剂冲模和冲压机表面粘着的润滑剂， 例如滑 石粉、 硬脂酸、 硬脂酸镁、 硬脂酸钙或硬脂酸锌， 颜料， 和用于提高片剂的口感以及使得片剂 更容易为患者所接受的矫味剂例如薄荷、 冬青油或樱桃矫味剂。用于口服液体剂型的合适 的赋形剂包括磷酸二钙和稀释剂例如水和醇如乙醇、 苯甲醇和聚乙二醇， 加入或不加入可 药用表面活性剂、 悬浮剂或乳化剂。各种其他材料可以作为包衣来使用或者用于修饰剂量 单位的物理形式。例如， 片剂、 丸剂或胶囊可以用虫胶、 糖或二者来包衣。
可分散粉剂和颗粒剂适于制备水悬浮液。 可分散粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润 湿剂、 悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。合适的分散剂或润湿剂以及悬浮剂的 实例是如上所述的那些。还可以存在另外的赋形剂， 例如上述甜味剂、 矫味剂和着色剂。
本发明药物组合物还可以呈水包油乳剂的形式。 油相可以是植物油例如液体石蜡 或植物油的混合物。合适的乳化剂可以是 (1) 天然树胶例如阿拉伯胶和黄蓍胶， (2) 天然 磷脂例如大豆和卵磷脂， (3) 衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯， 例如脱水山梨糖醇单 油酸酯， (4) 所述部分酯与氧化乙烯的缩合产物， 例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳 剂还可以包含甜味剂和矫味剂。487.58 (br. s, 1 7.08 (m, 3 H); H); 4.07 (d, 2 LC-MS:CN 102656142 A
说明书42/61 页通过将活性组分悬浮在植物油例如花生油、 橄榄油、 芝麻油或椰子油， 或矿物油例 如液体石蜡中可以配制油悬浮液。 油悬浮液可以含有增稠剂例如蜂蜡、 硬石蜡或鲸蜡醇。 悬 浮液还可以含有一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯 ； 一种或 多种着色剂 ； 一种或多种矫味剂 ； 和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。
可以用甜味剂例如甘油、 丙二醇、 山梨醇或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。 这样的制剂还 可以含有缓和剂和防腐剂， 例如尼泊金甲酯和尼泊金丙酯， 以及矫味剂和着色剂。
本发明化合物还可以胃肠外给药， 即作为化合物的注射剂皮下给药、 静脉内给药、 眼内给药、 滑液内给药、 肌内给药或腹膜内给药， 所述注射剂是化合物在优选生理学可接受 的稀释剂中的注射剂， 所述稀释剂具有药物载体， 所述药物载体可以是无菌液体或液体混 合物， 例如水、 盐水、 葡萄糖水溶液和相关糖溶液， 醇例如乙醇、 异丙醇或十六烷基醇， 二醇 例如丙二醇或聚乙二醇， 甘油酮缩醇例如 2,2- 二甲基 -1,1- 二氧杂环戊烷 -4- 甲醇， 醚例 如聚 ( 乙二醇 )400， 油， 脂肪酸， 脂肪酸酯， 或脂肪酸甘油酯， 或乙酰化脂肪酸甘油酯， 所述 稀释剂中加有或未加有可药用表面活性剂例如皂或洗涤剂， 悬浮剂例如胶质、 卡波姆、 甲基 纤维素、 羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素， 或乳化剂和其他药物助剂。
可用于本发明胃肠外给药制剂的油的实例是石油、 动物、 植物或合成来源的油， 例 如花生油、 豆油、 芝麻油、 棉籽油、 玉米油、 橄榄油、 凡士林和矿物油。合适的脂肪酸包括油 酸、 硬脂酸、 异硬脂酸和肉豆蔻酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。合 适的皂包括脂肪酸碱金属盐、 铵盐和三乙醇胺盐， 并且合适的洗涤剂包括阳离子洗涤剂， 例 如二甲基二烷基铵卤化物、 烷基吡啶 卤化物和烷基胺乙酸盐 ； 阴离子洗涤剂， 例如烷基、 芳基和烯烃磺酸盐， 烷基、 烯烃、 醚和甘油单酯硫酸盐， 和磺基琥珀酸盐 ； 非离子洗涤剂， 例 如脂肪胺氧化物， 脂肪酸链烷醇酰胺和聚 ( 氧乙烯 - 氧丙烯 ) 或氧化乙烯或氧化丙烯共聚 物； 和两性洗涤剂， 例如烷基 -β- 氨基丙酸盐， 和 2- 烷基咪唑啉季铵盐以及混合物。 本发明的胃肠外给药组合物通常在溶液中含有约 0.5%- 约 25% 总量的活性组分。 还可以有利地使用防腐剂和缓冲剂。为了减轻或消除注射位置的刺激， 这样的组合物可以 含有亲水 - 亲油平衡 (HLB) 值优选为约 12- 约 17 的非离子表面活性剂。表面活性剂在这 样的制剂中的量优选为约 5%- 约 15% 重量。表面活性剂可以是具有上述 HLB 的单一组分， 或者可以是具有所需 HLB 的两种或多种组分的混合物。
用于胃肠外给药制剂的示例性表面活性剂有聚乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯， 例如脱 水山梨醇单油酸酯， 以及氧化乙烯与疏水性基质的高分子量加合物， 所述疏水性基质是通 过氧化丙烯与丙二醇的缩合而形成的。
药物组合物可以呈可注射水悬浮液的形式。这样的悬浮液可以根据已知方法， 使 用下列物质来配制 ： 合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂， 例如羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 藻酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮、 黄蓍胶和阿拉伯胶 ； 分散剂或润湿剂， 其可以 是天然磷脂例如卵磷脂， 烯化氧与脂肪酸的缩合产物， 例如聚氧乙烯硬脂酸酯， 氧化乙烯与 长链脂族醇的缩合产物， 例如十七 - 氧化乙烯鲸蜡醇， 氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇 的部分酯的缩合产物， 例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯， 或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖 醇酐的部分酯的缩合产物， 例如脱水山梨糖醇单油酸酯。
可注射无菌制剂还可以是在非毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注 射溶液或悬浮液。 可以采用的稀释剂和溶剂有例如水、 林格溶液、 等渗氯化钠溶液和等渗葡
萄糖溶液。此外， 通常使用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。对于该目的， 可以采用任何柔 和的固定油， 包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外， 可以在注射剂中使用脂肪酸例如油酸。
本发明组合物还可以成用于直肠给药的栓剂形式。 这些组合物可以通过将药物与 合适的非刺激性赋形剂混合来制得， 所述赋形剂在常温下是固体， 但是在直肠温度是液体， 并由此在直肠中融化以释放药物。这样的材料是例如可可脂和聚乙二醇。
用于本发明方法的另一制剂采用透皮递送装置 （ “贴剂” ） 。 可以使用这样的透皮贴 剂来以控制的量提供化合物的连续或不连续的输注。 用于递送药物的透皮贴剂的构造和应 用是本领域众所周知的 ( 参见例如 US 专利 5,023,252， 1991 年 6 月 11 日发布， 其引入本文 以供参考 )。这样的贴剂可以构造成用于连续、 脉冲或者根据需要来递送药物的形式。
用于胃肠外给药的控释制剂包括本领域已知的脂质体、 聚合微球和聚合凝胶制 剂。
可能希望或者必须经由机械递送装置给患者引入药物组合物。 用于递送药物的机 械递送装置的构造和应用是本领域众所周知的。 用于例如将药物直接施用给脑的直接技术 通常包括将药物递送导管置于患者脑室内以绕过血脑屏障。 用于将活性剂输送到身体特定 解剖学区域的一种这样的植入递送系统描述于 US 专利 5,011,472 中， 1991 年 4 月 30 日公 布。
按照需要或者期望地， 本发明组合物还可以包含其他常规可药用混合组分， 通常 称为载体或稀释剂。可以使用制备在适当剂型中的这样的组合物的常规方法。这样的组 分和方法包括在下列文献中描述的那些， 每一文献都引入本文以供参考 ： Powell, M.F. 等 人 ,, “Compendium of Excipients for Parenteral Formulations” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1998, 52(5), 238-311; Strickley, R.G “Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the United States (1999)-Part-1”PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1999, 53(6), 324-349; 和 Nema, S. 等 人 ,, “Excipients and Their Use in Injectable Products” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 1997, 51(4), 166-171。
对于其预定给药途径， 可适当地用于配制组合物的常用药物组分包括 ： 酸化剂 ( 实例包括但不限于乙酸、 柠檬酸、 富马酸、 盐酸、 硝酸 ) ； 碱化剂 ( 实例包括但不限于氨溶液、 碳酸铵、 二乙醇胺、 单乙醇胺、 氢氧化钾、 硼酸钠、 碳酸钠、 氢氧化钠、 三乙醇胺、 三乙醇胺 ) ； 吸附剂 ( 实例包括但不限于纤维素粉末和活性炭 ) ； 气雾剂推进剂 ( 实例包括但不限于二氧化碳、 CCl2F2、 F2ClC-CClF2 和 CClF3) ； 气体置换剂 ( 实例包括但不限于但其和氩气 ) ； 抗真菌防腐剂 ( 实例包括但不限于苯甲酸、 对羟基苯甲酸丁酯、 对羟基苯甲酸乙酯、 对 羟基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸丙酯、 苯甲酸钠 ) ； 抗微生物防腐剂 ( 实例包括但不限于苯扎氯铵、 苄索氯铵、 苯甲醇、 西吡氯铵、 氯丁醇、 苯酚、 苯乙醇、 硝酸苯贡和硫柳贡 ) ； 抗氧化剂 ( 实例包括但不限于抗坏血酸、 抗坏血酸棕榈酸酯、 丁化羟基苯甲醚、 丁化羟 基甲苯、 次磷酸、 单硫代甘油、 没食子酸丙酯、 抗坏血酸钠、 亚硫酸氢钠、 甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠 ) ； 粘合材料 ( 实例包括但不限于嵌段聚合物、 天然和合成橡胶、 聚丙烯酸酯、 聚氨酯、 硅 酮、 聚硅氧烷和苯乙烯 - 丁二烯共聚物 ) ； 缓冲剂 ( 实例包括但不限于偏磷酸钾、 磷酸二钾、 乙酸钠、 无水柠檬酸钠和柠檬酸钠二 水合物 ) ； 携带剂 (carrying agents) ( 实例包括但不限于阿拉伯胶糖浆、 芳香糖浆、 芳香酏剂、 樱桃糖浆、 可可糖浆、 橙子糖浆、 糖浆、 玉米油、 矿物油、 花生油、 芝麻油、 抑菌氯化钠注射液 和抑菌注射用水 ) ； 螯合剂 ( 实例包括但不限于依地酸二钠和依地酸 ) ； 着色剂 ( 实例包括但不限于 FD&C Red No. 3、 FD&C Red No. 20、 FD&C Yellow No. 6、 FD&C Blue No. 2、 D&C Green No. 5、 D&C Orange No. 5、 D&C Red No. 8、 焦糖和氧化铁 红)； 澄清剂 ( 实例包括但不限于膨润土 ) ； 乳化剂 ( 实例包括但不限于阿拉伯胶、 聚西托醇、 鲸蜡醇、 甘油单硬脂酸酯、 卵磷脂、 脱 水山梨醇单油酸酯、 聚氧乙烯 50 单硬脂酸酯 ) ； 包囊剂 ( 实例包括但不限于明胶和乙酸邻苯二甲酸纤维素 ) ； 矫味剂 ( 实例包括但不限于茴香油、 肉桂油、 可可粉、 薄荷醇、 橙油、 薄荷油和香草醛 ) ； 湿润剂 ( 实例包括但不限于甘油、 丙二醇和山梨醇 ) ； 研磨剂 (levigating agents) ( 实例包括但不限于矿物油和甘油 ) ； 油 ( 实例包括但不限于花生油、 矿物油、 橄榄油、 花生油、 芝麻油和植物油 ) ； 软膏剂基质 ( 实例包括但不限于羊毛脂、 亲水性软膏、 聚乙二醇软膏、 凡士林、 亲水性 凡士林、 白软膏、 黄软膏和玫瑰香水软膏 ) ； 透过促进剂 ( 透皮递送 ) ( 实例包括但不限于单羟基或多羟基醇， 一元醇或多元醇， 饱 和或不饱和脂肪醇， 饱和或不饱和脂肪酯， 饱和或不饱和二羧酸， 香精油， 磷脂酰衍生物， 脑 磷脂， 萜烯， 酰胺， 醚， 酮和脲 ) ； 增塑剂 ( 实例包括但不限于邻苯二甲酸二乙酯和甘油 ) ； 溶剂 ( 实例包括但不限于乙醇、 玉米油、 棉籽油、 甘油、 异丙醇、 矿物油、 油酸、 花生油、 纯化水、 注射用水、 无菌注射用水和无菌灌注用水 ) ； 硬化剂 ( 实例包括但不限于鲸蜡醇、 鲸蜡基酯蜡、 微晶蜡、 石蜡、 硬脂醇、 白蜡和黄蜡 ) ； 栓剂基质 ( 实例包括但不限于可可脂和聚乙二醇 ( 混合物 )) ； 表面活性剂 ( 实例包括但不限于苯扎氯铵、 壬苯醇醚 10、 oxtoxynol 9、 聚山梨酯 80、 十二烷基硫酸钠和脱水山梨醇单棕榈酸酯 ) ； 悬浮剂 ( 实例包括但不限于琼脂、 膨润土、 卡波姆、 羧甲基纤维素钠、 羟乙基纤维素、 羟 丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 高岭土、 甲基纤维素黄蓍胶和 veegum) ； 甜味剂 ( 实例包括但不限于阿司帕坦、 葡萄糖、 甘油、 甘露醇、 丙二醇、 糖精钠、 山梨醇 和蔗糖 ) ； 片剂抗粘着剂 ( 实例包括但不限于硬脂酸镁和滑石粉 ) ； 片剂粘合剂 ( 实例包括但不限于阿拉伯胶、 藻酸、 羧甲基纤维素钠、 可压缩糖、 乙基纤 维素、 明胶、 液体葡萄糖、 甲基纤维素、 非交联聚乙烯吡咯烷酮和预凝胶化淀粉 ) ；片剂和胶囊稀释剂 ( 实例包括但不限于磷酸氢钙、 高岭土、 乳糖、 甘露醇、 微晶纤维素、 纤维素粉末、 沉淀的碳酸钙、 碳酸钠、 磷酸钠、 山梨醇和淀粉 ) ； 片剂包衣剂 ( 实例包括但不限于液体葡萄糖、 羟乙基纤维素、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲 基纤维素、 甲基纤维素、 乙基纤维素、 乙酸邻苯二甲酸纤维素和虫胶 ) ； 片剂直接压缩赋形剂 ( 实例包括但不限于磷酸氢钙 ) ； 片剂崩解剂 ( 实例包括但不限于藻酸、 羧甲基纤维素钙、 微晶纤维素、 聚克立林钾、 交 联聚乙烯吡咯烷酮、 藻酸钠、 淀粉乙醇酸钠和淀粉 ) ； 片剂助流剂 ( 实例包括但不限于胶态二氧化硅、 玉米淀粉和滑石粉 ) ； 片剂润滑剂 ( 实例包括但不限于硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 矿物油、 硬脂酸和硬脂酸锌 ) ； 片剂 / 胶囊遮光剂 ( 实例包括但不限于二氧化钛 ) ； 片剂抛光剂 ( 实例包括但不限于巴西棕榈蜡和白蜡 ) ； 增稠剂 ( 实例包括但不限于蜂蜡、 鲸蜡醇和石蜡 ) ； 等渗剂 ( 实例包括但不限于葡萄糖和氯化钠 ) ； 粘度提高剂 ( 实例包括但不限于藻酸、 膨润土、 卡波姆、 羧甲基纤维素钠、 甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 藻酸钠和黄蓍胶 ) ； 和 润湿剂 ( 实例包括但不限于十七亚乙基氧基鲸蜡醇 (heptadeca 亚乙基 oxycetanol)、 卵磷脂、 山梨醇单油酸酯、 聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯 )。
可以如下所述来举例说明本发明药物组合物 ： 无菌 IV 溶液 ： 可以使用无菌注射用水制备 5 mg/mL 所需本发明化合物的溶液， 并且按 照需要来调节 pH。使用无菌 5% 葡萄糖将该溶液稀释至 1 – 2 mg/mL， 并且作为 IV 输液经 由约 60 分钟给药。
用于 IV 给药的冻干粉末 ： 可以用 (i) 100 - 1000 mg 作为冻干粉末的所需本发明 化合物， (ii) 32- 327 mg/mL 柠檬酸钠和 (iii) 300 – 3000 mg Dextran 40 制备无菌制 剂。将该制剂用无菌注射盐水或 5% 葡萄糖重新配制至 10-20 mg/mL 的浓度， 进一步用盐水 或 5% 葡萄糖稀释至 0.2 – 0.4 mg/mL， 通过 IV 快速浓注给药或者通过 IV 输注经由 15-60 分钟给药。
肌内悬浮液 ： 可以制备以下溶液或悬浮液以用于肌内注射 ： 50 mg/mL 所需的水不溶性本发明化合物 5 mg/mL 羧甲基纤维素钠 4 mg/mL TWEEN 80 9 mg/mL 氯化钠 9 mg/mL 苯甲醇 硬壳胶囊剂 ： 通过填充标准两片式硬明胶 (galantine) 胶囊来制备大量单位胶囊， 每 粒胶囊填充 100 mg 活性组分粉末、 150 mg 乳糖、 50 mg 纤维素和 6 mg 硬脂酸镁。
软明胶胶囊剂 ： 制备活性组分在食用油例如豆油、 棉籽油或橄榄油中的混合物， 并 且通过定容填充泵注射到融化的明胶内以形成含有 100 mg 活性组分的软明胶胶囊剂。将 胶囊剂洗涤并且干燥。可以将活性组分溶解在聚乙二醇、 甘油和山梨醇的混合物中以制备 可与水混溶的药物混合物。
片剂 ： 通过常规方法制备大量片剂， 剂量单位是 100 mg 活性组分、 0.2 mg 胶态二氧化硅、 5 mg 硬脂酸镁、 275 mg 微晶纤维素、 11 mg 淀粉和 98.8 mg 乳糖。可以施加合适的 水和非水包衣， 以提高味道、 改善外观以及稳定性或延迟吸收。
即释片剂 / 胶囊剂 ： 这些是通过常规方法和新方法制备的固体口服剂型。这些剂 量单位不用水口服给药以立即溶解， 和递送药物。将活性组分在含有组分例如糖、 明胶、 果 胶和甜味剂的液体中混合。 通过冷冻干燥和固态提取技术将这些液体固化成固体片剂或囊 片。 可以将药物化合物与粘弹性和热弹性糖和聚合物或泡腾组分一起压制以获得用于无需 水而立即释放的多孔基体。
联合治疗 本发明化合物能够单独施用， 或者与一种或多种其他药物联合施用， 只要该组合不会 导致不可接受的副作用。本发明还涉及这样的组合。例如， 本发明化合物可以与已知的抗 高增殖剂或其他治疗剂等及其混合物和组合进行组合。 其他治疗剂包括但不限于抗血管生 成剂、 有丝分裂抑制剂、 烷化剂、 抗代谢药物、 DNA- 嵌入抗生素、 生长因子抑制剂、 细胞周期 抑制剂、 酶抑制剂、 拓扑异构酶抑制剂、 生物响应调节剂或抗激素。
另 外 的 药 物 可 以 是 阿 地 白 介 素、阿 仑 磷 酸、 alfaferone、阿 利 维 A 酸 (alitretinoin)、 别嘌醇、 aloprim、 aloxi、 六甲蜜胺、 氨鲁米特、 氨磷汀、 氨柔比星、 安吖 啶、 阿那曲唑、 anzmet、 阿法达贝泊汀 (aranesp)、 阿加来必 (arglabin)、 三氧化二砷、 阿诺 新 (aromasin)、 5- 氮胞苷、 硫唑嘌呤、 BCG 或 tice-BCG、 贝他定、 倍他米松乙酸酯、 倍他米松 磷酸钠、 蓓萨罗丁 (bexaroten)、 硫酸博来霉素、 溴尿苷、 硼替佐米 (bortezomib)、 马利兰、 降钙素、 campath、 卡培他滨、 卡铂、 康士得 (casodex)、 cefeson、 西莫白介素、 正定霉素、 苯 丁酸氮芥、 顺铂、 克拉屈滨 ( 克拉屈滨 )、 克拉屈滨 ( 克拉屈滨 )、 氯膦酸、 环磷酰胺、 阿糖胞 苷、 达卡巴嗪、 放线菌素、 DaunoXome、 地卡特隆、 地卡特隆磷酸酯、 delestrogen、 地尼白介 素 2、 depomedrol、 地洛瑞林、 右雷佐生、 己烯雌酚、 大扶康 （diflucan） 、 多西他赛、 去氧氟尿 苷、 多柔比星、 屈大麻酚、 DW-166HC、 艾里咖 (eligard)、 elitek、 ellence、 止敏吐 (emend)、 表柔比星、 阿法依泊汀 （epoetin-alfa） 、 epogen、 依铂 （eptaplatin） 、 ergamisol、 estrace、 雌二醇、 雌莫司汀磷酸钠、 炔雌醇、 ethyol、 依替膦酸、 凡毕复 (etopophos)、 依托泊苷、 法倔 唑、 farston、 非格司亭、 非那雄胺、 fligrastim、 氮尿苷、 氟康唑、 氟达拉滨 （fludarabin） 、 5- 氟脱氧尿苷单磷酸、 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)、 氟甲睾酮、 氟他胺、 福美坦、 fosteabin、 福莫 司汀、 氟维司群、 gammagard、 吉西他滨、 吉姆单抗、 格列卫 （gleevec） 、 gliadel、 戈舍瑞林、 格拉司琼盐酸盐、 组氨瑞林、 和美新 (hycamtin)、 氢化可的松 (hydrocorton)、 赤型 - 羟 基壬基腺嘌呤、 羟基脲、 ibritumomab tiuxetan、 伊达比星、 异环磷酰胺、 干扰素 -α、 干扰 素 -α-2、 干扰素 -α-2α、 干扰素 -α-2β、 干扰素 -α-n1、 干扰素 -α-n3、 干扰素 -β、 干扰素 -γ-1α、 白介素 -2、 内含子 A、 易瑞沙 (iressa)、 伊立替康、 凯特瑞 (kytril)、 蘑菇 多糖硫酸盐、 来曲唑、 亚叶酸、 亮丙立德、 亮丙立德乙酸盐、 左旋咪唑、 左亚叶酸钙盐、 左甲 状腺素钠 （levothroid） 、 levoxyl、 洛莫司汀、 氯尼达明、 marinol、 氮芥、 甲钴胺、 醋酸甲羟 孕酮、 甲地孕酮、 美法仑、 梅内、 6- 巯基嘌呤、 美司钠、 甲氨蝶呤、 metvix、 米替福新、 米诺环 素、 自力霉素、 米托坦、 米托蒽醌、 曲洛司坦 (Modrenal)、 myocet、 奈达铂、 neulasta、 纽密伽 (neumega)、 优保津 (neupogen)、 尼鲁米特、 nolvadex、 NSC-631570、 OCT-43、 奥曲肽、 昂丹 司琼盐酸盐、 orapred、 奥沙利铂、 紫杉醇、 pediapred、 培门冬酶、 珮格西施 (Pegasys)、 喷司 他丁、 毕西巴尼 (picibanil)、 盐酸毛果芸香碱、 吡柔比星、 普卡霉素、 卟吩姆钠、 泼尼莫司汀、 泼尼松龙、 泼尼松、 普雷马林、 丙卡巴肼、 procrit、 雷替曲塞、 利比 （rebif） 、 铼 -186 依 替膦酸盐、 利妥昔单抗、 roferon-A、 罗莫肽、 salagen、 善宁 (sandostatin)、 沙格司亭、 司莫 司汀、 西佐喃、 索布佐生、 solu- 甲基强的松龙、 膦门冬酸、 干细胞治疗、 链佐星、 锶 -89 氯化 物、 synthroid、 他莫昔芬、 坦洛新、 他索纳明 (tasonermin)、 睾内酯 (tastolacton)、 泰素 帝 (taxotere)、 替西白介素、 替莫唑胺、 替尼泊苷、 丙酸睾酮、 testred、 硫鸟嘌呤、 塞替派、 促甲状腺激素、 替鲁膦酸、 托泊替康、 toremifen、 托西莫单抗 (tositumomab)、 曲妥单抗、 曲 奥舒凡 (treosulfan)、 维 A 酸、 trexall、 三甲基三聚氰胺、 三甲曲沙、 曲普瑞林乙酸盐、 曲 普瑞林双羟萘酸盐、 UFT、 尿嘧啶核苷、 戊柔比星 (valrubicin)、 维司力农、 长春碱、 长春新 碱、 长春地辛、 长春瑞滨、 virulizin、 zinecard、 净司他丁斯酯、 枢复宁 （zofran） 、 ABI-007、 acolbifen、 actimmune、 affinitak、 氨基蝶呤、 阿佐昔芬 （arzoxifene） 、 asoprisnil、 阿他 美坦、 atrasentan、 sorafenib、 安维汀 (avastin)、 CCI-779、 CDC-501、 西乐葆 (celebrex)、 西妥昔单抗、 crisnatol、 乙酸赛普龙、 地西他滨、 DN-101、 多柔比星 -MTC、 dSLIM、 度他雄 胺 （dutasterid） 、 edotecarin、 依 氟 鸟 氨 酸、 依 沙 替 康 (exatecan)、 芬 维 A 胺、 二盐酸组 胺、 组氨瑞林水凝胶植入物、 钬 -166DOTMP、 伊班膦酸、 干扰素 -γ、 内含子 -PEG、 伊沙匹 隆 （ixabepilon） 、 钥 孔 嘁 血 蓝 蛋 白 (keyhole Limpet-Hemocyanin)、 L-651582、 兰 瑞 肽、 拉索昔芬 （lasofoxifen） 、 libra、 lonafarnib、 miproxifen、 米 诺 膦 酸 (minodronate)、 mS-209、 liposomales MTP-PE、 MX-6、 那法瑞林、 奈莫柔比星、 新伐司他 （neovastat） 、 诺拉 曲特 (nolatrexed)、 oblimersen、 onko-TCS、 osidem、 紫杉醇聚谷氨酸酯、 帕米膦酸盐二钠、 PN-401、 QS-21、 夸西泮、 R-1549、 雷洛昔芬 ( 雷洛昔芬 )、 ranpirnas、 13- 顺式 - 视黄酸、 沙 铂 (satraplatin)、 西奥骨化醇 (seocalcitol)、 T-138067、 特罗凯 (tarceva)、 taxoprexin、 胸腺素 -α-1、 tiazofurin、 tipifarnib、 替拉扎明、 TLK-286、 托瑞米芬 (toremifen)、 反式 MID-107R、 valspodar、 伐普肽、 瓦他拉尼 (vatalanib)、 维替泊芬、 长春氟宁 (vinflunin)、 Z-100、 唑来膦酸或其组合。
可加到组合物中的任选抗高增殖剂包括但不限于在第 11 版 Merck Index, (1996) 中于癌症化疗药物方案下列出的化合物， 其引入本文以供参考， 例如天冬酰胺酶、 博来霉 素、 卡铂、 卡莫司汀、 苯丁酸氮芥、 顺铂、 L- 天冬酰胺酶、 环磷酰胺、 阿糖胞苷、 达卡巴嗪、 放线 菌素、 柔红霉素、 多柔比星 ( 阿霉素 )、 表柔比星、 依托泊苷、 5- 氟尿嘧啶、 六甲蜜胺、 羟基脲、 异环磷酰胺、 伊立替康、 亚叶酸、 洛莫司汀、 氮芥、 6- 巯基嘌呤、 美司钠、 甲氨蝶呤、 自力霉素、 米托蒽醌、 泼尼松龙、 泼尼松、 丙卡巴肼、 雷洛昔芬、 膦门冬酸、 他莫昔芬、 硫鸟嘌呤、 托泊替 康、 长春碱、 长春新碱和长春地辛。
适于与本发明组合物一起使用的其他抗高增殖剂包括但不限于在 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Ninth Edition), 编 者 Molinoff 等人 , publ. by McGraw-Hill, pages 1225-1287, (1996) 中记载的公认用于 治疗肿瘤疾病的化合物， 其引入本文以供参考， 例如氨鲁米特、 L- 天冬酰胺酶、 硫唑嘌呤、 5- 氮胞苷克拉屈滨、 马利兰、 己烯雌酚、 2',2'- 二氟脱氧胞苷、 多西他赛、 赤型 - 羟基壬基腺 嘌呤、 乙炔基雌二醇、 5- 氟脱氧尿苷、 5- 氟脱氧尿苷一磷酸、 磷酸氟达拉滨、 氟甲睾酮、 氟他 胺、 己酸羟孕酮、 伊达比星、 干扰素、 醋酸甲羟孕酮、 甲地孕酮、 美法仑、 米托坦、 紫杉醇、 喷司 他丁、 N- 膦酰基乙酰基 -L- 天冬氨酸 (PALA)、 普卡霉素、 司莫司汀、替尼泊苷、 丙酸睾酮、 塞 替派、 三甲基三聚氰胺、 尿嘧啶核苷和长春瑞滨。适于与本发明组合物一起使用的其他抗高增殖剂包括但不限于其他抗癌剂例如 大环内酯类药物 (epothilone) 及其衍生物， 伊立替康， 雷洛昔芬和托泊替康。
本发明化合物还可以与蛋白治疗剂联合施用。适用于治疗癌症或其他血管生成 病症并且可以与本发明组合物联合使用的蛋白治疗剂包括但不限于干扰素 ( 例如干扰 素 -α、 干扰素 -β 或干扰素 -γ)， 超兴奋性单克隆抗体， Tuebingen， TRP-1 蛋白疫苗， Colostrinin， 抗 -FAP 抗体， YH-16、 吉姆单抗、 英夫利昔单抗、 西妥昔单抗、 曲妥单抗、 地尼 白介素 2、 利妥昔单抗、 胸腺素 α1、 贝伐单抗、 美卡舍明、 美卡舍明 - 林菲培 (mecasermin rinfabate)、 奥 普 瑞 白 介 素、 那 他 珠 单 抗、 rhMBL、 MFE-CP1 + ZD-2767-P、 ABT-828、 ErbB2- 特异性免疫毒素、 SGN-35、 MT-103、 林菲培 (rinfabate)、 AS-1402、 B43- 金雀异黄 素、 基于 L-19 的放射免疫治疗剂、 AC-9301、 NY-ESO-1 疫苗、 IMC-1C11、 CT-322、 rhCC10、 r(m)CRP、 MORAb-009、 aviscumine、 MDX-1307、 Her-2 疫 苗、 APC-8024、 NGR-hTNF、 rhH1.3、 IGN-311、 内 皮 生 长 抑 素、 volociximab、 PRO-1762、 lexatumumab、 SGN-40、 pertuzumab、 EMD-273063、 L19-IL-2 融 合 蛋 白、 PRX-321、 CNTO-328、 MDX-214、 tigapotide、 CAT-3888、 labetuzumab、 α- 颗粒 - 发射放射同位素连接的林妥珠单抗、 EM-1421、 HyperAcute 疫苗、 tucotuzumab 西莫白介素、 galiximab、 HPV-16-E7、 Javelin – 前列腺癌、 Javelin – 黑 素 瘤、 NY-ESO-1 疫 苗、 EGF 疫 苗、 CYT-004-MelQbG10、 WT1 肽、 oregovomab、 ofatumumab、 zalutumumab、 cintredekin besudotox、 WX-G250、 Albuferon、 aflibercept、 denosumab、 疫苗、 CTP-37、 efungumab 或 131I-chTNT-1/B。可用作蛋白治疗剂的单克隆抗体包括但不 限于莫罗单抗 -CD3、 abciximab、 依决可单抗、 达珠单抗、 gentuzumab、 阿仑单抗、 伊莫单抗 (ibritumomab)、 西妥昔单抗、 bevicizumab、 efalizumab、 阿达木单抗、 omalizumab、 莫罗单 抗 -CD3、 利妥昔单抗、 达珠单抗、 曲妥单抗、 帕利珠单抗、 巴利昔单抗和英夫利昔单抗。
通常， 将本发明化合物或组合物与细胞毒剂 / 细胞静止剂联合使用能够实现以下 目标 ： (1) 在减慢肿瘤生长中， 或甚至在消除肿瘤中， 与单独施用活性剂相比， 产生改进的效 力， (2) 以较低的量施用化疗剂， (3) 与用单一化疗剂和一些其他联合治疗相比， 提供被患者良好耐受并且产生较少有 害药理学并发症的化疗， (4) 在哺乳动物， 尤其是人中提供更宽的不同癌症类型治疗谱， (5) 在治疗的患者中， 提供更高的反应比例， (6) 比标准化疗相比， 在治疗的患者中提供更长的存活时间， (7) 对于肿瘤进展， 提供更长的时间， 和/或 (8) 与其中其他癌症治疗剂组合产生拮抗作用的已知情况相比， 产生至少与单独使用 的治疗剂所产生的效力和耐受性一样好的效力和耐受性。
增强细胞对放射的敏感性的方法 在本发明的另一个实施方案中， 本发明化合物可用于增强细胞对放射的敏感性。也就 是说， 在对细胞进行放疗之前， 与没有用本发明化合物进行处理的细胞相比， 用本发明化合 物处理细胞使得细胞更易于发生 DNA 损害和细胞死亡。在一个方面， 将细胞用至少一种本 发明化合物处理。因此， 本发明还提供了杀死细胞的方法， 其中给细胞施用一种或多种本发明化合 物与常规放疗。
本发明还提供了使细胞更容易发生细胞死亡的方法， 其中在处理细胞以引起或诱 导细胞死亡之前， 将细胞用一种或多种本发明化合物处理。在一个方面， 将细胞用一种或 多种本发明化合物处理之后， 用至少一种化合物或至少一种方法或其组合处理细胞以引起 DNA 损伤， 从而抑制正常细胞的功能或杀死细胞。
在一个实施方案中， 通过用至少一种 DNA 损害剂处理细胞来将细胞杀死。也就是 说， 在用一种或多种本发明化合物处理细胞以增强细胞对细胞死亡的敏感性之后， 将细胞 用至少一种 DNA 损害剂处理以杀死细胞。用于本发明的 DNA 损害剂包括但不限于化疗剂 ( 例如顺铂 )、 电离放射 (X- 射线， 紫外线放射 )、 致癌剂和诱变剂。
在另一个实施方案中， 通过用至少一种方法处理细胞以引起或诱导 DNA 损害来杀 死细胞。这样的方法包括但不限于当细胞信号传导途径被活化时导致 DNA 损害的细胞信号 传导途径活化， 当细胞信号传导途径被抑制时导致 DNA 损害的细胞信号传导途径抑制， 以 及诱导细胞中的生化改变， 其中所述改变会导致 DNA 损害。作为非限制性实例， 可以抑制细 胞中的 DNA 修复途径， 由此防止 DNA 损害的修复和导致细胞中 DNA 损害的异常积聚。
在本发明的一个方面， 在放疗或细胞中 DNA 损害的其他诱导之前， 给细胞施用本 发明化合物。在本发明的另一个方面， 伴随放疗或细胞中 DNA 损害的其他诱导， 给细胞施用 本发明化合物。在本发明的一个方面， 在放疗或细胞中 DNA 损害的其他诱导之后， 立即给细 胞施用本发明化合物。
在另一个方面， 细胞是在体外。在另一个实施方案中， 细胞是在体内。
如上所述， 已经令人惊奇地发现本发明化合物能够有效地抑制 allo-MEK， 并因此 可用于治疗或预防失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的细胞免疫反应或不适当的 细胞炎性反应的疾病， 或者伴随失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的细胞免疫反应 或不适当的细胞炎性反应的疾病， 特别是其中失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的 细胞免疫反应或不适当的细胞炎性反应是通过 allo-MEK 介导的那些疾病， 例如血液学肿 瘤， 实体瘤和 / 或其转移瘤， 例如白血病和骨髓增生异常综合征， 恶性淋巴瘤， 头和颈肿瘤， 包括脑肿瘤和脑转移瘤， 胸部肿瘤， 包括非小细胞和小细胞肺肿瘤， 胃肠道肿瘤， 内分泌肿 瘤， 乳腺肿瘤和其他妇科肿瘤， 泌尿系统肿瘤， 包括肾肿瘤、 膀胱肿瘤和前列腺肿瘤， 皮肤肿 瘤， 和肉瘤， 和 / 或其转移瘤。
根据本发明的另一个方面， 本发明包括用于治疗或预防如上所述疾病的如本文所 描述和定义的通式 (I) 化合物或其立体异构体、 互变异构体、 N- 氧化物、 水合物、 溶剂化物 或盐， 特别是其可药用盐， 或其混合物。
本发明的另一个方面是上述通式 (I) 化合物在制备用于治疗或预防疾病的药物 组合物中的应用。
在前面两个段落中提及的疾病是失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的细 胞免疫反应或不适当的细胞炎性反应的疾病， 或者伴随失控的细胞生长、 增殖和 / 或存活、 不适当的细胞免疫反应或不适当的细胞炎性反应的疾病， 特别是其中失控的细胞生长、 增 殖和 / 或存活、 不适当的细胞免疫反应或不适当的细胞炎性反应是通过 Mps-1 介导的那些 疾病， 例如血液学肿瘤， 实体瘤和 / 或其转移瘤， 例如白血病和骨髓增生异常综合征， 恶性淋巴瘤， 头和颈肿瘤， 包括脑肿瘤和脑转移瘤， 胸部肿瘤， 包括非小细胞和小细胞肺肿瘤， 胃 肠道肿瘤， 内分泌肿瘤， 乳腺肿瘤和其他妇科肿瘤， 泌尿系统肿瘤， 包括肾肿瘤、 膀胱肿瘤和 前列腺肿瘤， 皮肤肿瘤， 和肉瘤， 和 / 或其转移瘤。
如在本文中使用的， 在本发明上下文中， 特别是在 “不适当的细胞免疫反应或不 适当的细胞炎性反应” 中的术语 “不适当的” 优选理解为表示小于或大于正常反应， 并且与 所述疾病的病理学有关、 是造成所述疾病的病理学的原因或者导致所述疾病的病理学的反 应。
优选地， 所述应用是治疗或预防疾病， 其中所述疾病是血液学肿瘤， 实体瘤和 / 或 其转移瘤。
治疗高增殖病症的方法 本发明涉及使用本发明化合物及其组合物治疗哺乳动物高增殖病症的方法。 可以使用 化合物来抑制、 阻断、 减轻、 降低等细胞增殖和 / 和细胞分裂和 / 或产生程序化细胞死亡。 所 述方法包括给有此需要的哺乳动物， 包括人施用一定量的能有效治疗病症的本发明化合物 或其可药用盐、 异构体、 多晶型物、 代谢物、 水合物、 溶剂化物或酯等。高增殖病症包括但不 限于例如牛皮癣， keloids， 和影响皮肤的其他增生， 良性前列腺增生 (BPH)， 实体瘤， 例如乳 腺癌、 呼吸道癌、 生殖器官癌、 消化道癌、 泌尿道癌、 眼癌、 肝癌、 皮肤癌、 头颈癌、 甲状腺癌、 甲状旁腺癌和它们的远距离转移瘤。这些病症还包括淋巴瘤、 肉瘤和白血病。
乳腺癌的实例包括但不限于侵入性导管癌、 侵入性小叶癌、 原位导管癌和原位小 叶癌。
呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌， 以及支气管腺癌和胸膜 肺胚细胞瘤。
脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤， 小脑和大脑星形细胞瘤， 成 神经管细胞瘤， 室管膜瘤以及神经外胚层松果体肿瘤。
男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌症。 女性生殖器官肿瘤包括但不 限于子宫内膜癌、 子宫颈癌、 卵巢癌、 阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。
消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、 结肠癌、 结肠直肠癌、 食道癌、 胆囊癌、 胃癌、 胰 腺癌、 直肠癌、 小肠癌和唾液腺癌。
泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、 阴茎癌、 肾癌、 肾盂癌、 输尿管癌、 尿道癌和人乳 头状肾癌。
眼睛癌症包括但不限于眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤。
肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌 （有或者无纤维板层变体的肝细胞癌） 、 胆管细 胞癌 （肝内胆液管癌） 和混合肝细胞胆管细胞癌。
皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、 卡波济氏肉瘤、 恶性黑色素瘤、 默克尔细胞皮肤 癌和非黑素瘤皮肤癌。
头颈癌症包括但不限于喉癌、 下咽癌、 鼻咽癌、 口咽癌症、 唇癌和口腔癌以及鳞状 细胞癌。
淋巴瘤包括但不限于与 AIDS 相关的淋巴瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 皮肤 T 细胞淋巴瘤、 Burkitt 淋巴瘤、 霍奇金病和中枢神经系统的淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、 骨肉瘤、 恶性纤维组织细胞瘤、 淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。 白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、 急性淋巴母细胞性白血病、 慢性淋巴细 胞性白血病、 慢性骨髓性粒细胞性白血病和毛细胞白血病。
这些疾病已经在人类中得到了充分表征， 并且还以类似的病因存在于其它哺乳动 物中， 可以通过给药本发明的药物组合物对它们进行治疗。
在本文中使用的术语 “治疗” 是常用术语， 例如控制或照顾个体以对抗、 缓解、 减 轻、 解除或改善疾病或病症例如癌症的症状等。
治疗激酶病症的方法 本发明还提供了治疗与异常促分裂原细胞外激酶活性有关的病症的方法， 所述病症包 括但不限于中风、 心力衰竭、 肝肥大、 心肥大、 糖尿病、 阿尔茨海默病、 囊肿性纤维化、 异种移 植排斥的症状、 脓毒性休克或哮喘。
有效量的本发明化合物可用于治疗这样的病症， 包括在上文发明背景部分中提及 的疾病 （例如癌症） 。尽管如此， 这样的癌症和其他疾病可用本发明化合物治疗， 无论作用机 制和 / 或激酶与病症之间的关系如何。
短语 “异常激酶活性” 或 “异常酪氨酸激酶活性” 包括编码激酶的基因或其编码的 多肽的任何异常表达或活性。这样的异常活性的实例包括但不限于基因或多肽的过度表 达； 基因扩增 ； 产生组成型活性或过度激酶活性的突变 ； 基因突变、 缺失、 替代、 增加等。
本发明还提供了抑制激酶活性， 尤其是促分裂原细胞外激酶的活性的方法， 所述 方法包括施用有效量的本发明化合物， 包括其盐、 多晶型物、 代谢物、 水合物、 溶剂化物、 前 药 （例如酯） 和其非对映异构体形式。激酶活性可以在细胞中 （例如在体外） 抑制， 或者在需 要治疗的哺乳动物个体， 尤其是人患者的细胞中进行。
治疗血管生成病症的方法 本发明还提供了治疗与过度和 / 或异常血管生成有关的病症和疾病的方法。
血管生成的不适当以及异常表达可能对生物体是有害的。有多种病症与额外 血管的生长有关。这些病症包括例如糖尿病性视网膜病、 缺血性视网膜 - 静脉闭塞和 早 产 儿 视 网 膜 病 变 [Aiello 等 人 , New Engl. J. Med. 1994, 331, 1480; Peer 等 人 , Lab. Invest. 1995, 72, 638]， 老年黄斑变性 [AMD; 参见 , Lopez 等人 , Invest. Opththalmol. Vis. Sci. 1996, 37, 855]， 新血管性青光眼， 牛皮癣， 晶状体后纤维增生， 血管纤维瘤， 炎症， 类风湿性关节炎 (RA)， 再狭窄， 支架内再狭窄， 血管移植再狭窄等。 此外， 与癌性和肿瘤形成性组织有关的供血增加促进了生长， 导致快速的肿瘤增大和转移。 另外， 肿瘤中新血管和淋巴管的生长给背叛细胞提供了逃逸途径， 促使了癌症的转移和随和的扩 散。因此， 本发明化合物可以用于治疗和 / 或预防任何上述血管生成病症， 例如通过抑制和 / 或减轻血管形成 ； 通过抑制、 阻断、 减轻、 减少等内皮细胞增殖或牵涉血管生成的其他类 型， 以及引起这样的细胞类型的细胞死亡或细胞凋亡。
剂量和给药 基于已知用来评估用于治疗高增殖病症和血管生成病症的标准实验室技术， 可以容易 地确定用于治疗每一所关注适应症的本发明化合物的有效剂量， 所述技术是通过以下手段 来进行的 ： 标准毒性试验， 和用于确定哺乳动物中上述病症的治疗的标准药理学分析， 以及 将这些结果与用于治疗这些病症的已知药物的结果进行比较。 为了治疗这些病症当中的一
种而施用的活性组分的量可以根据这样的考虑事项而有很大不同， 例如所用的具体化合物 和剂量， 给药方式， 治疗持续时间， 所治疗患者的年龄和性别， 以及所治疗病症的性质和程 度。
欲施用的活性组分的总量通常为约 0.001 mg/kg- 约 200 mg/kg 体重 / 天， 优选为 约 0.01 mg/kg- 约 20 mg/kg 体重 / 天。临床上可用的给药方案从每天给药一至三次， 到每 四周给药一次。此外， 其中不给患者施用药物一段时间的 “药物假期” 对于药理作用与耐受 性之间的总体平衡可能是有益的。 单位剂量可以含有约 0.5 mg- 约 1500 mg 活性组分， 并且 可以每天给药一次或多次或者少于每天一次。通过注射， 包括静脉内、 肌内、 皮下和胃肠外 注射， 以及使用输注技术给予的平均日剂量优选为 0.01-200 mg/kg 总体重。通过直肠给予 的平均日剂量优选为 0.01-200 mg/kg 总体重。 通过阴道给予的平均日剂量优选为 0.01-200 mg/kg 总体重。 通过局部给药的平均日剂量优选为 0.1-200 mg， 每天给药 1-4 次。 透皮浓缩 物优选是维持 0.01-200 mg/kg 所需的量。通过吸入予的平均日剂量优选为 0.01-100 mg/ kg 总体重。
当然， 对于每一患者， 具体初始和持续剂量将根据以下因素而有所不同 ： 由临床诊 断医生所确定的病症的性质和严重程度， 所用具体化合物的活性， 患者的年龄和一般健康 状况， 给药时间， 给药途径， 药物的排泄速度， 药物联合等。 对于本发明化合物或其可药用盐 或酯， 所需的治疗方式和给药次数可以由本领域技术人员使用常规治疗试验来确定。
优选地， 所述方法的疾病是血液学肿瘤、 实体瘤和 / 或其转移瘤。
本发明化合物可以特别用于治疗和防止， 即预防肿瘤生长和转移， 尤其是所有适 应症和阶段的实体瘤， 进行或者不进行肿瘤生长的预先治疗。
测试特定药理学和药物学性质的方法是本领域技术人员众所周知的。
本文描述的实施例测试实验是为了举例说明本发明， 而不是将本发明限定到所给 出的实施例。
生物评估 本发明化合物的用途可以通过例如其在下面描述的体外肿瘤细胞增殖试验中的体外 活性来例证。本领域已经非常良好地建立了在体外肿瘤细胞增殖试验中的活性与在临床 中的抗肿瘤活性之间的联系。例如， 已经试验体外肿瘤增殖试验证实了泰素 (Silvestrini 等人 , Stem Cells 1993, 11(6), 528-35)、 泰索帝 (Bissery 等人 , Anti Cancer Drugs 1995, 6(3), 339) 和拓扑异构酶抑制剂 (Edelman 等人 , Cancer Chemother. Pharmacol. 1996, 37(5), 385-93) 的治疗用途。
本发明化合物活性的证实可以通过本领域众所周知的体外、 离体和体内试验来完 成。例如， 为了证实本发明化合物的活性， 可以使用下列试验。
生物试验 体外肿瘤细胞增殖试验 ： Cell Titer Glo 增殖试验 用于测试本发明化合物的粘着肿瘤细胞增殖试验涉及 Promega 开发的称为 Cell Titer-Glo 的读出 (Cunningham, BA “A Growing Issue: Cell Protiferation Assays. Modern kits ease quantification of cell growth”The Scientist 2001, 15(13), 26, 和 Crouch, S P 等人 ,,“The use of ATP bioluminescence as a measure of cellproliferation and cytotoxicity”Journal of Immunological Methods 1993, 160, 8 1-88)。
试验 1 ： HCT116 Cell Titer Glo (CTG) 增殖试验 ： 将 HCT116 细胞 [ 表达突变体 BRAF V600E 的人结肠直肠细胞系 ] 在于 37℃培养的加有 10% 胎牛血清 (FBS) 和稳定的谷氨酰胺的 100 µl/ 孔 DMEM 培养基 (DMEM/Ham’ s F12) 中， 以 3000 个细胞 / 孔的密度铺在 96 孔黑色透明底组织培养平板 (Costar 3603 黑色 / 透明底 ) 中。将姊妹孔铺在单独的平板中以进行时间零测定。将所有平板在 37℃培养过夜。记下时 间零平板 ： 将 100 µl/ 孔 CTG 溶液 (Promega Cell Titer Gio 溶液 ) 加到姊妹平板内的时 间零孔中 ； 将平板在轨道摇动器上混合 2 分钟以保证细胞裂解， 培养 10 分钟， 在 VICTOR 3 (Perkin Elmer) 上读取发光。细胞接种 24 小时后， 将测试化合物在 50 µl 培养基中稀释， 并且以高至 10 µM 和低至 300 pM 的终浓度加入， 终浓度取决于测试化合物在最终 DMSO 浓度 为 0.4% 的系列稀释液中的活性。加入测试化合物之后， 将细胞在 37℃培养 72 小时。然后 使用 Promega Cell Titer GIo Luminescent® 试验试剂盒， 将含有荧光素酶及其底物的 100 µl 裂解缓冲液， 虫萤光素混合物加到每个孔中， 并且在室温于黑暗中培养 10 分钟以稳定发 光信号。使用发光说明书 （Luminescence protocol） 将样本在 VICTOR 3 (Perkin Elmer) 上读数。通过将测量值归化至零点板的消光 (= 0%) 和未处理 (0 µM) 细胞 (= 100%) 的消 光来计算细胞生长的改变百分比。使用公司特有软件通过 4- 参数拟合来确定 IC50 值。
试验 2 ： A549 Cell Titer Glo (CTG) 增殖试验 ： 将 A549 细胞 [ 表达突变体 K-Ras G12S 的人非小细胞肺癌细胞系 ] 在于 37℃培养的 加有 10% 胎牛血清 (FBS) 和稳定的谷氨酰胺的 100 µl/ 孔 DMEM 培养基 (DMEM/Ham’ s F12) 中， 以 2000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔黑色透明底组织培养平板 (Costar 3603 黑色 / 透明底 ) 中。使用上述关于 HCT116 细胞所述的相同方案来进行 A549 细胞的 Cell Titer Glo 增殖试验。
试验 3 ： Colo205 Cell Titer Glo (CTG) 增殖试验 ： 在补充有 10% FBS 的 RPMI 1640 生长培养基中， 将 Colo205 细胞以 3,000 个细胞 / 孔 铺在 96- 孔组织培养平板中。将细胞在含有 5% CO2 的湿润培养器中于 37℃培养过夜。在 第二天， 将测试化合物加到孔中， 在含有 10% FBS 和 0.03% DMSO 的 RPMI 1640 培养基中进 行系列稀释， 并且在 37℃培养 72 小时。通过以下方法在不同时间碘 （0 和给予化合物后 72 小时） 评估细胞密度 ： 向每孔中加入 150 μl Cell Titer Glo 试剂 (cat# G7572, Promega, Madison WI)， 然后将平板在摇动器上于室温培养 10 分钟， 之后在 Victor3 仪器上读取发 光。使用用于 IC50 分析的 Analyze5 软件来进行数据分析。
试验 4 ： A375 Cell Titer Glo (CTG) 增殖试验 ： 将 A375 细胞 [ 表达突变体 BRAF V600E 的人恶性黑素瘤细胞 , ATCC # CRL-1619] 在于 37 ℃培养的加有 10% 胎牛血清 (FBS) 和稳定的谷氨酰胺的 100 µl/ 孔 DMEM 培养基 (Biochrom; FG0435; +3,7g/L 碳酸氢钠 ; + 4,5g/L D- 葡萄糖 ) 中， 以 3000 个细胞 / 孔的 密度铺在 96 孔黑色透明底组织培养平板 (Costar 3603 黑色 / 透明底 ) 中。将姊妹孔铺在 单独的平板中以进行时间零测定。将所有平板在 37℃培养过夜。记下时间零平板 ： 将 100 µl/ 孔 CTG 溶液 (Promega Cell Titer Gio 溶液 ) 加到姊妹平板内的时间零孔中 ； 将平板在 轨道摇动器上混合 2 分钟以保证细胞裂解， 培养 10 分钟， 在 VICTOR 3 (Perkin Elmer) 上读取发光。细胞接种 24 小时后， 将测试化合物在 50 µl 培养基中稀释， 并且以高至 10 µM 和 低至 300 pM 的终浓度加入， 终浓度取决于测试化合物在最终 DMSO 浓度为 0.4% 的系列稀释 液中的活性。加入测试化合物之后， 将细胞在 37℃培养 72 小时。然后使用 Promega Cell Titer GIo Luminescent® 试验试剂盒， 将含有荧光素酶及其底物的 100 µl 裂解缓冲液， 虫 萤光素混合物加到每个孔中， 并且在室温于黑暗中培养 10 分钟以稳定发光信号。使用发光 说明书 （Luminescence protocol） 将样本在 VICTOR 3 (Perkin Elmer) 上读数。通过将测 量值归化至零点板的消光 (= 0%) 和未处理 (0 µM) 细胞 (= 100%) 的消光来计算细胞生长 的改变百分比。使用公司特有软件通过 4- 参数拟合来确定 IC50 值。
或者， 通过结晶紫 (CV) 染色来测定细胞增殖 ： 试验 5 ： A375 结晶紫 (CV) 增殖试验 ： 通过结晶紫 (CV) 染色来测定 A375 细胞 [ 表达突变体 BRAF V600E 的人黑素瘤细胞 ] 的细胞增殖 ： 将培养的人 A375 细胞在 200 µl 生长培养基 ( 加有 10% FBS 和 2 mM 谷氨酰胺 的 DMEM / HAMS F12) 中以 1500 个细胞 / 测定点的密度铺在 96- 孔多滴度平板中。24 小时 后， 将平板 （零平板） 中的细胞用结晶紫染色 （见下文） ， 同时将其他平板中的培养基用新鲜 培养基 (200 µl) 替代， 所述新鲜培养基中已经加入了不同浓度的测试物质 (0 µM， 以及 0.3 nM - 30 µM ； 溶剂二甲亚枫的终浓度为 0.5%)。将细胞在测试物质存在下培养 4 天。通过 用结晶紫染色来测定细胞增殖 ： 在室温通过加入 20 µl/ 测定点 11% 戊二醛溶液来将细胞固 定 15 分钟。将固定的细胞用水洗涤三次之后， 将平板在室温干燥。通过加入 100 µl/ 测定 点 0.1% 结晶紫溶液 ( 通过加入乙酸将 pH 调节至 pH 3) 来将细胞染色。将染色的细胞用水 洗涤三次之后， 将平板在室温干燥。通过加入 100 µl/ 测定点 10% 乙酸溶液来将染料溶解。 通过在 595 nm 波长进行的光度法来确定消光。通过将测量值归化至零点板的消光 (= 0%) 和未处理 (0 µM) 细胞 (= 100%) 的消光来计算细胞生长的改变百分比。使用公司特有软件 通过 4- 参数拟合来确定 IC50 值。
或者， 可以如下所述进行结晶紫 (CV) 染色 ： 试验 6 ： A375 结晶紫 (CV) 增殖试验的另外的条件 ： 将培养的人 A375 细胞在 200 µl 生长培养基 ( 加有 10% FBS 和 2 mM 谷氨酰胺的 DMEM / HAMS F12 (Biochrom; FG4815)) 中以 1500 个细胞 / 测定点的密度铺在 96- 孔多滴度平 板中。24 小时后， 将平板 （零平板） 中的细胞用结晶紫染色 （见下文） ， 同时将其他平板中的 培养基用新鲜培养基 (200 µl) 替代， 所述新鲜培养基中已经加入了不同浓度的测试物质 (0 µM， 以及 0.3 nM - 30 µM ； 溶剂二甲亚枫的终浓度为 0.5%)。将细胞在测试物质存在下 培养 4 天。通过用结晶紫染色来测定细胞增殖 ： 在室温通过加入 20 µl/ 测定点 11% 戊二醛 溶液来将细胞固定 15 分钟。将固定的细胞用水洗涤三次之后， 将平板在室温干燥。通过加 入 100 µl/ 测定点 0.1% 结晶紫溶液 ( 通过加入乙酸将 pH 调节至 pH 3) 来将细胞染色。将 染色的细胞用水洗涤三次之后， 将平板在室温干燥。通过加入 100 µl/ 测定点 10% 乙酸溶 液来将染料溶解。通过在 595 nm 波长进行的光度法来确定消光。通过将测量值归化至零 点板的消光 (= 0%) 和未处理 (0 µM) 细胞 (= 100%) 的消光来计算细胞生长的改变百分比。 使用公司特有软件通过 4- 参数拟合来确定 IC50 值。
可以以类似于上述的方法测定另外的癌细胞系增殖的体外抑制。 示例性另外的肿 瘤细胞系的详情如下所述 ：此外， 使用下列试验来评估本发明化合物的生物重要性 ： 试验 6 MEK 生化试验 ： DELFIA 使用 DELFIA MEK 激酶试验来监测 MEK 抑制剂的活性。 如下所述在 96- 孔微滴度平板中 进行激酶反应 ： 首先将 70 μL 激酶反应缓冲液 (50mM HEPES pH 7.5, 5 mM NaF, 5 mM 甘 油磷酸酯 , 1 mM 钒酸钠 , 10 mM MgCl2, 1 mM DTT 和 1% (v/v) DMSO) 与 20 nM GST-MEK、 20 nM His-Raf 和 100 nM 生物素化 ERK1 ( 终浓度 ) 混合。然后加入终浓度为 1 μM、 0.3 μM、 0.1 μM、 0.03 μM、 0.01 μM、 0.003 μM、 0.001 μM、 0.0003 μM 和 0 μM 的化合物 以产生剂量反应抑制曲线。通过加入 20 μL ATP ( 终浓度 100 μM) 来开始反应。培养 2 小时后， 通过加入 20 μl 0.5 M EDTA 来终止反应。然后将 100 μL 该反应化合物转移到 96- 孔链霉抗生物素蛋白平板 (cat # 15120, Pierce Inc. Rockford, IL) 内， 之后培养 2 小时。收集生物素化的底物 ERK1 之后， 将平板用 TBST 洗涤。加入抗磷酸 -p44/42 MAPK 的 抗体 (cat# 91065, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA)， 并且与磷酸化底物结 合。然后与铕标记的抗 - 小鼠抗体 (cat# AD0124, Wallac Inc, Turku, Finland) 培养， 之后进行洗涤步骤。加入增强溶液以将铕离子离解到溶液内， 铕离子在溶液中与增强溶液 的组分形成高荧光螯合物。每一样本的荧光与激酶活性成正比， 在 VICTOR5 仪器 (Wallac
Inc.) 上计数。使用用于 IC50 分析的 Analyze5 软件来进行数据分析。
试验 7 MEK1 活化激酶试验 激酶 Cot1 通过将其活化环磷酸化来激活 MEK1。 使用在下面段落中描述的 HTRF 试验来 定量测定本发明化合物对于 MEK1 活化的抑制活性。
使用在昆虫细胞 (SF21) 中表达并且通过 Ni-NTA 亲和色谱纯化的人 Cot1 的 N- 末 端 His6- 标记的重组激酶域 ( 氨基酸 30 – 397, 购自 Millipore, cat. no 14-703) 作为 激酶。 使用无活性的 C- 末端 His6- 标记的 GST-MEK1 融合蛋白 (Millipore cat. no 14-420) 作为激酶反应的底物。
对于该试验， 将 50 nl 100 倍浓度的测试化合物在 DMSO 中的溶液用吸液管转移 到黑色低体积 384- 孔微滴度平板 (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) 内， 加 入 3 µl 24 nM GST-MEK1 和 166.7 µM 三磷酸腺苷 (ATP) 在试验缓冲液 [50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 2 mM 二硫苏糖醇 , 0.01% (v/v) Igepal CA 630 (Sigma), 5 mM β- 磷酸 - 甘油 ] 中的溶液， 将该混合物在 22℃培养 10 分钟， 以在激酶反应之前让测试化合 物与 GST-MEK1 预先结合。然后通过加入 2 µl Cot1 在试验缓冲液中的溶液来开始激酶反 应， 将所得混合物在 22℃培养 20 分钟的反应时间。根据酶批次的活性来调节 Cot1 在该试 验中的浓度， 并且选择合适的浓度以使得试验在线性范围内， 典型的酶浓度在约 2 ng/µl 范 围内 ( 在 5 µl 试验体积中的终浓度 )。 通过加入 5 µl HTRF 检测试剂 (13 nM 抗 GST-XL665 [# 61GSTXLB, Fa. Cis Biointernational, Marcoule, France], 1 nM Eu- 穴合物标记的 抗 - 磷酸 -MEK 1/2 (Ser217/221) [#61P17KAZ, Fa. Cis Biointernational]) 在 EDTA- 水 溶液 (100 mM EDTA, 500 mM KF, 0.2% (w/v) 牛血清白蛋白在 100 mM HEPES/ 氢氧化钠 pH 7.5 中的溶液 ) 中的溶液来停止反应。
将所得混合物在 22 ℃培养 2 小时以容许磷酸化 GST-MEK1 与抗 -GST-XL665 和 Eu- 穴合物标记的抗 - 磷酸 -MEK 1/2 抗体结合。然后通过测量共振能从 Eu- 穴合物标记的 抗 - 磷酸 -MEK 抗体向抗 -GST-XL665 的转移来评估 Ser217/Ser221- 磷酸化底物的量。 因此， 在 HTRF 读数器例如 Rubystar (BMG Labtechnologies, Offenburg, Germany) 或 Viewlux (Perkin-Elmer) 中， 在 350 nm 激发后， 测定在 620 nm 和 665 nm 的荧光发射。将在 665 nm 和 622 的发射的比例 nm 作为磷酸化底物的量的度量标准。 将数据归化 ( 没有抑制剂的酶反 应 = 0% 抑制， 有所有其他试验组分但是没有酶的反应 = 100% 抑制 )。通常， 将测试化合物 在 20 µM 至 1 nM 范围内的 10 个不同浓度下 (20 µM、 6.7 µM、 2.2 µM、 0.74 µM、 0.25 µM、 82 nM、 27 nM、 9.2 nM、 3.1 nM 和 1 nM, 在试验之前， 通过系列 1:3 稀释， 在 100 倍浓度贮备液 水平上制备的系列稀释液 ) 在同一微滴度平板上测定， 对于每一浓度， 采用一式两份的值， 使用内部软件通过 4 参数拟合来计算 IC50 值。
试验 8 磷酸 -ERK 机理试验 在 96- 孔组织培养平板内， 将 A375 和 Colo205 细胞以 25,000 个细胞 / 孔铺在补充 有 10% FBS 的 RPMI 1640 生长培养基中。将细胞在含有 5% CO2 的湿润培养器中于 37℃培 养过夜。在第二天， 为了制备试验平板， 将抗 - 兔中间比例发现 (Meso-Scale Discovery) Discovery (MSD) 平板 (cat# L41RA-1, Meso-Scale Discovery, Gaithersburg, MD) 用100 μl 5% MSD 封闭缓冲液于室温封闭 1 小时， 然后用 200 μl TBST 缓冲液洗涤 3 次。 向每个孔中加入以 1:200 在 2.5% MSD Blocker A-TBST 中稀释的磷酸 -ERK 兔多克隆抗体 (cat# 9101, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) (25 μl)， 然后在摇动下于 室温培养 1 小时。将平板用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤一次， 并且准备接受细胞裂解物。 在制备试验平板的同时， 向得自前一天的含有细胞的平板的孔中加入测试化合物， 在含有 10% FBS、 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.03% DMSO 的 RPMI 1640 培养基中进行系列稀释， 并且将平板在 37℃培养 1.5 小时。培养之后， 将化合物处理的平板用 PBS 洗涤 3 次， 在 30 μl Bio-Rad 裂解缓冲液 (cat #98601, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 中裂解， 然后在冰上摇动 30 分钟。然后将裂解物加载到磷酸 -ERK 包被的 MSD 平板上， 并且将平板 在 4℃培养过夜。第二天， 将平板用 TBST 洗涤 3 次， 向平板中加入 25 μl 1:3000 稀释的完 全 ERK 单克隆抗体 (Cat# 610123, BD Biosciences, San Diego, CA)， 然后在摇动下于室 温培养 1 小时。如上所述将平板用 TBST 洗涤 3 次之后， 向每个孔中加入 1:1000 稀释的 25 μl MSD 磺基 - 标记抗 - 小鼠抗体 (cat # R32AC-5)。将平板在室温于摇动下培养 1 小时， 然后用 TBST 洗涤 4 次。临读取平板之前， 加入 150 μl MSD Read 缓冲液 T， 立即在 MSD 仪 器上读取平板。使用用于 IC50 分析的 Analyze5 软件来进行数据分析。
试验 9 机理 pERK 试验的另外条件 为了测定肿瘤细胞系中的 ERK1/2 磷酸化， 使用单丛中间比例发现中间比例发现 (Mesoscale Discovery) (MSD) 试验。该试验的构建类似于夹层免疫试验。将从用系列稀 释的 MEK 抑制剂化合物处理的不同肿瘤细胞系产生的细胞裂解物加载到 MSD 平板上。样本 中存在的磷酸化 ERK1/2 与固定在工作电极表面上的捕获抗体结合。通过检测抗体与固定 的磷酸 -ERK1/2 的结合来完成夹层。用电化学发光化合物将检测抗体标记。给平板电极施 加电压引起标记物发射光， 该标记物经由抗体磷酸 -ERK1/2 夹层复合物与电极表面结合。 发射光的测定使得能够定量确定样本中存在的磷酸化 ERK1/2 的量。详细来说， 必须通过滴 定不同细胞数目来确定用于该试验的每一细胞系的测定磷酸 ERK 信号的线性范围。对于最 终的试验， 将之前确定数目的细胞接种到 96- 孔平板中。接种 24 小时后， 将细胞用系列稀 释的别构 MEK 抑制剂化合物处理 1.5 小时， 然后将细胞裂解， 并且将裂解物转移到 MSD 试验 平板中。在以下方面改变生产商的方案 ： 将磷酸化 ERK 与捕获抗体的结合步骤在 4℃进行 过夜， 而不是在室温进行 3 小时， 获得更好的信号强度。
在 96- 孔组织培养平板中， 将 A375 或 Colo205 细胞以 45000 个细胞 / 孔的密度 分别铺在补充有 10% FBS (Biochrom #S0410) 的 50 µL DMEM 生长培养基 (Biochrom FG 0435) (A375) 中， 和补充有 10% FBS (Biochrom #S0410)、 10 mM HEPES (Biochrom L1613)、 4.5 g/L 葡萄糖和 1 mM 丙酮酸钠的 (Biochrom L0473)RPMI 生长培养基 (Biochrom FG1215) (Colo-205) 中。将细胞在含有 5% CO2 的湿润培养器中于 37℃培养过夜。
根 据 生 产 商 的 说 明 来 通 过 中 间 比 例 发 现 (Mesoscale Discovery) (MSD) (# K111DWD) 试验测定磷酸 -ERK。简言之， 方案如下所述 ： 细胞接种后的第二天， 为了制备试验平板， 将 MSD 用 150 μl MSD 封闭缓冲液于室温封 闭 1 小时， 然后用 150 µl Tris 洗涤缓冲液洗涤 4 次。在制备试验平板的同时， 向得自前一 天的含有细胞的平板的孔中加入测试化合物， 在含有 10% FBS 和 0.1% DMSO 的各自生长培养基中进行系列稀释， 并且将平板在 37℃培养 1.5-2 小时。 培养之后， 将培养基用吸液管吸 出， 将细胞在 50 μl 裂解缓冲液中裂解， 然后在 4℃摇动 30 分钟。将 25 µL 裂解物加载到 封闭的 MSD 平板上， 并且将平板在 4℃培养过夜。第二天， 将平板用 Tris 洗涤缓冲液洗涤 4 次， 向平板中加入 25 μl 检测抗体溶液， 然后在摇动下于室温培养 1 小时。培养之后， 将平 板用 Tris 洗涤缓冲液洗涤 4 次， 加入 150 μl MSD Read 缓冲液 T， 立即在 MSD 仪器上读取 平板。使用用于 IC50 分析的内部软件来进行数据分析。
试验 10 体内效力试验 ： 分段人异种移植物模型 在使用任 BRAF 突变体黑素瘤和结肠癌的异种移植物模型的小鼠中评估先导化合物 的体内抗肿瘤活性。给雌性无胸腺 NCR 裸小鼠皮下移植得自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection) (ATCC, Maryland) 的人黑素瘤 (LOX) 或人结肠 (Colo205) 癌细胞系。当肿瘤达到大约 100mg 大小时， 开始治疗。化合物经口施用， 并且是 在 PEG/ 水 ( 分别 80%/20%) 中新制备的。监测小鼠的一般健康状况并且每天记录死亡率。 从治疗的第一天开始， 每周记录两次肿瘤尺寸和体重。根据 Bayer IACUC 指南对动物施以 安乐死。将产生大于 20% 致死率和 / 或 20% 净体重降低的治疗视为 ‘毒性的’ 。
每周使用电子测径器测定肿瘤生长三次， 根据以下公式计算肿瘤重量 (mg) ： [长 2 度 (mm)× 宽度 (mm) ]/2。抗肿瘤效力用肿瘤生长抑制 (%TGI) 来表示。使用以下公式在测 定的当天计算 TGI ： (100 – 治疗的平均肿瘤体积 (T)/ 对照肿瘤的平均值 (C)×100) = % T/C。在计算中使用的对照是 “未治疗对照” 或 “载体” ， 其都提供了数据的最保守呈现。表 现出 TGI 大于或等于 50% 的化合物视为有活性的。使用单尾或双尾 Student’ s T- 检验来 确定统计学显著性。所测试的化合物在 LOX 和 Colo205 模型中都表现出显著的剂量依赖性 肿瘤生长抑制。
使用一种或多种上述试验方法测试本发明化合物。
下表给出了在上述试验 1、 2 和 5 中获得的本发明化合物的 IC50 值， 以及现有技术 文件 WO 2008/138639 的化合物的 IC50 值 ：可以相信， 利用上述信息， 本领域技术人员可以以最充分地程度应用本发明。 对于 本领域技术人员而言， 显然可以对本发明进行不背离在此所述的本发明精神或者范围的情 况下， 对所公开的结构、 材料、 组合物和方法作出改变， 就象本文所陈述的那样， 并且这样的 变型视为在本发明范围内。 实施例中， 描述的化合物是为了作为本发明的典型代表， 并且应 当理解， 本发明范围不受实施例范围的限制。上面列出的主题标题是作为可从本申请中找 到的一些信息的指导， 而不是其中可以找到在这样主题上的信息的本申请中的唯一来源。 上面引用的所有出版物和专利都引入本文以供参考。
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