《一种高活性固定化酶块的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种高活性固定化酶块的制备方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102660535 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102660535 A *CN102660535A* (21)申请号 201210144352.5 (22)申请日 2012.05.11 C12N 11/14(2006.01) (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 黄积涛 邢达杰 黄薇 王缇媞 (54) 发明名称 一种高活性固定化酶块的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种制备高活性固定化酶块的 制备方法。所述的制备方法首先是制备出一种泡 沫状的碳块， 然后将多壁碳纳米管负载在泡沫状 碳块。
2、内部的孔道中， 最后将胰蛋白酶固定在碳纳 米管的表面上。泡沫状碳块孔道中的碳纳米管可 固定大量酶分子， 而泡沫状碳块孔道又为酶活性 部位周围底物的扩散和产物的释放提供了通道。 该酶块可在使用后取出， 无需分离工序， 并且在反 复使用中保持着酶活性。此酶固定化方法有望在 酶工程、 传感器、 燃料电池等领域得到应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法， 其特征在于 ： 所述的工艺方法首先是酚。
3、 醛树脂发泡和碳化为泡沫状碳块， 然后将多壁碳纳米管负载在碳块内部的孔道中， 最后将 酶固定在碳纳米管表面上， 形成碳纳米管 - 泡沫状碳块复合酶块。 2. 根据权利要求 1 所述的一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法， 其特征在于 ： 所 固定的酶是胰蛋白酶。 3. 根据权利要求 1 所述的一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法， 其特征在于 ： 复 合酶块的催化活性高于固定在泡沫状碳块上酶的活性， 也高于固定在玻碳片上酶的活性。 4. 根据权利要求 1 所述的一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法， 其特征在于 ： 在 80下复合酶块的催化活性高于溶液胰蛋白酶的活性。 5. 根据权利要求 1 。
4、所述的一种制备高活性块状固定化酶的工艺方法， 其特征在于 ： 所 制备酶块在使用后能方便取出， 不需要任何分离工序 ； 酶块反复使用 10 次， 酶活性的保留 不低于 80。 权 利 要 求 书 CN 102660535 A 2 1/3 页 3 一种高活性固定化酶块的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及酶的固定方法。具体是将酶分子固定在碳纳米管上， 再将碳纳米管固 定在泡沫状碳块的孔道内， 形成高酶负载量的复合酶块。 背景技术 0002 酶固定化是酶工程研究和应用最为重要的领域之一 (Liang J.F.etal.Pharm. Sci.2000， 89， 979-990 ； Asanomi。
5、 Y.etal.Molecules 2011， 16， 6041-6059 ； Zhang B.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012， 93， 61-70)。 它已经广泛地运用到化学化工、 生物技 术、 现代医药、 环境保护等行业。 0003 然而， 酶蛋白是非常脆弱的， 它们容易变性失活、 难以回收重复使用。 因此， 在工业 应用上酶通常被固定在载体上， 以便进行回收并改善在各种反应环境下的化学稳定性。那 些固定在载体上的酶还可以实现连续化反应。 上述优势能够有效降低生成单位产物酶的成 本， 特别是对于那些昂贵的酶达到了节约的目的。 0004 有两类载体 。
6、： 粒子和多孔材料。 粒径小的粒子有着更大的表面积， 酶的负载能力也 随之提高。但是， 它们更加难以分离、 回收和重新利用。多孔材料易于回收， 孔径越小酶负 载量越高， 但底物和产物在材料中的扩散同时也遇到更大的阻碍。 因此， 有效解决这一问题 需要设计出一种兼备高表面积和大孔径的块状载体。 0005 碳纳米管是一种拥有大表面积的纳米级柱状材料， 它已经在传感器 (Shi J.et al.Nanotechnology 2011， 22， 355502 ； Snchez S.et al.Analyst 2007， 132， 142-147 ； Joshi P.P.et al.Anal.Chem.。
7、2005， 77， 3183-3188) 和燃料电池 (Miyake T.et al.J.Am. Chem.Soc.2011， 133 ： 5129-5134 ； Zebda A.et al.Nat.Commun.2011， 2， 370) 上得到了广泛 的应用。 然而， 游离碳纳米管虽然可利用过滤等手段进行分离， 但固定在碳纳米管上的酶的 可回收性还没有被工业应用广泛接受。 0006 本发明提供了一种新型载体的制备方法， 该载体是将泡沫状碳块与碳纳米管的特 性结合起来用于酶的固定化， 它在形态上兼备了碳纳米管的特点 ( 如高酶负载量 ) 和泡沫 状碳块性质 ( 如低扩散阻力 )。不仅如此， 。
8、这种复合酶块可直接从溶液中取出， 不需要任何 分离工序。 发明内容 0007 本发明的目的之一是提供一种兼备高比表面和低扩散阻力的载体。 它可以与酶分 子牢固结合， 由此获得较高的酶催化活性和稳定性。 0008 本发明的目的之二是制备一种具有高催化活性的固定化酶块。 这种复合酶块使用 简便， 使用后不需要分离和再生工序就能够重新利用。 0009 为了达到上述目的， 本发明首先将碳纳米管固定在泡沫状碳块的孔道内， 再将酶 进一步固定在碳纳米管的表面上， 这样就获得了一种兼有微米结构和纳米结构的材料。其 中， 泡沫状碳块的微米孔道可以减低传质阻力， 使底物容易扩散到酶活性部位同时使产物 说 明 书。
9、 CN 102660535 A 3 2/3 页 4 易于释放。碳纳米管的表面可负载大量的酶分子， 而酶块作为一个整体又能够方便地从酶 催化反应溶液中取出， 重新使用。 0010 这种复合酶块需要三个步骤进行制备。具体工艺如下 ： 0011 在加压的条件下， 将酚醛树脂溶液用乌洛托品进行交联， 并逐渐释放压力使聚合 物粘流液发泡。随着聚合物浓度的增加和逐渐固化， 气泡被固定在聚合物中形成气孔。继 续升高温度， 使聚合物熟化和硬化。 聚合物在更高的温度下绝氧碳化， 成为多孔的泡沫状碳 块。 0012 将碳纳米管用硝酸和硫酸进行氧化， 得到在外壁上带有羧基的碳纳米管。用氧化 碳纳米管的分散液孵育泡沫。
10、状碳块， 碳纳米管就会牢固地固定在泡沫状碳块的内部孔道 中， 并形成一定的共价连接。 0013 将缓冲液中酶分子 ( 如胰蛋白酶 ) 进一步对新制得的碳纳米管 - 泡沫状碳块载体 进行孵育， 酶被固定在碳纳米管外壁上， 形成了酶块。 0014 所制成的酶块具有高酶负载量和低底物扩散阻力， 因此赋予了较高的催化活性。 以考马斯亮蓝法检验酶的负载效果， 结果显示支载着碳纳米管的泡沫状碳块的负载量是泡 沫状碳块的 228.3， 是玻碳片的 2838.5。用 N- 苯甲酰 -DL- 精氨酸 -p- 硝基苯胺的 水解反应来估算固定化胰蛋白酶的催化活性。以分光光度计在 410nm 处监测 p- 硝基苯胺 。
11、的阴离子的形成。结果表明， 固定在碳纳米管 - 泡沫状碳块上的胰蛋白酶的活性是泡沫状 碳块的 252.2， 是具有光滑表面的玻碳片的 3552.6。 0015 与其他固定酶一样， 固定在碳纳米管 - 泡沫状碳块上的胰蛋白酶的热稳定性高于 相应的溶液酶。在 80下， 溶液酶几乎丧失了活性 ( 仅残留全活性的 1.5 )， 而固定酶在 此温度下的活性残留为 71。 0016 此外， 该酶块不需要任何分离过程就可重新使用， 这样就简化了化工操作的程序。 由于大部分酶分子埋藏在多孔载体的内部， 因此刮擦也不能使它们脱落。 0017 本发明的优点在于 ： 0018 1. 本发明所述的方法可制造出一种酶负。
12、载量大， 可接近性好的载体。 0019 2. 该固定化酶具有催化活性高和热稳定性好的特点。催化反应后可直接从 0020 溶液中取出重新使用， 不需要分离过程。 0021 3. 本发明所述的方法可用于生物传感器和生物燃料电池的电极。 附图说明 0022 图 1 是碳纳米管修饰泡沫状碳块的 SEM 谱图。图中显示出泡沫碳块表面上的一个 孔洞的洞口。整个碳块表面被碳纳米管所覆盖。 具体实施方式 0023 实施例 1 ： 0024 泡沫状碳块制备 ： 将 60g 酚醛树脂粉末和 5g 乌洛托品溶于 200mL 的乙醇中。溶 液在高压釜中以 0.2 /min 的速率加热到 160， 并在 160和 1.。
13、6MPa 的氮气压力下保温 8h 进行交联反应。然后在 160下以 0.2MPa/h 的速率释放高压釜中气体， 使聚合物发泡。 当压力减至常压后， 将样品加热到 350， 并在此温度下保持 6h 以熟化。在氩气保护下以 说 明 书 CN 102660535 A 4 3/3 页 5 5 /min 的加热速率升温到 800进行碳化， 保温 3h 后得到泡沫状碳块。 0025 实施例 2 ： 0026 碳纳米管的功能化 ： 将200mg多壁碳纳米管悬浮于150mL浓硫酸和50mL浓硝酸的 混酸溶液中， 在超声清洗机中振荡 20min。回流 3h。将悬浮液用水稀释， 并用在 0.2m 的 聚碳酸酯膜过。
14、滤， 洗涤以除去酸。上述超声 / 过滤步骤重复 3 次。 0027 实施例 3 ： 0028 碳纳米管 - 泡沫状碳块的制备 ： 将泡沫状碳块在真空下灌注 0.2mg 碳纳米管的 5mL 水溶液。体系超声振荡 5 次， 每次 20min。碳块继续在碳纳米管溶液中孵育 20h。结合 了碳纳米管的泡沫状碳块用水反复洗涤 5 次， 真空干燥。 0029 实施例 4 ： 0030 胰蛋白酶在复合酶块中的固定化 ： 通过将冻干酶溶解到磷酸盐缓冲液 (10mmol/ L， pH 7.0) 中来制备 2mg/mL 胰蛋白酶的水溶液。在 4下将碳纳米管 - 泡沫状碳块在 5ml 的胰蛋白酶溶液中孵育过夜。而后。
15、， 取出固定着胰蛋白酶的碳块， 用水洗涤 3 次， 使用前在 4下储存。利用 Bradford 方法 (Kruger NJet al.， Methods Mol.Biol.1994， 32， 9-15) 测 定固定前后胰蛋白酶溶液的蛋白质浓度， 用蛋白质浓度的之差来计算胰蛋白酶的负载量。 0031 实施例 5 ： 0032 催化活性检测 ： 利用N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺作为底物来测量胰蛋 白酶的活性。来自牛胰脏的胰蛋白酶催化这一底物的水解， 释放出的 p- 硝基苯胺在 410nm 处有吸收峰。通过测量反应混合物在 410nm 处的吸收随时间的变化来估算酶的活性。 说 明 书 CN 102660535 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102660535 A 6 。