一种鋯基亲水色谱柱的制备方法及其在测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量中的应用.pdf

本发明公开了一种鋯基亲水作用色谱柱及其在测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量中的应用。通过用1％三氯乙酸-乙睛溶液超声、振荡、离心提取样品中的三聚氰胺，然后用锆基亲水作用色谱对经0.2μm滤膜过滤的样品液进行HPLC或LC-MS/MS分离分析。利用该色谱柱测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量，方法简便、快速、灵敏、准确、重复性好，检测成本低；该分离模式有利于样品制备，使样品预处理操作简便、快速、回收率高、对分析测定无干扰，样品可以大批量处理，节省时间和测定成本；色谱柱使用寿命长。各项指标均优于GB/T22388-2008方法。本发明可广泛用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的检测。

权利要求书一种鋯基亲水色谱柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将颗粒分布均匀、直径3～5μm的硅胶微米球颗粒置于6mol/L的盐酸溶液中超声0.5～2h，进行活化预处理，过滤，用蒸馏水充分洗涤至无氯离子存在，干燥；
(2)将步骤(1)处理过的硅胶微米球放入浓度为0.001～0.12mol/L十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，磁力搅拌或超声0.5～3h，过滤、洗涤、干燥，得到在硅球表面被膜一层表面活性剂的复合物(SiO2‑SDS)；
(3)将步骤(2)得到的复合物(SiO2‑SDS)置入锆溶液或锆溶胶中，磁力搅拌或超声0.5～3h，静置、过滤、洗涤、干燥，得到组装一层纳米氧化锆的复合物(SiO2‑SDS‑ZrO2)；
(4)将上述复合物(SiO2‑SDS‑ZrO2)重复步骤(2)、(3)操作4～8次，得到组装多层纳米氧化锆的复合物微米球；
(5)将步骤(4)得到的在硅球表面组装了多层氧化锆的复合物微米球在500～600℃灼烧，得到表面多层纳米氧化锆包覆微米硅球，经进一步浮选得到颗粒均匀的核壳型锆基亲水作用色谱填料，即为Zr/Si HILIC；
(6)将步骤(5)制备的ZrO2/SiO2微球，以四氯化碳为匀浆液、甲醇为顶替液，匀浆法装入色谱柱中，色谱柱标记为：HBSD‑Zr/Si HILIC柱。
如权利要求1所述的鋯基亲水色谱柱在测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量中的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)样品预处理
取1g液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖中的一种试样置于50mL具有塞子的塑料离心管中，向离心管内加入8mL质量浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，取1mL上清液用0.2μm滤膜过滤，待HPLC测定；
或取奶酪、奶油和巧克力其中一种试样1g置于研钵中，加入5g海砂研磨成干粉状，定量转移至50mL具塞塑料离心管中，向离心管内加入8mL质量浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，取1mL上清液用0.2μm滤膜过滤，待HPLC测定；
(2)高效液相色谱分离分析
色谱条件如下：
色谱柱：HBSD‑Zr/Si HILIC柱100×4.6mm
流动相：0.05M磷酸盐缓冲液∶乙腈＝90∶10
流速1.0mL/min
检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器
波长240nm
进样量：20μL
柱温：室温
(3)三聚氰胺标准曲线的绘制
准确称取100mg三聚氰胺标准品置于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4°C避光保存；
准确移取标准储备液，用流动相稀释定容，得到浓度为0.2，0.8，2.0，20.0，40.0，80.0，120.0，150.0g/mL的标准溶液系列，按浓度由低到高依次进样进行HPLC分离测定，以峰面积A对浓度C作图，得一条直线，为三聚氰胺的标准曲线；
(4)样品定量测定
待测样品经步骤(1)程序进行样品预处理后，在与绘制标准曲线完全相同的色谱条件下进行HPLC分析，待测样液中三聚氰胺的响应值在标准曲线线性范围内，超过线性范围必须稀释后再进样分析。

说明书一种鋯基亲水色谱柱的制备方法及其在测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量中的应用
技术领域
本发明涉及一种鋯基亲水作用色谱柱的制备方法及其在测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量中的应用，属于色谱检测技术领域。
背景技术
色谱柱是色谱的“心脏”。理想的色谱柱应该具有良好的化学稳定性、渗透性；另外，色谱柱的柱寿命要长，这样就能充分保障色谱数据的重复性；最重要的是，色谱柱对待测组分要有适当的保留作用，容量因子k’在2～10范围内为宜。
三聚氰胺是一种化工原料，因分子中含氮量高，称为“蛋白精”。乳制品中如果含有三聚氰胺，可能会导致婴幼儿尿结石、肾衰竭等严重疾病，甚至死亡。2008年中国爆发三聚氰胺毒奶粉事件后，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会颁布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T22388‑2008)。该标准包括三个方法：高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱‑质谱/质谱法(LC‑MS/MS)和气相色谱‑质谱联用法(GC‑MS和GC‑MS/MS)。
三聚氰胺极性强，易解离成离子，所以在传统色谱柱C8柱和C18柱上不被保留。GB/T22388‑2008HPLC法中采用离子对色谱法解决这一问题，但是离子对试剂的加入不但增加检测费用，而且会造成基线漂移，影响检测结果的灵敏度和准确性。更重要的是这种分离模式需要的样品预处理操作非常烦琐，周期冗长，检测效率低，有机试剂用量大，有些步骤还会导致假阳性结果出现。因此研究开发简便、快速、灵敏、准确、适用于HPLC检测食品中三聚氰胺的方法，对维护食品安全，保护人民的身体健康和消费者的合法权益，促进食品行业的快速健康发展具有重要意义。
色谱实践表明：亲水作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)能有效保留反相色谱中保留弱或不保留的强极性物质。本发明采用锆基亲水作用色谱法测定原料乳及乳制品中三聚氰胺的含量。
发明内容
本发明目的是提供一种性能良好的鋯基亲水作用色谱柱。
本发明目的之二是提供一种鋯基亲水作用色谱柱的应用，也就是提供一种简便、快速、准确测定乳制品中三聚氰胺的HPLC方法。
具体的，本发明所说的鋯基亲水作用色谱柱的制备方法，包括以下步骤：
(1)将颗粒分布均匀、直径3～5μm的硅胶微米球颗粒置于6mol/L的盐酸溶液中超声0.5～2h，进行活化预处理，过滤，用蒸馏水充分洗涤至无氯离子存在，干燥；
(2)将步骤(1)处理过的硅胶微米球放入浓度为0.001～0.12mol/L十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，磁力搅拌或超声0.5～3h，过滤、洗涤、干燥，得到在硅球表面被膜一层表面活性剂的复合物(SiO2‑SDS)；
(3)将步骤(2)得到的复合物(SiO2‑SDS)置入锆溶液或锆溶胶中，磁力搅拌或超声0.5～3h，静置、过滤、洗涤、干燥，得到组装一层纳米氧化锆的复合物(SiO2‑SDS‑ZrO2)；
(4)将上述复合物(SiO2‑SDS‑ZrO2)重复步骤(2)、(3)操作4‑8次，得到组装多层纳米氧化锆的复合物微米球；
(5)将步骤(4)得到的在硅球表面组装了多层氧化锆的复合物微米球在500～600℃灼烧，得到表面多层纳米氧化锆包覆微米硅球，经进一步浮选得到颗粒均匀的核壳型锆基亲水作用色谱填料，即为Zr/Si HILIC。
(6)将步骤(5)制备的Zr/Si HILIC微球，以四氯化碳为匀浆液、甲醇为顶替液，匀浆法装入色谱柱中，色谱柱标记为：HBSD‑Zr/Si HILIC柱。
本发明提供的一种鋯基亲水作用色谱柱的应用，具体就是在测定原料乳及乳制品中三聚氰胺含量中的应用，通过以下步骤来实现：
(1)样品预处理
液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等其中一种，取1g(精确至0.0001g试样置于50mL具有塞子的塑料离心管中，向离心管加8mL质量浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，取1mL上清液用0.2μm滤膜过滤，待HPLC测定；或者取：
奶酪、奶油和巧克力等其中一种，称取1g(精确至0.0001g)试样于研钵中，加入5g海砂研磨成干粉状，定量转移至50mL具塞塑料离心管中，向离心管加8mL质量浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，取1mL上清液用0.2μm滤膜过滤，待HPLC测定；
(2)高效液相色谱分离分析
条件如下：
色谱柱：HBSD‑Zr/Si HILIC柱(100×4.6mm)
流动相：0.05M磷酸盐缓冲液(pH＝3.0)∶乙腈＝90∶10(V/V)
流速1.0mL/min
检测器：紫外检测器(或二极管阵列检测器)
波长240nm
进样量：20μL
柱温：室温
(3)三聚氰胺标准曲线的绘制
准确称取100mg三聚氰胺标准品置于100mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4°C避光保存。
准确移取标准储备液，用流动相稀释定容，得到浓度为0.2，0.8，2.0，20.0，40.0，80.0，120.0，150.0g/mL的标准溶液系列。按浓度由低到高依次进样进行HPLC分离测定，以峰面积A对浓度C作图，得一条直线如图1所示，为三聚氰胺的标准曲线。
(4)样品定量测定
待测样品经步骤(1)程序进行样品预处理后，在与绘制标准曲线完全相同的色谱条件下进行HPLC分析。待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围必须稀释后再进样分析。
本发明取得以下有益效果：
1、本发明使用锆基亲水作用色谱柱，能有效保留三聚氰胺。相对于GB/T22388‑2008HPLC法，本发明分析操作中无需添加离子对试剂，可降低检测成本30％，节省分析时间20％。2、样品预处理操作简便、快速：本发明方法由于采用锆基亲水作用色谱分离模式，共存杂质在色谱柱上无保留，因此提取液不需要进一步净化，经过膜后可直接进HPLC仪器进行测定。省略了过滤、固相萃取净化和氮气吹干等繁琐步骤，使样品预处理所需时间短，有机溶剂用量少。与国标方法相比，单一样品处理可降低50％的成本，节省60％的处理时间。3、样品可以批量处理，一次可同时进行12个样品的处理，节省时间，成本降低。4、回收率高：因为样品预处理步骤少，可减少处理过程中的样品损失。本发明方法在1mg/kg，10mg/kg和100mg/kg三个不同浓度水平下的加标回收率在93‑105％之间。5、方法灵敏度高：GB/T22388‑2008HPLC法中，由于流动相中离子对试剂的加入加大了基线噪声，使检测灵敏度降低，检测定量限为2mg/kg。本发明方法流动相组成简单，基线平稳、噪声小，使其检测灵敏度增加，检测定量限为0.01mg/kg。6、精密度高：相对标准偏差小于3％。7、流动相组成简单，与质谱兼容：本发明的色谱柱及色谱条件可直接用于LC‑MS/MS分析测定。8、色谱性能稳定，色谱柱使用寿命长：本发明方法由于流动相极性大，可将提取液中的杂质脱除掉，不会累积在色谱柱上，所以色谱性能稳定。另外由于色谱柱固定相是不经修饰的Zr/Si HILIC填料，色谱柱可以用强酸强碱冲洗。色谱柱可永远使用。9、重复性好：拥有一根HBSD‑Zr/Si HILIC色谱柱，可永远使用，充分保证色谱数据(保留时间、峰面积、定性、定量)的重复性。
附图说明
图1是三聚氰胺标准曲线。
图2是三聚氰胺阴性样品色谱峰图。
图3是三聚氰胺阳性样品色谱峰图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例1锆基色谱柱的制备和三聚氰胺的分离
将经仔细筛选的颗粒直径为3.5μm(s＝0.30)的硅胶微米球置于6mol/L的盐酸溶液中超声0.5h进行活化预处理，抽滤、洗涤、干燥。将经活化预处理过的硅胶微米球放入0.1mol/L的锆溶液中磁力搅拌1.5h进行自组装，得到在硅球表面组装一层氧化锆纳米颗粒的复合物SiO2‑ZrO2，抽滤，洗涤，干燥；反复上述操作四次。经500℃灼烧，即可制得核‑壳型ZrO2/SiO2微球，将ZrO2/SiO2微米球进一步浮选后得到Zr/Si HILIC。经分析表征：Zr/Si HILIC粒径3.7μm(s＝0.31)，圆筒状中孔结构，比表面积为168.1m2/g，孔体积0.377cm3/g，孔径8.5nm，渗透性与硅胶接近，在pH＝1‑12范围内化学性质稳定，实验数据表明：Zr/Si HILIC是一种较为理想的锆基色谱填料。
用匀浆法将本实施例制备的Zr/Si HILIC装入100×4.6mm色谱柱中，得到本发明的产品HBSD‑Zr/Si HILIC色谱柱。在流动相0.05M磷酸盐缓冲液(pH＝3.0)∶乙腈＝90∶10(V/V)时，三聚氰胺的保留时间为3.210min，容量因子k’为3.7。
实验说明：HBSD‑Zr/Si HILIC是一种亲水作用色谱柱，特别适合于强极性和亲水性化合物的分离分析。对三聚氰胺的保留适中(2＜k’＜10)，非常适用于三聚氰胺的含量的测定。
实施例2空白实验
于50mL具塞塑料离心管中加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，取1mL上清液用0.2μm滤膜过滤。室温下进行HPLC测定，用标准曲线法定量。结果未检出三聚氰胺。
空白实验表明：样品处理过程对三聚氰胺的测定无干扰。
实施例3阴性样品及检测定量限的确定
准确称取1g(精确至0.0001g)奶粉阴性样品于50mL具塞塑料离心管中，向离心管加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，室温下进行HPLC测定。用标准曲线法定量，结果未检出三聚氰胺(见图2)。
向100g奶粉阴性样品中准确添加0.0100g三聚氰胺标样，充分混匀。准确称取样品1g(精确至0.0001g)于50mL具塞塑料离心管中，采用如上方法提取，以该提取溶液作为母液，逐级稀释进行测定，按10倍信噪比，确定该方法检测定量限为0.01mg/kg。
实施例4阳性对照品
准确称取1g(精确至0.0001g)三聚氰胺含量为113.96mg/kg的奶粉样品(河北省进出口检验检疫局提供)于50mL具塞塑料离心管中，向离心管加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，室温下进行HPLC测定。平行测定3次，用标准曲线法定量。测定结果为：三聚氰胺的含量为117.28mg/kg，相对误差为2.91％。
阳性对照品实验表明：本发明方法准确度高。
实施例5方法的加标回收率和精密度
准确称取1g(精确至0.0001g)奶粉阴性样品三份于50mL具塞塑料离心管中，分别向其中定量加入20μL、0.2mL和2.0mL浓度为50.0μg/mL的三聚氰胺标准溶液，与样品混匀。向离心管加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，室温下进行HPLC测定。先进行标准曲线绘制，然后进行样品测定，每个样品平行测定6次，用标准曲线法定量，测定1mg/kg，10mg/kg和100mg/kg三个不同添加水平的回收率。
实验结果表明：3个浓度水平下的平均加标回收率在93‑105％之间。相对偏差均小于3％。
实施例6与GB/T22388‑2008国标方法对照
(1)本发明方法
取2g(精确至精确至0.01g)奶粉阴性样品于50mL具塞塑料离心管中，准确移取浓度为20.0μg/mL的三聚氰胺标准溶液10μL于离心管中，与样品混匀。向离心管加15mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以4500r/min的转速离心10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，室温下进行HPLC测定。色谱条件为：HBSD‑Zr/Si HILIC(100×4.6mm)，流动相为0.05M磷酸盐缓冲液(pH＝3.0)∶乙腈＝90∶10，流速1.0mL/min，进样量20μL，紫外检测器，波长240nm。先进行标准曲线绘制，然后进行样品测定，平行测定3次，用标准曲线法定量，测定结果为：0.103mg/kg。
(2)GB方法
取2g(精确至精确至0.01g)奶粉阴性样品于50mL具塞塑料离心管中，准确移取浓度为20.0μg/mL的三聚氰胺标准溶液10μL于离心管中，与样品混匀。向离心管加15ml浓度为1％的三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min，以4500r/min的转速离心5min。上清液经1％的三氯乙酸溶液湿润的滤纸过滤、洗涤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL。移取滤液5mL，加入5mL水混匀，做待净化液。将净化液转移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干时，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。洗脱液于50C°下用氮气吹干，残留物用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过0.2μm微孔滤膜后，进行HPLC测定。色谱条件：色谱柱C18柱(250×4.6mm)，流动相：10mmol辛烷磺酸钠∶乙睛＝90∶10，流速1.0mL/min，进样量20μL，紫外检测器，波长240nm，温度：室温。先进行标准曲线绘制，然后进行样品测定，平行测定3次，用标准曲线法定量。测定结果为：未检出。
结论：与国标方法相比，本发明方法更简便、快速、灵敏、准确。
实施例7LC‑MS/MS
取1g(精确至0.0001g)三聚氰胺含量为113.96mg/kg的奶粉样品(河北省进出口检验检疫局提供)于50mL具塞塑料离心管中，向离心管加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤。室温下进
行LC‑MS/MS测定。色谱条件为：色谱柱Zr/Si HILIC(120×4.6mm)，流动相pH＝4.5，10mmol/L乙酸铵缓冲溶液与乙腈比例为90∶10，流速为0.4ml/min，柱温为室温，进样量：10μL。质谱条件为：干燥气温度350℃，流速5L/min、喷雾器气压30psi，碰撞能量20V。以丰度最强的碎片离子85.1为定量离子，以丰度次强的碎片离子68.1为定性离子。平行测定3次，测定结果为：116.39mg/kg。
实验结果表明：本发明的锆基亲水作用色谱柱和本发明的样品预处理操作能够满足GB/T22388‑2008第二法LC‑MS/MS的应用。
实施例8含乳制品，固体
准确称取艾诗浓酸奶巧克力(生产批号：6933186201593)样品1g(精确至0.0001g)于研钵中，加入5g海砂研磨成干粉状，定量转移至50mL具塞塑料离心管中。于离心管中加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，室温下进行HPLC测定，外标法定量。检测结果：未检出三聚氰胺。
实施例9液态奶
准确称取伊利纯牛奶(生产批号：20101011NW21C1)样品1g(精确至0.0001g)于50mL具塞塑料离心管中，向离心管加8mL浓度为1％的三氯乙酸溶液和2mL乙腈，超声提取10min，振荡提取10min，以大于4500r/min的转速离心10min，上清液经0.2μm滤膜过滤，室温下进行HPLC测定，外标法定量。平行测定3次。测定结果为：未检出。本发明并不限于上述的实施例。
本发明所建立的方法测定了液态奶、奶粉、酸奶、奶糖、雪糕、豆奶、奶酪和炼奶等多种产品。可广泛用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的检测。
实验结果表明：在各个可量化的指标上本发明方法都展现出国标方法GB/T22388‑2008不可比拟的优势。