一种通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法.pdf

本发明涉及一种含有人类生物活性物质组合物的制造方法，特别是人类生物活性物质来源于永生化细胞。具体来说，本发明提供了一种采集自体细胞制作的永生化细胞，在适当的培养基和培养条件下获得人类生物活性物质组合物，此生物活性物质组合物可用作个性化化妆品的原料或添加剂，供美容及皮肤保养使用。本化妆品组合物中的生物活性物质组合物来源于人体细胞，与人体自身的生物活性物质具有一致的三维结构和生物活性，具有确定的安全性，较好的皮肤相容性，能有效获得细胞生长因子等生物活性物质，具有提高细胞胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用。本化妆品组合物预期能够用于抗皱，美化皮肤，创伤愈合，去除疤痕。

1.  一种通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤： 
a，制作永生化细胞； 
b，在无血清培养基中扩大培养所述永生化细胞； 
c，通过中空纤维超滤系统分离纯化生物活性物质； 
d，对上述分离纯化的生物活性物质进行检测。 

2.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述生物活性物质是通过永生化细胞获得的。 

3.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述生物活性物质组合物包含细胞生长因子和端粒酶。 

4.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述永生化细胞在无血清培养基中进行扩大培养。 

5.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于扩大培养永生化细胞过程中添加物质为玻璃珠，重组人EFG、硫辛酸、L-抗坏血酸、胆钙化固醇的一种或多种的组合。 

6.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述生物活性物质组合物是通过中空纤维超滤系统进行分离纯化。 

7.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述生物活性物质组合物具有提高成纤维细胞胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用。 

8.  根据权利要求1所述的通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其特征在于所述的生物活性物质组合物在制作化妆品中的用途。 

9.  根据权利要求8所述的生物活性物质组合物在制作化妆品中的用途，其特征在于包含在永生化细胞培养基中的生物活性物质组合物制作的化妆品。 

10.  根据权利要求8所述的生物活性物质组合物在制作化妆品中的用途，其特征在于所制备100g水剂化妆品按常规方法由下述质量配比的原料组成： 
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一种通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法
技术领域
本发明涉及一种含有人类生物活性物质组合物的制造方法，特别是人类生物活性物质来源于永生化细胞。具体来说，本发明提供了一种采集自体细胞制作的永生化细胞，在适当的培养基和培养条件下获得人类生物活性物质组合物，获取的人类生物活性物质组合物经分离提取后可用于个性化化妆品供美容及皮肤保养使用。 
背景技术
正常组织来源的细胞在通常的体外培养条件下生长、分裂，经过有限次的细胞传代后就会停止增殖，出现衰老和死亡。永生化细胞是实现了永生化(immortalization)的细胞，则具有无限分裂和增殖的能力，如生殖细胞、干细胞、肿瘤细胞和外源性基因转染而构建的永生化细胞等。通常意义的永生化细胞是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力一类细胞，这样的细胞群体称为永生化细胞系或连续细胞系。 
目前，建立永生化细胞系的方法是通过基因转染等技术，将外源永生相关基因转入目的细胞或通过物化的方法诱导衰老相关基因发生突变，促使正常细胞永生化。经人工转染的永生化细胞能无限增殖生长，可长期传代，但并不改变细胞本身的特性。具体方法包括电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法以及逆转录病毒和腺病毒介导转染法；物理刺激法通过X射线、电离辐射、Co60等放射性因素进行细胞永生化的方法，可能破坏了细胞的衰老机制，使细胞周期得到延伸或促进了与细胞永生相关基因的表达。比较常用的基因转染技术是将肿瘤病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等转染正常组织细胞来构建。此外，研究细胞永生化最常用的方法还有通过构建含端粒酶催化亚基(hT ERT)的表达载体，通过各种方法来转染细胞获得永生化细胞。 
应用较为广泛的肿瘤病毒包括EB病毒、腺病毒、猴肾细胞病毒、多瘤病毒等。EB病毒(epstein-barr virus，EBV)在体外能使B淋巴母细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系，它可能通过诱导其它细胞周期调控蛋白从而抑制了p53的促细胞衰老作用，使细胞永生。导致B细胞永生的主要原因可能是端粒酶活性的提高。目前，可以直接用B淋巴细胞与EB病毒共培养的方法是细胞实现永生，在其他细胞中的应用很少。猿猴病毒SV40是一种真核细胞病毒，它的T抗原片段是最常用的整合片段，此片段能够整合进靶细胞核内并表达，可导致细胞增殖活力的改变并表现出多种与肿瘤相关的表型。近年来，人们通过野生型SV40病毒共培养感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等，成功获得了多种永生细胞株。其它病毒如人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)已成功地将人的包皮细胞、角化上皮以及乳腺、胰导管和口腔等的上皮细胞以及牛牙乳头成纤维细胞永生化。此外，也发现腺病毒可有效永生化大鼠肾细胞。 
另一种常用的获得永生化细胞的方式是通过构建含端粒酶催化亚基(hTERT)的表达载体，转染正常细胞来获得永生化细胞。端粒酶转染建立的永生化细胞是正常细胞，而非转化细胞，这些细胞依然保持了正常细胞的生理特性，具有正常的生长速率和核型。另外，hTERT介导的永生化细胞已通过了M1期和M2期，具有同胚胎干细胞一样的传代能力，可以算得上是真正意义上的永生化。 
端粒是位于染色体末端具有稳定染色体及防止染色体末端融合等特殊功能的部分。随着细胞分裂次数的增加端粒进行性缩短，当缩短到一定的限度即不能维持染色体的稳定时，细 胞失去分裂增殖的能力，进而衰老死亡。细胞端粒长度的保持需要激活端粒酶。端粒酶(telomerase)则是催化合成并维持端粒一定序列的核糖核蛋白，由RNA和蛋白组成，具有逆转录酶的活性。人类端粒酶复合物的分子量约为500-1500kDa。目前发现，所有的细胞永生化都与端粒的维持有关。目前大家比较认同的细胞发生永生化的机理是M1-M2理论，即进入M1期后，在病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等作用下，促使细胞绕过M1期继续生长。经20-30次扩增后进入M2期，绝大多数细胞出现退化，凋亡，极少数细胞的端粒酶被激活，不断合成端粒DNA来补充和延长端粒长度，维持染色体的稳定性使细胞度过M2期，最终细胞发生永生化(褚嘉祐，中华民族永生细胞库的建立，2009：9-12)。 
永生化细胞除了能在体外长期传代外，还具有很高的端粒酶活性。因此，利用永生化细胞生产细胞活性物质能够克服正常组织细胞传代、增殖的限制，能够作为质量和遗传物质均稳定的标准细胞系。实际上，永生化细胞除了具有较高的端粒酶活性之外，其本身还能够分泌大量的细胞因子(Christian Unger等2009，Human Reproduction。24(10)：2567-2581)。然而，对永生化细胞产生的细胞因子的研究非常少，可能是目前只是将永生化细胞作为一种保存遗传物质的方式，而对细胞本身的代谢特征还没有注意到。 
专利申请号为03134542.5的专利公开了“一种使皮肤成纤维细胞永生化的方法”；专利申请号为201010109274.6的专利公开了“端粒酶永生化的皮肤成纤维细胞系及其构建方法”；专利申请号为201010585718.3的专利公开了“永生化人椎间盘髓核细胞体系的制备方法”。这几个专利仅公开了通过不同细胞制作永生化细胞的方法，其中并没有涉及利用其制造细胞生长因子等人类生物活性物质方面的内容。 
目前，应用的细胞因子，主要是采用人工化学合成或者遗传重组技术进行制造。如专利申请号为200510069586.8的专利公开了“双功能表皮生长因子及其制备方法和用途”；专利申请号为201010137435.2的专利公开了“一种生产人表皮生长因子(EGF)的制备方法”。也有专利将上述通过基因重组的细胞因子用于美容护肤领域，如专利申请号为200710059770.3的专利公开了“含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途”；专利申请号为201210139430.2“基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用”。此外，也有通过干细胞的方法来大量制造细胞生长因子的技术，如来自韩国的专利申请号为200680051716.8，名称为采用脂肪来源成体干细胞大量制造生长因子的方法。但因技术难度或细胞来源等问题，并未发现利用永生化细胞制造细胞生长因子的技术出现。无论是人工化学合成的还是基因重组获得的细胞因子与人体自身产生的细胞因子还是存在一些差异，如这些细胞因子都或多或少的存在过敏原，失去特定的三维结构，活性弱。而自体细胞具有与个体高基因一致性，不存在过敏原，不会产生免疫排斥。由自体细胞制成的永生细胞不会导致癌症，用于自体不会出现免疫排斥反应，并且不受细胞来源核数量的限制，能够做到质量均一，活性稳定，因此，能够应用于个性化的需求，具有非常广阔的应用前景。 
本发明人注意到已有细胞因子的诸多问题以及永生化细胞的诸多特点，拟采用体细胞制作永生化细胞并在适当的培养基和培养条件下制造人细胞生长因子等生物活性物质组合物。 
发明内容
本发明的目的是提供一种通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法。该组合物包含细胞因子以及端粒酶等多种生物活性物质。此组合物能够应用于自体使用，具有优异的生物活性、免疫源性低、无排斥反应、制作周期短、取材方便、费用合理等特点。 
此外，本发明将提供一种安全、有效、个性化的化妆品。所述化妆品中含有通过永生化细胞获得生物活性物质组合物，或者含有由此永生化细胞培养的含有上述生物活性物质组合物的培养基。 
为了达到上述目的，本发明提供了利用永生化细胞制造生物活性物质组合物的方法，所述方法包括以下步骤：1，制作永生化细胞；2，在无血清培养基中扩大培养所述永生化细胞； 3，通过中空纤维超滤系统分离纯化生物活性物质；4，对上述分离纯化的生物活性物质进行检测。 
本发明中公布的方法能够解决现有技术中不能通过细胞培养途径有效获得细胞生长因子等生物活性物质的问题。本发明的生物活性物质组合物具有提高细胞胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用。生物活性物质组合物来源于人体细胞，与人体自身的生物活性物质具有一致的三维结构和生物活性，具有确定的安全性，较好的皮肤相容性。预期能够很好地应用于抗皱，美化皮肤，创伤愈合，去除疤痕。 
附图说明
图1是永生化B淋巴细胞显微镜照片； 
图2是永生化B淋巴细胞培养不同时间的生长因子浓度Elisa检测结果图； 
图3是永生化B淋巴细胞端粒酶活性检测结果图； 
图4是永生化B淋巴细胞培养基刺激成纤维细胞增殖结果图； 
图5是永生化B淋巴细胞培养基和生物因子刺激胶原生成Elisa检测结果图； 
图6是永生化B淋巴细胞培养基促进角化细胞UV防御功能检测结果图。 
具体实施方式
为实现上述目的，本发明提供了通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法。 
包含在永生化细胞获得的生物活性物质组合物中的生物活性物质主要包括：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样生长因子-1、2(IGF-1、2)，角化细胞生长因子(KGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，人类转化生长因子-α、β(TGF-α、β)，血管内皮生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)以及神经生长因子(NGF)等。 
鉴于包含的生物活性物质较多，本发明中主要关注的细胞因子有：细胞表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)和转化生长因子-β(Tansformating Growth Factor-β，TGF-β)。EGF是人体内产生的一种活性物质，由53个氨基酸组成的单链多肽，含有三对二硫键，分子量为6KD，极微量就能明显促进表皮细胞的增殖。EGF是研究最多，使用最为广泛的细胞生长因子。研究发现，使用EGF能够增加其他内源性生长因子的含量，促进羟脯氨酸合成，促使细胞分泌透明质酸和糖蛋白，调节胶原酶和胶原的合成、分泌和沉淀，调节胶原降解，使胶原纤维以线性方式排列，合理调整皮肤结构，增强创面抗张程度，延缓皮肤衰老，减少皱纹，提高愈合质量并具有增白等作用。目前，EGF已经广泛应用于医疗、美容等领域，主要用于治疗烧烫伤、促进伤口愈合、修复疤痕，修复胃肠道黏膜以及眼角膜的损伤等。bFGF是人体内产生的另一种活性物质，多分离自神经-组织，脑垂体，肾上腺皮质和胎盘。人的bFGF具有18-24kDa的大小，能够促进皮肤组织、角膜和气管上皮组织的增殖分化，具有调整皮肤结构，增强创面抗张程度，延缓皮肤衰老，减少皱纹，减少疤痕形成等作用。TGF是刺激成纤维细胞转化以分化为肿瘤样表型的因子，由两种蛋白TGF-α和β的混合物组成，并发现与肿瘤抑制因子而不是肿瘤刺激因子在一起。其中，人类TGF-β1具有25kDa的分子量。TGF-β1通常调控细胞的增殖诸如抑制因子，通过重复蛋白降解的抑制和蛋白的合成从而促进细胞膜的沉淀之外，还可以促进蛋白水解产物的沉积，并且通过各种机制刺激免疫抑制反应。 
本发明提供了通过永生化细胞获得生物活性物质组合物的方法，其制作过程包括以下步骤： 
1，制作永生化细胞，通过抽取静脉血或者通过手术后的身体组织分离体细胞，采用相应的转染方法制作永生化细胞，优选的是采用静脉采血法分离淋巴细胞通过EBV转染生产永生化细胞； 
2，在无血清培养基中扩大培养所述永生化细胞； 
3，通过中空纤维超滤系统分离纯化生物活性物质； 
4，对上述分离纯化的生物活性物质进行检测。 
具体来说： 
1，制作永生化细胞 
在本发明中，通过抽取静脉血或者通过手术后的身体组织分离体细胞，采用相应的转染方法制作永生化细胞，优选的是采用静脉采血法分离淋巴细胞通过EBV转染生产永生化细胞。具体而言，包括如下几个步骤： 
(1)体细胞的获得：可以通过多种途径获得人体组织的方法来获得体细胞。如血液中的淋巴细胞，以及在常见手术过程中能够获得的乳腺、脂肪、皮肤、眼皮、口腔黏膜，包皮等。优选的是最容易获得的血液淋巴细胞。 
从血液最容易获得体细胞。抽血是常规检测中几乎伤害最小的，相比其它获得体细胞的方式而言，抽血不需要进行创伤性外科手术，不需要专业技术人员和设备，给个体造成的伤害最小。此外，抽血相对来说费用低廉，操作简单，技术成熟，所需材料简单易得。通过血液获得淋巴细胞是最佳的获得体细胞的方式。采集过程由具有从业资质的医护人员采集个体的5-10ml静脉血入肝素抗凝采血管中。室温下48h内运送至实验室准备进行下一步操作。 
(2)细胞转染：可以通过多种途径进行细胞转染，如肿瘤病毒包括EB病毒、腺病毒、猴肾细胞病毒、多瘤病毒等。此外，目前常用还有构建含端粒酶催化亚基(hT ERT)的质粒进行转染。 
本发明中优先采用能够转染B淋巴细胞的EB病毒进行细胞转染操作，具体来说包括：将抗凝管中保存的静脉血混合均匀后在超净台中转移上述血液到15ml-25ml试管中，加入2-4ml RPMI1640进行稀释，混合均匀。取装有淋巴细胞分离液的试管，将上述稀释过的全血加入试管内，无色透明的液层为含有淋巴细胞的分离液。将上述含分离液的试管进行2500-3000rpm水平式离心20-30分钟。离心后可见四层，第三层含有白色絮状物质的即为淋巴细胞层。取另一试管，加入10ml-20ml RPMI1640，将淋巴细胞层液体轻轻吸取加入管中，轻摇后1000-1500rpm水平式离心5-10分钟。弃去上清，再用RPMI1640重复洗涤两到三次。将上述淋巴悬液中加入2ml-4ml的0.5％PHA全培养液，1.2ml-2.4ml的EBV，0.4ml-0.8ml的环孢霉素A，混合均匀。分装入2-4个10ml培养瓶中。放置在细胞培养箱中37℃，5-10％CO₂培养3-4天。第二天观察淋巴细胞有增大或淋巴细胞出现凝集即表明转化成功。此外，注意培养液的颜色变化，一般随着细胞生长，培养液会从橙红色变为橙黄色，如果2-3天后，颜色没有变化可怀疑细胞生长存在问题。从第四天开始补加3ml培养基，如有需要可以分瓶培养或者半量换液。三天后开始采用倒置显微镜下观察细胞形态，如发现B细胞体积增大，迅速分裂成团，茂密生长，出现增生集落；建立的细胞系可传代，能够连续培养，表明B淋巴细胞转化成功。 
2，在无血清培养基中扩大培养所述永生化细胞 
在本发明中，为了获得较多数量的生物活性物质，需要对上述永生化细胞进行扩大培养。应用于人体的细胞培养过程具有较高的培养要求，一般采用明确成分的无血清培养基。本发明中优先的采用市售的针对无血清培养基。当上述永生化细胞数量达到3-6×10∧6/ml时，600-1500rpm离心5-10min，PBS缓冲液洗涤三次，加入市售无血清培养基，可以根据需要换入较大的培养瓶中进行培养。 
在本发明中，为了获得更多的生物活性物质，需要在每个培养孔中加入1粒玻璃珠；重组人EFG10-100ng；硫辛酸2-4uM；L-抗坏血酸10-100uM；胆钙化固醇(维生素D3)5-10uM。轻微震动8h，放置在细胞培养箱中37℃，5-10％CO₂共培养24-48h后，传代2-3次。 
3，通过中空纤维超滤系统分离纯化生物活性物质 
具体而言，在本发明中，可以将上述生物活性物质进行提纯。将上述培养液液经5000-6000rmp离心20-30min进行固液分离，取上清液，对上清液先用截留分子量为100-120KD的中空纤维超滤系统进行超滤，收集过滤液，再用截留分子量为30-50KD中空纤维超滤系统进行超滤，收集浓缩的滤过液。经过上述过程能够去除培养基中大部分杂物质，获得较为纯净的永生细胞产生的生物活性物质，然后可以根据需要将浓缩液直接进行下一步生产工艺，或者将此浓缩液进行真空冷冻干燥，制备成细胞生物活性物质浓缩液粉末。 
4，生物活性物质进行检测 
在本发明中，需要对永生细胞获得的生物活性物质进行检测，具体而言，包括如下几个步骤： 
(1)细胞生长因子的检测： 
在本发明中，为了检测培养基中的细胞因子，酶联免疫法，将培养基1000-2000rpm，离心5-10分钟后通过0.22um过滤器进行除菌并去除细胞残存物质。将上述培养液稀释十倍，避免非特异性干扰。用ELISA试剂盒测量所述培养基中分泌的每种生长因子的浓度。优选的检测EGF、bFGF和TGF-β1这三种细胞因子的含量。本发明中采用美国R&DSystems公司生产的Quantikine系列人生长因子ELISA试剂盒对上述三种细胞因子进行检测。检测方法依据试剂盒所配的试剂盒说明书。分别将扩大培养后6h、12h、18h、24h和48h的培养基，进行稀释后加入包被好抗体的微孔板中，依次加入待测样本、标准品等，经过温育并彻底洗涤后经过显色后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。测试结果显示不同时间，各种生长因子的浓度有差异，随着培养时间的增加，生长因子的浓度随之升高。每个样本设置有三个重复。 
(2)端粒酶活性的检测 
永生化细胞除了能在体外长期传代外，还具有很高的端粒酶活性。一般采用用端粒酶重复扩增PCR(TRAP-PCR)来检测永生化细胞的端粒酶活性。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)。端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带，条带的深浅表示端粒酶活性的大小。 
在本发明中，为了检测培养基中端粒酶活性，首先，提取端粒酶，较常采用的方式是采用去污剂裂解法：将含有104～106沉淀的永生化细胞培养液中加入冰预冷的洗液洗1次，12000-15000rpm4℃离心1-3min，沉淀中加200-300ul冷裂解液(1-2mM MgC12，1-2mMEGTA，0.1-0.3mM PMSF，5-8mMβ-巯基乙醇，0.5-1％CHAPS或0.5-1％Tween-20，10-13％甘油)，自动匀浆器冰浴中匀浆30-40mim，然后再450-600rpm离心25-30min后改为17000-19000rpm4℃离心20-30min，移取上清，稀释十倍，迅速冷冻，-70℃保存。取5-10uL细胞提取液，95℃热处理30-40min，使端粒酶失活作为阴性对照。 
将上述提取的端粒酶液体采用TRAP-PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒检测端粒酶活性。按照试剂盒说明书进行PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。配制5％聚丙烯酰胺凝胶。待凝固后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。调节电压为80W，预电泳30-50min。将扩增产物加上样缓冲液并混匀，取5-6ul上样。调节电压60W，电泳2-3小时左右。根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。电泳完毕，关掉电泳仪。取下玻璃板，用冰冷却，准备显色-银染。将冷却的玻璃板加入10％冰醋酸进行固定液，置于盛有1.5L的塑料盘中，摇床震荡30-40min左右。再把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗两次，每次清洗2-4min。加入1.5-3g(0.1％)硝酸银染色后把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡30min左右。把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗一次。加入45-55g(0.03g/ml)碳酸钠显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA条带清晰的目的。把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应3-5min。用双蒸水清洗两次。胶板置于室温自然干燥并对条带进行统计分析。 
此外，在本发明中，还将提供一种安全、有效、个性化，用于抗皱、防老化的化妆品。所述化妆品中含有通过永生化细胞获得生物活性物质组合物，或者含有由此永生化细胞培养的含有上述生物活性物质组合物的培养基。在本发明中得生物活性物质组合物具有提高细胞胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用(参见图4，5，6)。可以用于抗皱、防老化等作用的化妆品。具体而言，包括如下几个部分： 
1.细胞因子对成纤维细胞增殖以及胶原合成的作用： 
成纤维细胞能够分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。检测生物活性物质促进成纤维细胞增殖能力能够反映该生物活性物质对美容的有益效果。为了验证此有益效果，在本发明中，检测了永生化细胞培养基对成纤维细胞的促进增殖效果。购买市售人成纤维细胞株在37℃，5-10％的CO₂培养箱中培养24-48h，然后按照5×10⁴-10⁶/孔的密度分配到6孔培养板中，同时将分离自永生细胞的培养基依次取10％、30％、50％、80％和100％的浓度加入6孔板中，各设置三个重复和成纤维细胞对照。37℃，5-10％CO₂培养箱中培养，在培养48-72h后使用MTT细胞活力和增殖检测试剂盒检测成纤维细胞活力，依据试剂盒说明书进行操作，经检测不同浓度的永生细胞培养基对成纤维细胞具有不同程度的促进作用。 
胶原的缺乏会导致皮肤老化，产生皱纹。胶原能够保持皮肤的结构和紧实。随着年龄的增加，胶原的合成逐渐减少，真皮层会变薄，稀疏，塌陷，出现皱纹。刺激胶原的产生能够延缓衰老，紧致皮肤，预防皱纹的产生。检测生物活性物质促进胶原的生成能力能够反映该生物活性物质对美容的有益效果。为了验证此有益效果，分别取等量的经过72h浓缩的滤过液和培养基与等量的密度为5×10⁴-10⁶个细胞的成纤维细胞在37℃，5-10％CO₂培养箱中培养，在培养12h、24h、36h、48h和72h时，分别取1-2ml培养基检测其中胶原的活性，使用ELISAKit试剂盒检测胶原的量。检测方法参照试剂盒说明书进行，经检测I型胶原蛋白的量，发现因子组和培养基组均能够显著促进胶原蛋白的合成。 
2.永生化细胞防止UV光伤害的角化细胞防御效果。 
在本发明中，将按照以下方式测试由永生化细胞分泌的细胞因子防止UV光伤害的角化细胞防御效果。以5×10⁴-10⁶/孔的密度将角化细胞分割到6孔板中，并在37℃，5-10％CO₂培养箱中，加入角化细胞生长培养基中，向所述培养基中分别加入2.5-3ml的培养三天的100％永生化细胞培养基并调整角化细胞生长培养基至5-7ml，同样，作为对照，加入2-3uM视黄醇加入到角化细胞生长培养基中。作为对照组，单独加入5-7ml角化细胞生长培养基。每个测试样品稳定4小时使上述材料充分分散。阴性对照组未用培养基或视黄醇处理，此后在无菌室中用紫外灯对每个测试样品进行8-10分钟的UV光照射。在37℃，5-10％CO₂培养箱中培养，在培养24-36h后，使用MTT细胞活力和增殖检测试剂盒检测角化细胞活力，依据试剂盒说明书进行操作，经检测上述细胞的存活力发现含有生物活性物质的永生化细胞培养基具有较好的UV防御功能，其防御效果优于视黄醇。 
3.用上述生物活性物质组合物制作化妆品 
具体而言，在本发明中，所述化妆品包括护肤类及抗皱产品、功能性化妆品。所述的护肤类及抗皱产品包括润肤霜、冷霜、雪花膏、乳液、眼霜、护手霜、日霜、晚霜、防裂膏、花露水、收缩水和化妆水；所述的化妆品包括美白护肤品、抗皱护肤品、保湿护肤品和祛痘护肤品。 
具体而言，以制备水剂化妆品100g为例，该化妆品由如下质量配比的原料组成： 


因此，在本发明中获得的生物活性物质组合物具有提高细胞胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用。可以用于抗皱、防老化等作用的化妆品的原材料。特别是，本发明中公布的方法能够解决现有技术中不能通过细胞培养途径有效获得细胞生长因子等生物活性物质的问题。生物活性物质组合物来源于人体细胞，与人体自身的生物活性物质具有一致的三维结构和生物活性，具有确定的安全性，较好的皮肤相容性。预期能够很好地应用于抗皱，美化皮肤，创伤愈合，去除疤痕。 
以下，参考实施例进一步详细的阐述本发明的内容。本领域内的技术人员能够容易的理解和实施本技术，对本发明内容作出的各种修改、补充以及替换而不背离权利要求中所阐述的本发明的范围和精神。下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。 
实施例1永生化B淋巴细胞的获得 
通过抽取静脉血，分离淋巴细胞通过EBV转染生产永生化细胞： 
从血液最容易获得体细胞。抽血是常规检测中几乎伤害最小的，相比其它获得体细胞的方式而言，抽血不需要进行创伤性外科手术，不需要专业技术人员和设备，给个体造成的伤害最小。此外，抽血相对来说费用低廉，操作简单，技术成熟，所需材料简单易得。通过血液获得淋巴细胞是最佳的获得体细胞的方式。采集过程由具有从业资质的医护人员采集个体的5-10ml静脉血入肝素抗凝采血管中。室温下48h内运送至实验室准备进行下一步操作。 
采用能够转染B淋巴细胞的EB病毒进行细胞转染操作，具体来说包括：将抗凝管中保存的静脉血混合均匀后在超净台中转移上述血液到15ml-25ml试管中，加入2-4ml RPMI1640进行稀释，混合均匀。取装有淋巴细胞分离液(主要成分是Ficoll400与泛影酸葡甲胺，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)的试管，将上述稀释过的全血加入试管内，无色透明的液层为含有淋巴细胞的分离液。将上述含分离液的试管进行2500rpm水平式离心30分钟。离心后可见四层，第三层含有白色絮状物质的即为淋巴细胞层。取另一试管，加入10ml-20mlRPMI1640(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，将淋巴细胞层液体轻轻吸取加入管中，轻摇后1000rpm水平式离心10分钟。弃去上清，再用RPMI1640重复洗涤两到三次。 
将永生化B淋巴细胞悬液中加入2ml-4ml的0.5％PHA全培养液，1.2ml-2.4ml的EBV，0.4ml_-0.8ml的环孢霉素A，混合均匀。分装入2-4个10ml培养瓶中。放置在细胞培养箱中37℃，5％CO₂培养3天。第二天观察淋巴细胞有增大或淋巴细胞出现凝集即表明转化成功。此外，注意培养液的颜色变化，一般随着细胞生长，培养液会从橙红色变为橙黄色，如果2-3天后，颜色没有变化可怀疑细胞生长存在问题。从第四天开始补加3ml培养基，如有需要可以分瓶培养或者半量换液。三天后开始采用倒置显微镜(Olympus，20×)镜下观察细胞形态，如发现B细胞体积增大，迅速分裂成团，茂密生长，出现增生集落(图1)；建立的细胞系可传代，能够连续培养，表明B淋巴细胞转化成功。 
实施例2，在无血清培养基中扩大培养永生化B淋巴细胞 
为了获得较多数量的生物活性物质，需要对永生化B淋巴细胞进行扩大培养。应用于人体的细胞培养过程具有较高的培养要求，一般采用明确成分的无血清培养基。本发明中优先的采用针对无血清培养基(日本TAKARA公司的淋巴细胞无血清培养基或者美国LONZA公司的限定化学成分无血清培养基)，在永生化细胞数量达到3-6×10∧6/cm3时，离心，PBS缓冲液洗涤三次，加入无血清培养基，可以根据需要换入较大的培养瓶中进行培养。为了获得更多的生物活性物质，需要在每个培养孔中加入1粒玻璃珠(Glass beads，acid-washed(425-600μm))；重组人EFG(上海昊海生物科技股份有限公司，2万IU/瓶)100ng；硫辛酸(美国Sigma，(±)-α-硫辛酸)2-4uM；L-抗坏血酸(美国Sigma)10-100uM；胆钙化固醇(维生素D3)(美国Supelco)5-10uM。轻微震动8h，放置在细胞培养箱中37℃，5％CO₂共培养48h后，传代2-3次。倒置显微镜(Olympus，20×)镜下观察细胞形态，如发现B淋巴细胞体积增大，茂密生长表示已经生产成熟。 
实施例3，通过中空纤维超滤系统分离纯化生物活性物质； 
将永生化B淋巴细胞培养液经5000rmp离心20min进行固液分离，取上清液，对上清液先用截留分子量为100KD的中空纤维超滤系统进行超滤，收集过滤液，再用截留分子量为50KD中空纤维超滤系统进行超滤，收集浓缩的滤过液。经过上述过程能够去除培养基中大部分杂物质，获得较为纯净的永生细胞产生的生物活性物质，然后可以根据需要将浓缩液直接进行下一步生产工艺，或者将此浓缩液进行真空冷冻干燥，制备成细胞生物活性物质浓缩液粉末。 
实施例4，对永生化B淋巴细胞产生的生物活性物质进行检测； 
1.细胞生长因子的检测： 
为了检测培养基中的细胞因子，酶联免疫法，将培养基1350rpm，离心5分钟后通过0.22mm过滤器进行除菌并去除细胞残存物质。将上述培养液稀释十倍，避免非特异性干扰。用ELISA试剂盒测量所述培养基中分泌的每种生长因子的浓度。优选的检测EGF、bFGF和TGF-β1这三种细胞因子的含量。本发明中采用美国R&DSystems公司生产的Quantikine系列人生长因子ELISA试剂盒对上述三种细胞因子进行检测。检测方法依据试剂盒所配的试剂盒说明书。分别将扩大培养后6h、12h、18h、24h和48h的培养基，进行稀释后加入包被好抗体的微孔板中，依次加入待测样本、标准品等，经过温育并彻底洗涤后经过显色后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。测试结果显示不同时间，各种生长因子的浓度有差异，随着培养时间的增加，生长因子的浓度随之升高。每个样本设置有三个重复，结果见图2。 
2.端粒酶活性的检测 
永生化B淋巴细胞具有很高的端粒酶活性。一般采用用端粒酶重复扩增PCR(TRAP-PCR)来检测永生化细胞的端粒酶活性。首先，提取端粒酶，较常采用的方式是采用去污剂裂解法：将含有104～106沉淀的永生化细胞培养液中加入冰预冷的洗液(1.5mM MgCl₂，10mM KCl，hepes-KOH(pH7.5)，1Mm DTT10mM)洗1次，12000rpm4℃离心1min，沉淀中加200ul冷裂解液(10mM tris-HCl(Ph7.5)，1mM MgCl₂，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mMβ-巯基乙醇，0.5％CHAPS或0.5％Tween-20，10％甘油)，自动匀浆器冰浴中匀浆，30mim450rpm，25min，17000rpm4℃离心20min，移取上清，稀释十倍，迅速冷冻，-70℃保存。取5uL细胞提取液，95℃热处理30min，使端粒酶失活作为阴性对照。 
将上述提取的端粒酶液体采用TRAP-PCR银染法端粒酶活性检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，Keygen，KGA414)检测端粒酶活性。按照试剂盒说明书进行PCR扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。配制5％聚丙烯酰胺凝胶：8.34ml原胶、45ml尿素、15ml 5xTBE、6.66ml双蒸水、30-36ul TEMED、240ul ASP。待凝固后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：使用1xTBE，在电泳仪(美国，Bio-Rad)下端槽内倒1xTBE约500ml，向上槽倒1xTBE，使液面高于短板上沿。调节电压为80W，预电泳30min。将扩增产物加上样缓冲液并混匀，取5-6ul上样。调节电压60W，电泳2小时左右。根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。电泳完毕，关掉电泳仪。取下玻璃板，用冰冷却，准备显色-银染。将冷却的玻璃板加入10％冰醋酸进行固定液，置于盛有1.5L的塑料盘中，摇床震荡30min左右。再把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗两次，每次2-4min。加入1.5g(0.1％)硝酸银染色后把清洗干净的胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡30min左右。把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗一次。加入45g(0.03g/ml)碳酸钠显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整，达到DNA条带清晰的目的。显色液一定要预冷至4-10℃，否则会使被背景加深。把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中，反应3min。用双蒸水清洗两次(每次2min)。胶板置于室温自然干燥。条带统计结果见图4。 
实施例5，生物活性物质组合物具有提高细胞胶原合成、促进成纤维细胞增殖、抑制UV光导致的角化细胞增殖的作用。 
1，细胞因子对成纤维细胞增殖以及胶原合成的作用： 
成纤维细胞能够分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。检测生物活性物质促进成纤维细胞增殖能力能够反映该生物活性物质对美容的有益效果。为了验证此有益效果，本发明检测了永生化细胞培养基对成纤维细胞的促进增殖效果。购买市售人成纤维细胞株(美国Lifeline公司，人皮肤成纤维细胞-成人原代细胞)在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，然后按照5×10⁴/孔的密度分配到6孔培养板中，同时将分离自永生细胞的培养基依次取10％、30％、50％、80％和100％的浓度加入6孔板中，各设置三个重复和成纤维细胞对照。37℃，5％CO₂培养箱中培养，在培养72h后使用美国Sciencell公司的MTT细胞活力和增殖检测试剂盒检测成纤维细胞活力，依据试剂盒说明书进行操作，经检测不同浓度的永生细胞培养基对成纤维细胞具有不同程度的促进作用，其中100％浓度的培养基具有最大的促进成纤维细胞增殖的作用(图4)。 
胶原的缺乏会导致皮肤老化，产生皱纹。胶原能够保持皮肤的结构和紧实。随着年龄的增加，胶原的合成逐渐减少，真皮层会变薄，稀疏，塌陷，出现皱纹。刺激胶原的产生能够延缓衰老，紧致皮肤，预防皱纹的产生。检测生物活性物质促进胶原的生成能力能够反映该生物活性物质对美容的有益效果。为了验证此有益效果，分别取等量的经过72h浓缩的滤过液和培养基与等量的密度为5×10⁴个细胞的成纤维细胞(美国Lifeline公司，人皮肤成纤维细胞-成人原代细胞)在37℃，5％CO₂培养箱中培养，在培养12h、24h、36h、48h和72h时，分别取1ml培养基检测其中胶原的活性，使用上海拜力生物科技有限公司的人I型胶原蛋白(COL-1)ELISAKit试剂盒检测胶原的量。检测方法参照试剂盒说明书进行，经检测I型胶原蛋白的量，发现因子组和培养基组均能够显著促进胶原蛋白的合成，结果见图5。 
2，永生化细胞防止UV光伤害的角化细胞防御效果。 
按照以下方式测试由永生化细胞分泌的细胞因子防止UV光伤害的角化细胞防御效果：以5×10⁴/孔的密度将角化细胞(美国Lifeline公司，人表皮角化细胞)分割到6孔板中，并在37℃，5％CO₂培养箱中，加入角化细胞生长培养基(美国Lifeline公司，角化细胞生长培养基)中，向所述培养基中分别加入2.5ml的培养三天的100％永生化细胞培养基并调整角化细胞生长培养基至5ml，同样，作为对照，加入2uM视黄醇加入到5ml角化细胞生长培养基中。作为对照组，单独加入5ml角化细胞生长培养基。每个测试样品稳定4小时使上述材料充分分散。阴性对照组未用培养基或视黄醇处理，此后在无菌室中用40w双灯，紫外灯对每个测试样品进行8分钟的UV光照射。在37℃，5％CO₂培养箱中培养，在培养24h后，使用美国Sciencell公司的MTT细胞活力和增殖检测试剂盒检测角化细胞活力，依据试剂盒说明 书进行操作，经检测上述细胞的存活力发现含有生物活性物质的永生化细胞培养基具有较好的UV防御功能，其防御效果优于视黄醇。结果见图6。 
实施例6，含有通过永生化细胞获得生物活性物质组合物，或者含有述生物活性物质组合物的培养基制作化妆品。 
生物活性物质组合物可以用于美白护肤品、抗皱护肤品、保湿护肤品、祛痘护肤品和抗汗护肤品或功能性化妆品。此化妆品可以制成润肤霜、冷霜、雪花膏、乳液、眼霜、护手霜、日霜、晚霜、防裂膏、花露水、收缩水和化妆水等。以制备100g化妆品为例，该化妆品由如下质量配比的原料组成： 
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