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1、10申请公布号CN104059868A43申请公布日20140924CN104059868A21申请号201410273218422申请日20140618CGMCCNO917120140516C12N1/20200601A23B4/20200601C12R1/0120060171申请人东北农业大学地址150000黑龙江省哈尔滨市香坊区公滨路木材街59号72发明人孔保华陈倩李木子孙钦秀刘骞54发明名称一株具有体外抗氧化活性的戊糖片球菌R1及其在发酵肉品中作为抗氧化剂的应用57摘要一株具有体外抗氧化活性的戊糖片球菌R1及其在发酵肉品中作为抗氧化剂的应用，属于微生物技术领域。本发明的戊糖片球菌R1保。
2、藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，菌种保藏编号为CGMCCNO9171，保藏日期为2014年05月16日，菌种的分类命名为戊糖片球菌PEDIOCOCCUSPENTOSACEUS。本发明的戊糖片球菌R1在体外抗氧化试验中呈现较好的抗氧化活性，其全细胞及胞内提取物对羟基自由基有较强的清除能力，可抑制脂质过氧化，并且细胞表面物质具有抗氧化活性。因此，戊糖片球菌R1可以作为发酵肉品中的抗氧化剂来延缓在发酵和贮藏过程中因氧化造成的产品劣变，进而减少了抗氧化剂的使用量。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利。
3、要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104059868ACN104059868A1/1页21一株具有体外抗氧化活性的戊糖片球菌R1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNO9171。2如权利要求1所述的具有体外抗氧化活性的戊糖片球菌R1在发酵肉品中作为抗氧化剂的应用。权利要求书CN104059868A1/4页3一株具有体外抗氧化活性的戊糖片球菌R1及其在发酵肉品中作为抗氧化剂的应用技术领域0001本发明属于微生物技术领域，涉及一株从风干肠中筛选出的具有抗氧化活性的戊糖片球菌及其在发酵肉品中作为抗氧化剂的应用。背景技术0002乳酸菌是发酵肉制品中最。
4、常见的微生物之一，其可降低肉品PH值，改善组织结构，促进风味的形成，同时可抑制腐败菌的生长，保证了发酵肉制品食用的安全性。为了获得优良的菌种作为发酵剂，国内外学者在这些方面进行了较多的研究。但是，发酵肉制品在贮藏过程中脂肪会发生氧化酸败，是其品质劣变的主要原因之一。目前，在发酵肉制品中使用的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚BHA、2，6二叔丁基4甲基苯酚BHT、叔丁基对苯二酚TBHQ、没食子酸丙酯PG和VE等来延缓肉制品氧化劣变，但一些抗氧化剂存在使用成本高，抗氧化能力弱，另外毒理学研究表明一些抗氧化剂存在安全隐患。所以，能够获得具有抗氧化活性的肉制品发酵剂是解决肉制品氧化变质的另一条有效途径，但目。
5、前关于发酵肉制品中乳酸菌抗氧化活性的研究较少。发明内容0003本发明的目的是提供一株具有体外抗氧化活性的戊糖片球菌，可应用到发酵肉制品中，延缓在肉制品贮藏过程中的过度氧化造成的产品品质劣变。0004本发明从发酵风干肠中分离出的乳酸菌戊糖片球菌R1PEDIOCOCCUSPENTOSACEUSR1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCCNO9171，保藏日期为2014年05月16日，菌种的分类命名为戊糖片球菌PEDIOCOCCUSPENTOSACEUS。0005本发明中的戊糖片球菌R1具有以下生物学特。
6、性00061形态特征戊糖片球菌R1革兰氏染色结果为阳性，细胞呈圆球形，成对或四联排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。00072菌落特征戊糖片球菌R1在MRS固体培养基上生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。00083生理生化特征过氧化氢酶阴性，不产吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，不发酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可从纤维二糖、七叶苷、藫糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。0009本发明的戊糖片球菌R1在体外抗氧化试验中呈现较好的抗氧化活性，其全细胞及胞内提取物对羟基自由基。
7、有较强的清除能力，可抑制脂质过氧化，并且细胞表面物质具有抗氧化活性。因此，戊糖片球菌R1可以作为发酵肉品中的抗氧化剂来延缓在发酵和贮藏过程中因氧化造成的产品劣变，进而减少了抗氧化剂的使用量。说明书CN104059868A2/4页40010保藏信息0011保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；0012保藏单位简称CGMCC；0013保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；0014保藏编号CGMCCNO9171；0015保藏日期2014年05月16日。附图说明0016图1为戊糖片球菌R1在不同浓度过氧化氢溶液中的存活情况；0017图2为戊糖片球菌R1菌体细胞及胞。
8、内提取物对羟基自由基清除能力；0018图3为戊糖片球菌R1菌体细胞及胞内提取物还原能力；0019图4为戊糖片球菌R1菌体细胞及胞内提取物抑制脂质过氧化能力；0020图5为对戊糖片球菌R1细胞表面进行不同处理后菌体细胞对羟基自由基的清除能力。0021图6为自然发酵风干肠和接种戊糖片球菌的风干肠发酵第9天的硫代巴比妥酸值TBARS。具体实施方式0022下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。0023一、试验设计0024戊糖片球菌R1接种量3接种于MRSMANROGOSA。
9、ANDSHARP液体培养基中，37培养12H。发酵液于4，10,000G离心5MIN，得菌体细胞。将菌体细胞分为两部分，一部分菌体细胞用双蒸水洗涤两次后重新悬浮，即为菌体细胞悬浮液；另一部分，超声破碎后离心5MIN4，10,000G后得上清，即为胞内提取物。通过考察菌体细胞对过氧化氢的耐受性，全细胞及胞内提取物对羟基自由基清除能力、还原能力、脂质过氧化能力，以及菌体细胞表面抗氧化物质的研究来考察其抗氧化活力。0025二、过氧化氢耐受性0026将菌体细胞添加到含有不同浓度0、02、04、06、08、10、12MM过氧化氢的生理盐水中，菌体细胞起始浓度约为107CFU/ML，37培养8H，涂布于M。
10、RS琼脂培养基上，37培养48H计数。0027三、羟基自由基清除能力002801ML待测液与1ML反应缓冲液混合含01MMOL/LFECL3，0104MMOL/LEDTA，15MMOL/LH2O2，25MMOL/L脱氧核糖，01中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCCNO9171，保藏日期为2014年05月16日，菌种的分类命名为戊糖片球菌PEDIOCOCCUSPENTOSACEUS。0029本发明中的戊糖片球菌R1具有以下生物学特性00301形态特征戊糖片球菌R1革兰氏染色结果为阳性，细胞呈圆球形，成对或四联说明书CN104059868A3/4页5排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。0031。
11、2菌落特征戊糖片球菌R1在MRS固体培养基上生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。00323生理生化特征过氧化氢酶阴性，不产吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，不发酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可从纤维二糖、七叶苷、藫糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。0033本发明的戊糖片球菌R1在体外抗氧化试验中呈现较好的抗氧化活性，其全细胞及胞内提取物对羟基自由基有较强的清除能力，可抑制脂质过氧化，并且细胞表面物质具有抗氧化活性。因此，戊糖片球菌R1可以作为发酵肉品中的抗氧化剂来。
12、延缓在发酵和贮藏过程中因氧化造成的产品劣变，进而减少了抗氧化剂的使用量。0034保藏信息0035保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；0036保藏单位简称CGMCC；0037保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；0038保藏编号CGMCCNO9171；0039保藏日期2014年05月16日。附图说明0040图1为戊糖片球菌R1在不同浓度过氧化氢溶液中的存活情况；去除SLAYER蛋白、用高碘酸钠SODIUMPERIODATE20MG/ML氧化细胞表面多糖，处理细胞表面这些蛋白及多糖物质后，考察其羟基自由基清除能力。0041七、风干肠的制作00421原辅料00。
13、43瘦肉猪臀肉，猪里脊45KG，肥肉猪背脂05KG，麯酒玉泉大麯015KG，亚硝酸钠00045KG，葡萄糖025KG，味素0075KG，盐0125KG，混合调料0025KG混合调料包括花椒，大料，桂皮，丁香等。00442发酵剂制备0045将活化好的戊糖片球菌接种到MRS培养基中进行发酵培养，37培养12H。发酵液于4条件下，10,000G离心5MIN后，备用。添加发酵剂时，乳酸菌终浓度为107CFU/G肉馅。00463风干肠制作工艺流程0047原料肉剔除淋巴，筋腱，血管等结缔组织切丁1CM见方的肉丁腌制加盐和调味料等加发酵剂对照组不添加拌馅灌制发酵风干。0048八、硫代巴比妥酸值TBARS测定。
14、0049取2G样品放入试管中，加入15ML硫代巴比妥酸溶液，75ML三氯乙酸盐酸溶液，混匀后沸水浴中反应30MIN，冷却，取5ML样品加入等体积的氯仿，1000G下离心10MIN，532NM处读取吸光值。TBARS值以每千克脂质氧化样品中丙二醛的毫克数表示，计算公式如下说明书CN104059868A4/4页600500051式中A吸光度，V是样品体积ML；0052M丙二醛的分子量72063；0053摩尔吸光系数156000L/MOLCM；00541光程1CM；0055M肉样的质量G。0056九、结果与分析0057过氧化氢是一种强氧化剂，它不仅可以对细胞组织造成直接破坏，还可以作为羟自由基的前体。
15、间接参与氧化过程。因此，研究菌株过氧化氢的耐受能力可作为衡量其抗氧化活性的一个指标。如图1所示，过氧化氢浓度在10MM以下时，菌数变化不显著，因为用低浓度的过氧化氢处理乳酸菌菌体细胞时，其自身的氧化防御系统可以保护其免受氧化剂的危害。当过氧化氢浓度的增加至14MM，菌数仅下降05个对数周期，说明戊糖片球菌对过氧化氢的耐受性较强。0058从图2、3和4可知，戊糖片球菌全细胞组分对自由基清除能力、还原能力以及抑制脂质过氧化率分别达到了5401，0045和2958；胞内提取物组分别为4033，037和57070059图5是经不同蛋白酶及LICL去除菌体细胞表面蛋白，并用高碘酸钠氧化细胞表面多糖后菌体。
16、细胞对羟基自由基清除能力的结果。试验表明，胰蛋白酶处理后自由基清除能力下降的最显著，说明细胞表面的碱性蛋白成分起主要的抗氧化作用。0060图6是将戊糖片球菌接种于风干肠后发酵第9天的TBARS值，与对照组即自然发酵风干肠相比，其TBARS明显要低，说明在此过程中接种戊糖片球菌的风干肠氧化程度较低，该菌株起到了良好的抗氧化作用。0061通过以上试验，确定了从哈尔滨发酵风干肠中筛选出的戊糖片球菌R1具有较强的抗氧化活性，可作为发酵肉制品中的潜在抗氧化剂。说明书CN104059868A1/3页7图1图2图3说明书附图CN104059868A2/3页8图4图5说明书附图CN104059868A3/3页9图6说明书附图CN104059868A。