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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310256004.1 (22)申请日 2013.06.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103320465 A (43)申请公布日 2013.09.25 (73)专利权人 石河子大学 地址 832003 新疆维吾尔自治区石河子市 北四路石河子大学 (72)发明人 崔百明郑银英李晓明高朝宝 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所(普通合伙) 11350 代理人 汤东凤 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 。
2、15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (56)对比文件 高朝宝 等.蚜虫基因RNAi载体的构建及其 在转基因烟草中dsRNA的表达分析. 中国农学通 报 .2011,第27卷(第15期),229-232. 高朝宝.利用RNAi技术抗棉蚜的研究. 中国 优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑 .2012, (第5期),第I页, 摘要; 14页2.1.1节, 图1; 24页2.5.2节至28页2.5.3节; 44页第3-5段; 29页 3.1节至42页5.3节. 审查员 温婧 (54)发明名称 植物表达载体、 蚜虫基因dsRNA表达载体及 其应用 (57)摘要 本发明。
3、公开了一种植物表达载体、 蚜虫基因 dsRNA表达载体及其应用, 用于构建dsRNA植物表 达载体, dsRNA序列与番茄花叶病毒的起始组装 序列相连, 因此转录的RNA分子能够被ToMV的外 壳蛋白 (CP) 所包装; 所述的植物表达载体还包含 了ToMV的CP基因的表达框架, 其编码的CP能包装 含OAS的RNA分子, dsRNA编码序列和CP基因序列 均置于一个韧皮部优势表达的启动子之下, 使 dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。 本发明载体中, dsRNA的转录是由韧皮部特异性 启动子驱动的, 使dsRNA主要在筛管中积累, 其潜 在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、。
4、 粉虱、 介壳虫等。 权利要求书1页 说明书4页 序列表6页 附图3页 CN 103320465 B 2017.04.19 CN 103320465 B 1.一种蚜虫基因dsRNA植物表达载体pRNAiAV2, 其特征在于: 所述载体的构建方式如 下: (1)以ToMV基因组为模板, 利用引物CP_F和CP_R扩增得到CP基因片段; (2)BamHI/PstI双 酶切将Rol启动子从pUC57载体上切下, 克隆到p221CP的BamHI/PstI的位点, 得到载体p221- Rol-CP; (3)以载体pBI221为模板, 利用引物NOS_F/NOS_R扩增得到NOS终止子, 将NOS终止子 。
5、通过限制性内切酶HindIII/PstI位点克隆到p221-Rol-CP, 构建为载体p221-RolCPNOS; (4) 以ToMV基因组为模板, 利用引物OAS_F和OAS_R扩增得到OAS基因片段, 将OAS基因片段通过 限制性内切酶BspEI/PstI位点克隆到p221-RolCPNOS, 构建为载体p221RolCPOAS; (5)将 p221RolCPOAS的HindIII/EcoRI酶切片段克隆到pCAMBIA2300的相应位点, 构建成表达载体 pBiRolCPOAS; (6)以棉蚜AV2基因片段为模板, 用引物AV2_F和AV2_R扩增棉蚜AV2的部分片 段, 将扩增得到的片。
6、段克隆到pGEM-T easy载体, 用XmaI和XbaI从载体上把AV2片段切下, 命 名为AV2_XX; (7)用XmaI和XbaI消化pBiRolCPOAS, 回收载体片段, 并与AV2_XX连接, 构建得 到载体pRolAV; (8)用BspEII和AvrII消化pRolAV, 回收载体片段, 并与AV2_XX连接, 构建得 到载体pRNAiAV2; 其中所述的Rol启动子的序列如SEQ ID NO.2所示, 所述的棉蚜AV2基因片 段的序列如SEQ ID NO.1所示, 所述的引物CP_F为: GGATCCACCATGTCTTACTCAATCACT, CP_R为 GAGCTCTTAA。
7、GATGCAGGTGCAGA, NOS_F为CTGCAGTCCGGATCGTTCAAACATTTGG ,NOS_R为 AAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGA, OAS_F为CTGCAGCCCGGGTCTAGAATTTGTGTCTGTGTGTATTG, OAS_R 为TCCGGACCTAGGGTCAGCCCATACAGA。 2.权利要求1所述的植物表达载体在制作抗蚜虫转基因植物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103320465 B 2 植物表达载体、 蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用 技术领域 0001 本发明涉及昆虫双链RNA (dsRNA) 介导的基因沉默的领域。。
8、 更具体地, 本发明涉及 遗传构建体, 其被设计用来在植物中表达蚜虫基因的dsRNA。 这些构建体可被用于产生转基 因植物, 对取食该植物的蚜虫具有潜在的抑制或杀伤作用。 背景技术 0002 蚜虫危害棉花、 小麦、 油菜等多种作物。 化学杀虫剂是目前主要的控制手段。 但化 学杀虫剂存在副作用, 它们不仅污染环境, 也没有特异性, 除了对蚜虫杀伤外, 也会对作物 及其它昆虫造成伤害。 化学杀虫剂在环境中代谢缓慢, 会进入食物链中, 在高级的捕食物种 中积累, 并产生毒性。 0003 因为生物杀虫剂可以避免化学杀虫剂的这些危险, 而受到青睐。 例如, Bacillus thuringiensis(。
9、B.t.)细菌作为一种环境安全的生物杀虫剂已经市场化应用超过30年了。 生物杀虫剂除了能保持土壤和水清洁外, 也会因化学杀虫剂使用量的降低而使田间有益昆 虫的数量增加。 0004 RNAi对靶基因mRNA抑制的特异性和高效性使之成为一种控制基因表达的有力工 具。 RNAi是由小干扰RNA (siRNA) 介导的序列特异性的转录后基因沉默过程。 RNAi由dsRNA触 发, 细胞中的dsRNA被Dicer核酸酶水解为2123nt的siRNA, siRNA再引导核酸内切酶对细 胞内的与之序列配对的mRNA进行降解。 有些动物的消化道可以吸收来自食物的dsRNA, 并诱 导消化道细胞产生RNAi现象。
10、, 或进一步地引起系统性的基因沉默。 通过饲喂表达dsRNA的细 菌, 以成功建立了线虫基因沉默的方法。 如果dsRNA引发沉默的基因是害虫生存所必需的, 则该dsRNA就可能研制为杀虫剂。 0005 dsRNA能否达到杀虫的效果, 与dsRNA能否被昆虫中肠有效吸收和在昆虫细胞中能 否引发强烈的RNAi效应有关。 为此, dsRNA首先必须在昆虫中肠达到较高的浓度。 本发明提 供了一种RNAi载体, 可以使转基因植物在韧皮组织中表达棉蚜的dsRNA和ToMV的CP蛋白, 该 dsRNA由于包含OAS而可以被CP包装, 从而降低在消化道的降解, 在中肠形成较高的浓度。 发明内容 0006 本发。
11、明提供了一种植物表达载体、 蚜虫基因dsRNA表达载体及其应用。 0007 一种植物表达载体, 用于构建dsRNA植物表达载体, dsRNA序列与番茄花叶病毒 (ToMV) 的起始组装序列 (original assembly sequence, OAS) 相连, 因此转录的RNA分子能 够被ToMV的外壳蛋白 (CP) 所包装; 所述的植物表达载体还包含了ToMV的CP基因的表达框 架, 其编码的CP能包装含OAS的RNA分子, dsRNA编码序列和CP基因序列均置于一个韧皮部优 势表达的启动子之下, 使dsRNA和CP蛋白能在转基因植物的筛管中积累。 0008 将棉蚜靶标基因序列与ToMV。
12、的OAS相连, 并同时表达ToMV的CP蛋白; CP蛋白可以识 别OAS, 并从OAS开始对RNA包装; 蛋白质的包装可以降低RNA与RNA酶的接触, 从而减少降解 的风险; 另外, 蚜虫取食于植物的筛管, 本发明用韧皮部特异性的启动子使RNA和CP能在筛 说明书 1/4 页 3 CN 103320465 B 3 管中形成较高的浓度, 而在其它组织中表达很低。 0009 本发明载体在OAS两侧提供了两组由同尾酶 (XbaI/AvrII和XmaI/BspEII) 组成的 插入位点, 当靶标序列的两侧分别为XbaI和XmaI及其同尾酶时, 均可被克隆到上述两个位 点。 0010 本发明载体以pCA。
13、MBIA2300为骨架, 可以用农杆菌介导法对目标植物进行转化, 转 化细胞用卡那霉素筛选。 0011 在实施例中, 用于产生dsRNA的靶标序列是从棉蚜中分离的V-型质子泵ATPase的A 亚基基因的同源片段。 但靶标序列可以不限于该基因以及棉蚜。 0012 本发明载体中, dsRNA的转录是由韧皮部特异性启动子驱动的, 使dsRNA主要在筛 管中积累。 其潜在的害虫防治对象为用刺吸式口器取食的蚜虫、 粉虱、 介壳虫等。 附图说明 0013 图1为pBiRolCPOAS载体图; 0014 图2为PRNAiAV2载体图; 0015 图3为PCR产物电泳; 0016 图4转基因拟南芥抑制取食棉蚜。
14、AV2基因的表达。 具体实施方式 0017 以下结合具体实施例, 对本发明进行详细说明。 0018 实施例1: 载体构建所需DNA片段的制备 0019 载体 (图1) 构建所需ToMV CP、 ToMV OAS和NOS终止子等DNA片段均通过PCR获得, 两 端克隆所需的酶切位点通过PCR引物引入, 所用引物如下: 0020 0021 ToMV OAS和ToMV CP的扩增, 以ToMV的基因组RNA为模板, 分别用引物对OAS_F/ OAS_R和CP_F/CP_R进行RT-PCR。 RT-PCR采用III One-Step RT-PCR System with(目录编号12574018, I。
15、nvitrogen) 试剂按说明书操作完成。 0022 NOS终止子的扩增以pBI221为模板, 用引物NOS_F/NOS_F进行PCR。 PCR产物均采用 琼脂糖凝胶电泳分离。 NOS终止子扩增产物大小为272bp, ToMV OAS的扩增产物大小为 414bp, ToMV CP的扩增产物大小为495bp (图3) 0023 Rol启动子 (SEQ ID NO:2) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成并克隆到 说明书 2/4 页 4 CN 103320465 B 4 pUC57载体。 0024 实施例2: pBiRolCPOAS载体构建 0025 下列过程中酶切产物的分离均采用琼脂糖。
16、凝胶电泳方法, 用QIAquick Gel Extraction Kit纯化, DNA片段的连接用T4DNA连接酶 (promega, 目录号M1801) 按说明书进 行。 0026 RNAi载体的构建流程为: 0027 1.将实施例1中ToMV CP通过限制性内切酶BamHI/SacI位点克隆到pBi221, 构建为 载体p221CP; 0028 2.用BamHI/PstI双酶切将Rol启动子从pUC57载体上切下 (图4) , 经琼脂糖凝胶电 泳分离, 和回收后, 克隆到p221CP的BamHI/PstI位点, 构建为载体p221-Rol-CP; 0029 3.将实施例1中NOS终止子通过。
17、限制性内切酶HindIII/PstI位点克隆到p221-Rol- CP, 构建为载体p221-RolCPNOS; 0030 4 .将实施例1中ToMV OAS通过限制性内切酶BspEI/PstI位点克隆到p221- RolCPNOS, 构建为载体p221RolCPOAS; 0031 5.将p221RolCPOAS的HindIII/EcoRI酶切片段克隆到pCAMBIA2300的相应位点, 构 建成表达载体pBiRolCPOAS。 0032 实施例3: pRNAiAV2载体构建 0033 本实施例是应用载体pBiRolCPOAS构建棉蚜V型质子泵基因(AV2)dsRNA表达载体 的方法。 003。
18、4 棉蚜AV2基因片段是根据桃蚜的同源基因序列 (XM_001950855) 设计兼并引物, 从 棉蚜cDNA扩增而来。 扩增片段克隆到pGEM-T easy载体 (promega) , 经测序确定序列为SEQ ID NO:1。 0035 pRNAiAV2载体构建流程如下: 0036 1 .用 引 物 A V 2 _ F(C C C G G G T T C A T A C A G T A A A T A T A C A A)和 A V 2 _ R (TCTAGATATAACTGATCAAAGTCAGCACGG)扩增AV2的部分片段, 在片段的两端分别引入XmaI和 XbaI位点; 将扩增的片段。
19、克隆到pGEM-T easy载体 (promega) 测序; 0037 2.用XmaI和XbaI从1.中T载体上把AV2片段切下, 命名为AV2_XX; 0038 3.用XmaI和XbaI消化pBiRolCPOAS, 回收载体片段, 并与AV2_XX连接, 构建得到载 体pRolAV; 0039 4.用BspEII和AvrII消化pRolAV, 回收载体片段, 并与AV2_XX连接, 构建得到载体 pRNAiAV2。 0040 实施例4: 获得转基因拟南芥 0041 用电击转化法将质粒pRNAiAV2导入农杆菌GV3101中, 用于转化拟南芥。 0042 拟南芥转化采用蘸花法。 哥伦比亚生态型。
20、拟南芥被用于转化: 将拟南芥种在蛭石 和草炭土 (1:1) 的盆钵中, 置到短日照 (光照8h/16h黑暗) 培养室里, 22培养1个月; 将光周 期改为 (16h光照/8h黑暗) , 继续培养12周, 待花薹抽出后即可用于转化。 使用200 l的移 液器将准备好的农杆菌浸染液滴在花上。 浸染后的拟南芥植株用保鲜膜覆盖保湿, 24小时 后去除保鲜膜。 隔一周后重复处理1次。 浸染后的植株在同样的生长条件使其正常生长, 收 获种子。 说明书 3/4 页 5 CN 103320465 B 5 0043 将上述转化的拟南芥种子播种在含有50 g/ml的卡那霉素的1/2MS固体培养基上。 经16h光照。
21、/8h黑暗的培养室里培养约1014天, 选择绿色、 生长良好的植株 (T1代转基因植 株) 移栽到含有蛭石和草炭土 (1:1) 的盆钵中, 收获自交种子; 将自交种子继续播种在卡那 霉素培养基中, 筛选抗卡那霉素植株, 自交收获种子, 每个T1植株收获8个自交二代植株种 子; 每个自交T2植株播种100粒种子于卡那霉素培养基上, 观察幼苗 (T3植株) 是否存在抗性 分离, 留取不分离的 (纯合) 株系。 0044 实施例5: 转基因植物对取食棉蚜基因的抑制作用 0045 随机选取3个转基因拟南芥株系, 每个株系取9株用接种棉蚜。 每株接种20只蚜虫, 用防虫网隔离, 放置在光照培养箱中培养,。
22、 饲喂7天后, 收集棉蚜, 用Trizol按照说明书提取 棉蚜总RNA, 再经过DNAI消化后, 按照Ferment Revet AidTM H-Minus First Stand CDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA的。 荧光定量PCR试剂; Ferment Revet AidTM H-Minus First Stand CDNA Synthesis Kit购自Ferment公司。 0046 表2.棉蚜基因表达分析所用引物 0047 引物名称核酸序列 AG.AV2O598FGGCACGTCATGTTGTTGAGT AG.AV2O714RGGGTCCTTGAACTTCATGG。
23、A Ag.Rpl7.38FTGCCGGAGTCTGTACTCAA Ag.Rpl7.292RTCACACCACGAATACGCA 0048 棉蚜基因的转录表达分析采用实时荧光定量PCR方法。 PCR预混试剂为Roche公司 的LightCyclerSYBR GREEN I Master。 内参基因为棉蚜Rp17基因, 引物见表2。 反应程 序: 94预变性5min; 9415s, 5830s, 7220s, 共40个循环; 72下延伸10min。 基因表达 量采用2- CT法进行计算。 结果显示, 与喂食野生型拟南芥的蚜虫相比, 取食转基因拟南芥 的蚜虫, 其AV2基因的表达受到明显抑制 (图4。
24、) 。 0049 应当理解的是, 对本领域普通技术人员来说, 可以根据上述说明加以改进或变换, 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说明书 4/4 页 6 CN 103320465 B 6 0001 序列表 1/6 页 7 CN 103320465 B 7 0002 序列表 2/6 页 8 CN 103320465 B 8 0003 序列表 3/6 页 9 CN 103320465 B 9 0004 序列表 4/6 页 10 CN 103320465 B 10 0005 序列表 5/6 页 11 CN 103320465 B 11 0006 序列表 6/6 页 12 CN 103320465 B 12 图1 说明书附图 1/3 页 13 CN 103320465 B 13 图2 图3 说明书附图 2/3 页 14 CN 103320465 B 14 图4 说明书附图 3/3 页 15 CN 103320465 B 15 。