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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510675991.8 (22)申请日 2015.10.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105132295 A (43)申请公布日 2015.12.09 (83)生物保藏信息 CGMCC No.10924 2015.05.27 (73)专利权人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 茆振川张晓平马玉琴凌键 陈国华杨宇红谢丙炎 (74)专利代理机构 北京东正专利代理事务所 (普通合伙) 113。
2、12 代理人 张立娟 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (56)对比文件 CN 103484380 A,2014.01.01, 罗振亚. “防治棉花苗期病害的生物丸化种 衣剂的研制” . 中国优秀硕士学位论文全文数据 库 （农业科技辑） .2011, (第S1期),摘要， 正文第 14-15页. 马金慧 等. “哈茨木霉菌株TRI2的鉴定及其 对黄瓜根结线虫的防治作用” . 中国农学通报 .2014,第30卷(第22期),摘要， 第264页左栏第3 。
3、段. 马金慧 等. “哈茨木霉菌株TRI2的鉴定及其 对黄瓜根结线虫的防治作用” . 中国农学通报 .2014,第30卷(第22期),摘要， 第264页左栏第3 段. 审查员 蔺娜 (54)发明名称 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种拟哈茨木霉菌菌株及其 应用， 所述菌株为拟哈茨木霉菌菌株Thar2， 保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏编号为CGMCCNO.10924。 拟哈茨木霉 菌菌株Thar2制备的生防种衣剂在防治根结线虫 中的应用。 拟哈茨木霉菌Thar2菌株为从土壤中 分离到的真菌， 对作物安全无害， 且对根结线虫 具有防治作用， 。
4、在应用中具有安全性， 适用于根 结线虫的生物防治。 拟哈茨木霉菌Thar2菌株发 酵液对根结线虫二龄幼虫的致死率达到98.8 以上， 在温室中的防治效果达到83.5， 防治效 果高且稳定， 适于农业生产需求。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 105132295 B 2018.06.22 CN 105132295 B 1.一种拟哈茨木霉菌菌株， 其特征在于， 所述菌株为拟哈茨木霉菌菌株Thar2， 保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC NO.10924。 2.权利要求1所述的拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂。 3.权利要求2所述的拟哈茨木霉菌菌株。
5、制备的生防种衣剂在防治根结线虫中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述根结线虫为南方根结线虫和/或北方 根结线虫。 5.权利要求1所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法， 其特征在于， 该方 法包括以下步骤： (1)将拟哈茨木霉菌Thar2接种于PDB培养基中振荡培养， 获得孢子浓度为107-1010/ml 的孢子悬浮液； (2)将步骤(1)的孢子悬浮液1-2L与硅藻土500-700g、 玉米粉200-400g、 麦麸50-150g混 合均匀后， 进行固体发酵， 得到固体发酵物； (3)将步骤(2)的固体发酵物粉碎， 过60目筛， 得到孢子粉， 孢子粉与粘着剂、 。
6、分散剂、 防 腐剂混合后， 制备得到生防种衣剂。 6.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法， 其特征在于， 步骤(1)中PDB培养基配方为： 马铃薯200g/L， 葡萄糖20g/L， 余量为水。 7.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法， 其特征在于， 步骤(1)中培养条件为25-28， 振荡培养6-8天。 8.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 在28-30条件下进行固体发酵， 发酵6-8天后， 于室温条件下干燥3-5天， 得到 固体发酵物。 9.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于。
7、制备生防种衣剂的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 孢子粉、 粘着剂、 分散剂、 防腐剂的质量比为85-90： 1-3： 8-10： 1-2。 10.根据权利要求5所述的拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法， 其特征在 于， 步骤(3)中， 粘着剂为羧甲基纤维素钠， 分散剂为木质素磺酸钠， 防腐剂为链霉素。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105132295 B 2 一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域， 具体涉及一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用。 背景技术 0002 根结线虫(Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。 已知危害蔬。
8、 菜的线虫主要有花生根结线虫、 北方根结线虫、 南方根结线虫、 爪哇根结线虫以及甜菜根结 线虫等。 线虫寄主范围广泛， 常危害瓜类、 茄果类、 豆类及萝 卜、 葫萝 卜、 莴苣、 白菜等30多种蔬 菜， 还能传播一些真菌和细菌性病害。 根结线虫是一种重要的农作物病原物， 每年造成大约 数十亿的损失。 根结线虫主要侵染农作物的根部， 侵染后的根部膨大形成巨大的根结， 可互 连接形成串珠状， 由于根部被破坏， 影响正常的吸收机能， 所以地上部生长发育受阻， 被侵 染后的植株地上部表现矮化， 叶部黄化， 结果小而且少。 天气干燥时易萎蔫或枯萎。 长期连 作的温室中， 特别是西甜瓜、 黄瓜、 番茄等作。
9、物上可以造成绝产。 0003 由于抗根结线虫病的种质资源稀少， 所以在生产中化学防治仍然是防治根结线虫 的重要措施， 如棉隆、 氯化苦和百亩威等， 这些药剂虽然杀虫快， 但是会严重降低蔬菜质量， 污染环境， 破坏生态平衡， 使用过程中对人、 畜不安全， 因此生物防治措施日益受到人们的 关注。 发明内容 0004 本发明的目的是为了解决现有技术中化学防治存在的污染环境、 不安全的问题， 提供一种拟哈茨木霉菌菌株及其应用。 0005 为实现上述目的， 本发明提供了一种拟哈茨木霉菌菌株， 所述菌株为拟哈茨木霉 菌菌株Thar2， 其微生物保藏编号为CGMCC NO .10924； 分类命名是： Tr。
10、ichoderma pseudoharzianum； 保藏时间： 2015年5月27日； 保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所； 保藏单位： 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC)。 0006 本发明还提供了拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂。 0007 本发明还提供了拟哈茨木霉菌菌株制备的生防种衣剂在防治根结线虫中的应用。 0008 优选的， 所述根结线虫为南方根结线虫和/或北方根结线虫。 0009 本发明还提供了拟哈茨木霉菌菌株用于制备生防种衣剂的方法， 该方法包括以下 步骤： 0010 (1)将拟哈茨木霉菌Thar2接种于PDB。
11、培养液中振荡培养， 获得孢子浓度为107- 1010/ml的孢子悬浮液； 0011 (2)将步骤(1)的孢子悬浮液1-2L与硅藻土500-700g、 玉米粉200-400g、 麦麸50- 150g混合均匀后， 进行固体发酵， 得到固体发酵物； 0012 (3)将步骤(2)的固体发酵物粉碎， 过60目筛， 得到孢子粉， 孢子粉与粘着剂、 分散 剂、 防腐剂混合后， 制备得到生防种衣剂。 说明书 1/5 页 3 CN 105132295 B 3 0013 优选的， 步骤(1)中PDB培养液配方为： 马铃薯200g/L， 葡萄糖20g/L， 余量为水。 0014 优选的， 步骤(1)中培养条件为25。
12、-28， 振荡培养6-8天。 0015 优选的， 步骤(2)中， 在28-30条件下进行固体发酵， 发酵6-8天后， 于室温条件下 干燥3-5天， 得到固体发酵物。 0016 优选的， 步骤(3)中， 孢子粉、 粘着剂、 分散剂、 防腐剂的质量比为85-90： 1-3： 8-10： 1-2。 0017 优选的， 步骤(3)中， 粘着剂为羧甲基纤维素钠， 分散剂为木质素磺酸钠， 防腐剂为 链霉素。 0018 本发明的有益效果为： 0019 (1)拟哈茨木霉菌Thar2菌株为从土壤中分离到的真菌， 对作物安全无害， 且对根 结线虫具有防治作用， 在应用中具有安全性， 适合用于根结线虫的生物防治。 。
13、0020 (2)使用方法简单实用： 将拟哈茨木霉菌菌株制成生防种衣剂， 对种子进行丸化包 衣， 工艺简单实用。 0021 (3)防治效果高且稳定： 拟哈茨木霉菌Thar2菌株发酵液对根结线虫二龄幼虫的致 死率达到98.8以上， 在温室中的防治效果达到83.5， 防治效果高且稳定， 适于农业生产 需求。 附图说明 0022 图1为本发明的拟哈茨木霉菌菌株Thar2的细胞形态图； 0023 图2为本发明的拟哈茨木霉菌菌株Thar2的菌落形态图； 0024 图3为本发明的拟哈茨木霉菌菌株Thar2的TEF和ITS片段的PCR扩增结果图。 具体实施方式 0025 下面结合实施例和附图对本发明进行详细地。
14、解释说明。 0026 实施例1 0027 木霉菌的分离、 纯化及鉴定： 0028 从顺义番茄种植田块中均匀取土壤样品， 10g土壤分别与100ml灭菌水进行混合制 成悬浮液， 然后依次进行梯度稀释， 取稀释10000倍的土壤混液100 l涂布于PDA培养基平板 上， 即马铃薯200g， 葡萄糖20g， 琼脂17g， 蒸馏水定容至1000ml。 将此培养基在121灭菌， 在 培养皿中铺制成平板。 PDA培养基中含有75 g/ml氨苄青霉素， 抑制细菌生长。 将培养基置于 25培养， 待组织块长出菌落后， 进行单孢分离， 挑取单菌落在PDA培养基上纯化， 用于分类 鉴定。 根据 真菌鉴定手册 对菌。
15、株进行形态学测定。 0029 挑取菌落菌丝， 放入盛有300 l真菌裂解液的EP管中， 65裂解2小时， 然后用真菌 基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取真菌DNA， 以DNA为模板， 用引物ITS1、 ITS4和EF1H、 EF2T分别进行ITS和tef1序列扩增。 PCR扩增反应体系为20 l， 含有10 l PCRMaster Mix， 1 l正向引物， 1 l反向引物， 2 l DNA模板， Taq酶0.5 l， 无菌水5.5 l。 扩增 条件： 944min， 9455s， 5530s， 7250s， 30个循环； 727min。 扩增产物经1琼脂糖凝 胶电泳分离鉴定，。
16、 PCR产物直接进行双向测序。 0030 结果： 说明书 2/5 页 4 CN 105132295 B 4 0031 参见附图1， 获得Thar2菌株在PDA培养基平板上， 25， 培养3天后， 菌落直径为40- 60mm， 菌落绿色。 菌丝分隔， 透明， 表面光滑， 气生菌丝少， 直径为1-7 m。 在主分枝底部着生 许多粗短的次级分枝。 分生孢子梗对生或互生呈树枝状分枝， 顶端小梗呈瓶形， 小梗顶端生 分生孢子团， 分生孢子梗主轴上部弯曲。 分生孢子梗长度可达60 m， 基部宽5 m， 尖端下部产 生1-2个轮生瓶状孢子梗， 孢子梗长6.8-13.2 m， 最宽为2.5-3.5 m， 基部。
17、为2.0-3.0 m.。 分 生孢子多为椭球形， 呈淡绿色， 大小为2.5-4.52-4 m。 依照 真菌鉴定手册 对Thar2菌株 形态进行测定， 确定该菌株为拟哈茨木霉菌(Trichoderma pseudoharzianum)。 0032 用引物ITS1、 ITS4和EF1H、 EF2T分别进行ITS和tef1序列扩增， PCR产物经1琼脂 糖凝胶电泳， 凝胶成像参见附图2所示。 经测序分析菌株扩增的ITS序列和tef1序列长约为 570bp和880bp。 将菌株的ITS和tef1序列进行BLAST分析后， 结果显示， Thar2菌株与拟哈茨 木霉菌(Trichoderma pseudo。
18、harzianum)相似度达到了100。 鉴定Thar2菌株为拟哈茨木 霉菌(Trichodermapseudoharzianum)。 0033 实施例2 0034 拟哈茨木霉菌种衣剂的制备及应用： 0035 将Thar2菌种分别接种到250ml的三角瓶中， 每瓶含有PDB液体培养液125ml， 在25 中震荡(160rpm)培养8天， 得到大量的菌丝体和分生孢子。 液体发酵培养基为马铃薯葡萄 糖液体(PDB)培养基， 即马铃薯200g， 葡萄糖20g， 蒸馏水定容至1000ml。 0036 将液体摇菌培养(发酵)所得的孢子菌丝体混合液， 孢子浓度为107个/ml)， 加入以 下成分： 比例如。
19、下： 孢子液1L、 硅藻土500g、 玉米粉200g、 麦麸50g， 混合均匀后， 置于28条 件下进行固体二次发酵， 发酵6d结束后， 将固体发酵物放在室温条件下自然干燥3d(发酵物 含水量控制在15-25之间)、 粉碎、 过60目筛， 得到孢子粉。 将孢子粉与粘着剂(羧甲基纤维 素钠)、 分散剂(木质素磺酸钠)、 防腐剂(链霉素)混合， 制备得到生防种衣剂， 其中， 孢子粉、 粘着剂、 分散剂、 防腐剂的质量比为85： 3： 10： 2， 然后种衣剂与种子搅拌均匀， 使孢子粉均匀 包衣在种子表面， 即完成生防种衣剂对黄瓜种子的丸化包衣处理， 种衣剂与种子的重量比 为1:10(w/w)。 0。
20、037 实施例3 0038 拟哈茨木霉菌种衣剂的制备及应用： 0039 将Thar2菌种分别接种到250ml的三角瓶中， 每瓶含有PDB液体培养液125ml， 在28 中震荡(160rpm)培养6天， 得到大量的菌丝体和分生孢子。 液体发酵培养基为马铃薯葡萄 糖液体(PDB)培养基， 即马铃薯200g， 葡萄糖20g， 蒸馏水定容至1000ml。 0040 将液体摇菌培养(发酵)所得的孢子菌丝体混合液， 孢子浓度为1010个/ml)， 加入以 下成分： 比例如下： 孢子液2L、 硅藻土700g、 玉米粉400g、 麦麸150g， 混合均匀后， 置于30条 件下进行固体二次发酵， 发酵8d结束后。
21、， 将固体发酵物放在室温条件下自然干燥5d(发酵物 含水量控制在15-25之间)、 粉碎、 过60目筛， 得到孢子粉。 将孢子粉与粘着剂(羧甲基纤维 素钠)、 分散剂(木质素磺酸钠)、 防腐剂(链霉素)混合， 制备得到生防种衣剂， 其中， 孢子粉、 粘着剂、 分散剂、 防腐剂的质量比为90： 1： 8： 1， 然后种衣剂与种子搅拌均匀， 使孢子粉均匀 包衣在种子表面， 即完成生防种衣剂对黄瓜种子的丸化包衣处理， 种衣剂与种子的重量比 为1:10(w/w)。 0041 实施例4 说明书 3/5 页 5 CN 105132295 B 5 0042 拟哈茨木霉菌Thar2菌株的杀线虫效果： 0043。
22、 1、 Thar2菌株发酵液的制备 0044 将Thar2菌种分别接种到250ml的三角瓶中， 接种量为10， 每瓶含有PDB液体培养 液125ml， 在25-28中震荡(160rpm)培养7天， 将发酵液及其10倍、 100倍稀释液分别处理根 结线虫(Meloidogyne spp.)， 测定拟哈茨木霉菌发酵产物对根结线虫的杀死效果。 0045 2、 制备试验用线虫 0046 采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。 将辣椒根系取出， 用水轻轻冲洗， 小心 取下卵块， 放在1的次氯酸钠中消毒3min， 再用无菌水冲洗3次， 放在含有少量无菌水的培 养皿中， 在25恒温箱中培养， 每24h收集一。
23、次孵化的根结线虫J2幼虫。 0047 3、 试验方法 0048 在无菌的细胞培养板上， 分别向孔内加入不同浓度的发酵液1ml。 并以无菌水作为 对照， 然后分别向处理和对照中加入100 l线虫悬浮液(100条线虫)， 放在室温下24h， 观察 根结线虫的死亡情况， 计算校正死亡率， 即为杀线虫效果， 每个处理重复3次。 每个处理做24 个孔(样本)， 每个试验重复3次。 0049 校正死亡率()(处理线虫死亡率对照线虫死亡率)/(1对照线虫死亡率) 100 0050 4、 试验结果： 0051 通过上述试验， 测定不同倍数发酵液处理24h对根结线虫的毒力效果， 试验结果见 表1， 结果表明不同。
24、发酵液倍数对线虫的作用效果不同， 发酵液原液的作用根结线虫的校正 死亡率为98.8， 发酵液稀释后防治效果明显降低， 在10倍稀释液中杀线虫率只有73.5， 而在100倍稀释液中线虫死亡率很低(10)， 与对照的差异很小。 试验表明发酵液在高浓 度下具有良好的防治根结线虫效果。 0052 表1不同浓度的Thar2菌株发酵液杀线虫效果 0053 线虫死亡率原液()10倍液()100倍液()清水对照() 重复110072.55.21.0 重复210077.37.61.4 重复310074.311.51.2 校正死亡率98.873.56.9- 0054 实施例5 0055 拟哈茨木霉菌种衣剂处理对根。
25、结线虫的防治效果： 0056 按照前述方法对黄瓜种子采用生防种衣剂剂进行丸化处理后， 将种子种植到苗钵 中。 在种子发芽后， 幼苗出现第一片真叶时接种南方根结线虫二龄幼虫， 每株接种400条， 并 在5周后检测根结数量， 计算防治效果。 每个处理做三个小区， 每个小区30株苗木， 每个处理 重复3次。 并以未进行生防种衣剂包衣处理的种子处理作为对照。 0057 根结线虫病情分级标准为： 0058 表2黄瓜抗南方根结线虫病室内鉴定病情级别划分 说明书 4/5 页 6 CN 105132295 B 6 0059 0060 根结指数计算： 0061 调查每份鉴定材料根部发病情况， 根据病害症状描述，。
26、 逐份材料进行调查， 记载病 情级别， 计算出根结指数(RKI)。 0062 根结指数按下列公式计算： 0063 根结指数()(sn)/NM100 0064 式中： 0065 各病情级别代表数值与其相对应病情级别病株数乘积的总和； 0066 s各病情级别代表数值； 0067 n各病情级别病株数； 0068 N调查总株数； 0069 M最高病情指数。 0070 防治效果计算公式： 0071 防治效果()(1处理根结数/对照根结数)100 0072 3、 试验结果 0073 试验结果见表3， 通过试验可以看出在生防种衣剂处理后黄瓜植株上的根结数量 显著降低， 在对照处理中根结数量平均为171.2个。
27、/株， 而在生防种衣剂处理的黄瓜中的根 结数量平均为28.3个/株， Thar2菌株丸化种对根结线虫的防治效果达到了83.5， 表明生 防种衣剂可以有效地防治黄瓜根结线虫。 在农业生产， 特别是设施黄瓜栽培中防治根结线 虫病具有重要价值。 0074 表3不同处理的根结数量及防治效果 0075 处理效果重复1重复2重复3根结平均数防治效果 对照169.2163.2181.2171.2- 丸化种衣剂25.130.529.228.383.5 0076 本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明实质内容上所作的 任何修改、 等同替换和简单改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 105132295 B 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 105132295 B 8 图3 说明书附图 2/2 页 9 CN 105132295 B 9 。