技术领域
本发明涉及一种生物药的提取工艺，尤其涉及一种复合凝乳酶的提取工艺，属生物 制药技术领域。
背景技术
根据“十二五”、“十三五”计划—医药行业在国民经济中的地位不断上升，生物医药已 被列为国家战略性新兴产业重要领域。此外，随着科学不断的发展，生化药物来自有机体， 成分多属生物大分子，易为人体吸收，并直接参与人体的新陈代谢，能调节、补充、恢复和 维持人体的正常功能。生化药物疗效好，副作用小、靶向性强，见效快，被人们越来越重视。
胃部疾病是发生于胃部的器质性或功能性疾病。临床上常见的有慢性胃炎、消化性溃疡、 胃下垂和胃癌等。病因十分复杂，包括理化刺激、感染、毒素、遗传、精神因素、发育障碍、 手术影响等。主要症状有上腹痛、灼心、恶心、呕吐、嗳气、反酸、食欲不振、呕血、便血、 肿块等。胃部疾病严重影响着人们的身体健康。
为顺应药业发展趋势以及解决胃部疾病长期困扰人类健康的问题，开发生物胃动力药技 术，充分发挥生化药品对人体的治疗效果是制药企业肩负的重大使命。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种复合凝乳酶的提取工艺，该 提取工艺具有时间短、反应条件温和、不污染环境、所得复合凝乳酶体外凝乳活力高等优点。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种复合凝乳酶的提取工艺，其包括使用酸溶液刺激活化羔绵羊第四胃碎末的步骤。
上述复合凝乳酶的提取工艺，所述酸溶液为5%—10%的盐酸或冰醋酸溶液。
上述复合凝乳酶的提取工艺，所述羔绵羊第四胃碎末直径为140mm—220mm。
上述复合凝乳酶的提取工艺，其包括如下步骤：
（1）原材制备：取羔绵羊第四胃300g，置绞肉机中绞成140mm—220mm直径大小的碎末， 备用；
（2）刺激活化：将步骤（1）所得碎末放入烧杯并加纯化水120-400ml，然后置水浴中 加热，升温到35-47℃，搅拌均匀后，用5%—10%的盐酸或冰醋酸溶液调节pH值到3.5—4.5， 不断搅拌激活3至4小时，放冷，80目滤布过滤，收集滤液，备用；
（3）收集沉淀：向步骤（2）所得滤液中加入滤液重量2.5—4.5倍的丙酮或乙醇，搅拌 均匀20分钟，静置20分钟，倾去上清液收集沉淀物，备用；
（4）目标产物：将步骤（3）所得沉淀物置烧杯中加入750ml丙酮或乙醇，搅拌10分钟， 倾去丙酮或乙醇，按此法反复洗涤4-5次，然后将洗涤物置真空干燥箱中40℃干燥，得复合 凝乳酶。
优选的上述复合凝乳酶的提取工艺，其包括如下步骤：
（1）原材制备：取羔绵羊第四胃300g，置绞肉机中绞成180mm直径大小的碎末，备用；
（2）刺激活化：将步骤（1）所得碎末放入烧杯并加纯化水350ml，然后置水浴中加热， 升温到41℃，搅拌均匀后，用8%的盐酸或冰醋酸溶液调节pH值到4，不断搅拌激活3.5小 时，放冷，80目滤布过滤，收集滤液，备用；
（3）收集沉淀：向步骤（2）所得滤液中加入滤液重量3.5倍的丙酮或乙醇，搅拌均匀 20分钟，静置20分钟，倾去上清液收集沉淀物，备用；
（4）目标产物：将步骤（3）所得沉淀物置烧杯中加入750ml丙酮或乙醇，搅拌10分钟， 倾去丙酮或乙醇，按此法反复洗涤5次，然后将洗涤物置真空干燥箱中40℃干燥，得复合凝 乳酶。
本发明所述的一种复合凝乳酶的提取工艺，各步骤、各参数之间相互配合，共同作用， 使得该提取工艺具有不仅反应时间短、反应条件温和、不适用大量有机溶剂不污染环境，而 且收率高达25.6%，所得复合凝乳酶体外凝乳活力高达950凝乳单位，蛋白活力高达900单 位，为复合凝乳酶的提取工艺研究开拓了新的思路。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1复合凝乳酶的提取
步骤如下：
（1）原材制备：取羔绵羊第四胃300g，置绞肉机中绞成140mm直径大小的碎末，备用；
（2）刺激活化：将步骤（1）所得碎末放入烧杯并加纯化水200ml，然后置水浴中加热， 升温到35℃，搅拌均匀后，用5%的盐酸或冰醋酸溶液调节pH值到3.5，不断搅拌激活3小 时，放冷，80目滤布过滤，收集滤液，备用；
（3）收集沉淀：向步骤（2）所得滤液中加入滤液重量2.5倍的丙酮，搅拌均匀20分钟， 静置20分钟，倾去上清液收集沉淀物，备用；
（4）目标产物：将步骤（3）所得沉淀物置烧杯中加入750ml丙酮，搅拌10分钟，倾去 丙酮，按此法反复洗涤4次，然后将洗涤物置真空干燥箱中40℃干燥，得复合凝乳酶64克， 收率21.3%。
实施例2复合凝乳酶的提取
步骤如下：
（1）原材制备：取羔绵羊第四胃300g，置绞肉机中绞成220mm直径大小的碎末，备用；
（2）刺激活化：将步骤（1）所得碎末放入烧杯并加纯化水500ml，然后置水浴中加热， 升温到47℃，搅拌均匀后，用10%的冰醋酸溶液调节pH值到4.5，不断搅拌激活4小时，放 冷，80目滤布过滤，收集滤液，备用；
（3）收集沉淀：向步骤（2）所得滤液中加入滤液重量4.5倍的乙醇，搅拌均匀20分钟， 静置20分钟，倾去上清液收集沉淀物，备用；
（4）目标产物：将步骤（3）所得沉淀物置烧杯中加入750ml乙醇，搅拌10分钟，倾去 乙醇，按此法反复洗涤5次，然后将洗涤物置真空干燥箱中40℃干燥，得复合凝乳酶75克， 收率25.3%。
实施例3复合凝乳酶的提取
步骤如下：
（1）原材制备：取羔绵羊第四胃300g，置绞肉机中绞成180mm直径大小的碎末，备用；
（2）刺激活化：将步骤（1）所得碎末放入烧杯并加纯化水350ml，然后置水浴中加热， 升温到41℃，搅拌均匀后，用8%的盐酸溶液调节pH值到4，不断搅拌激活3.5小时，放冷， 80目滤布过滤，收集滤液，备用；
（3）收集沉淀：向步骤（2）所得滤液中加入滤液重量3.5倍的丙酮，搅拌均匀20分钟， 静置20分钟，倾去上清液收集沉淀物，备用；
（4）目标产物：将步骤（3）所得沉淀物置烧杯中加入750ml丙酮，搅拌10分钟，倾去 丙酮，按此法反复洗涤5次，然后将洗涤物置真空干燥箱中40℃干燥，得复合凝乳酶77克， 收率25.6%。
实施例4复合凝乳酶的提取
步骤如下：
（1）原材制备：取羔绵羊第四胃300g，置绞肉机中绞成180mm直径大小的碎末，备用；
（2）刺激活化：将步骤（1）所得碎末放入烧杯并加纯化水350ml，然后置水浴中加热， 升温到41℃，搅拌均匀后，用8%的冰醋酸溶液调节pH值到4，不断搅拌激活3.5小时，放 冷，80目滤布过滤，收集滤液，备用；
（3）收集沉淀：向步骤（2）所得滤液中加入滤液重量3.5倍的乙醇，搅拌均匀20分钟， 静置20分钟，倾去上清液收集沉淀物，备用；
（4）目标产物：将步骤（3）所得沉淀物置烧杯中加入750ml乙醇，搅拌10分钟，倾去 乙醇，按此法反复洗涤5次，然后将洗涤物置真空干燥箱中40℃干燥，得复合凝乳酶78克, 收率26.3%。
实施例5取实施例1至3所提取的复合凝乳酶进行效价测定
【凝乳酶】
①底物溶液的制备取全脂奶粉12g，加氯化钙溶液（取醋酸钠2.05g，氯化钙1.11g， 加水使溶解成1000ml，调节PH值至6.3±0.1）适量，研磨均匀，置100ml量瓶中，加氯化 钙溶液至刻度，摇匀。本液应临用新配。
②标准品溶液的制备取凝乳酶标准品，精密称定，加磷酸盐缓冲液（PH6.3）（取磷酸 二氢钠7.8g，磷酸氢二钠2.7g，加水使溶解成1000ml，调节pH值至6.3±0.05）溶解并稀 释成每1ml中含0.4～0.6个活力单位的溶液。此液应保持在20℃以下，并在配制后2小时内 使用。
③供试品溶液的制备实施例1至4所提取的复合凝乳酶分别进行如下操作，取本品约 0.1g，精密称定，置乳钵中，加磷酸盐缓冲液（pH6.3）少量，研磨均匀，置100ml量瓶中， 加磷酸盐缓冲液（pH6.3）至刻度，摇匀。此液应保持在20℃以下，临用新配。
④测定法精密量取底物溶液10ml，置试管中，在30℃±0.5℃恒温水浴中保温10分钟， 精密加入标准品溶液1ml，摇匀并立即计时，用玻璃棒不断蘸取溶液沿管壁流下，使成均匀 薄层，当薄层出现可见颗粒时表明已经凝乳，准确记录自标准品溶液加入后至出现凝乳现象 的时间。重复测定三次，三次测定值的相对标准偏差不得大于5%。取三次的平均值作为标准 品溶液的凝乳时间。取用实施例1至4提取的复合凝乳酶所制备的供试品溶液1ml，依法操 作，按下式计算。
式中S-------标准品的活力，Ru/mg；
Ts-------标准品溶液的平均凝乳时间，秒；
T--------供试品溶液的平均凝乳时间，秒；
Ws--------标准品溶液每1ml中含凝乳酶标准品的量，g；
W-------供试品取样量，g；
N--------供试品稀释倍数。
注：凝乳时间在180～240秒时重现性最好。否则供试液浓度应加以调整。
【蛋白酶】
①参比品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重酪氨酸适量，加盐酸溶液（取1mol/L 盐酸溶液65ml，加水至1000ml）制成每1ml中含0.4mg的溶液。
②供试品溶液的制备取本品约0.2g，精密称定，用上述盐酸溶液研磨使溶解，置100ml 量瓶中，加上述盐酸溶液至刻度，摇匀。
③测定法照胃蛋酶活力测定项下的方法（中国药典2010年版二部530页）测定。
【结果】见表1.
表1实施例1至4所提取的复合凝乳酶的效价
实施例1 实施例2 实施例3 实施例3 体外凝乳活力 870凝乳单位 910凝乳单位 950凝乳单位 940凝乳单位 蛋白酶活力 830单位 870单位 900单位 900单位
上述实施例只为说明本发明的技术构思和优点，本发明也可以具有其它的形式变化，如 本领域技术人员所熟知，上述实施例仅仅起到对上述发明保护范围内的示范作用，对本领域 普通技术人员来说，在本发明所限定的保护范围内还有很多常规变形和其它实施例，这些变 形和实施例都将在本发明待批的保护范围之内。