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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310532582.3 (22)申请日 2013.10.29 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103525863 A (43)申请公布日 2014.01.22 (73)专利权人 泰安市泰山林业科学研究院 地址 271000 山东省泰安市罗汉崖路1号 (72)发明人 黄艳艳罗磊冯殿齐刘静 赵进红张虹王玉山 (51)Int.Cl. C12N 15/84(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A01H 5/00(2006.01) 审查员 毛舒燕 。
2、(54)发明名称 一种枣树抗病基因转化的方法 (57)摘要 本发明涉及一种枣树抗病基因转化的方法， 属于植物生物技术领域。 具体步骤包括： (1)预培 养受体材料； (2)制备侵染液： 包括： 农杆菌菌 液制备； MS母液的制备； (3)侵染受体材料； (4) 共培养； (5)抑菌及卡那霉素筛选培养； (6)分子 检测。 本发明采用双层培养基进行共培养， 既有 效保证了受体的充足营养， 又克服了共培养期间 因农杆菌过度繁殖对受体材料正常生长的抑制 作用， 并减轻了后期抑菌困难的问题； 具有较高 的可重复性， 在一定程度上缩短了枣树遗传育种 的周期， 使木本植物宁阳大枣难于进行基因介导 的难题和。
3、因受体材料原因导致的侵染效率低下 问题得以改善， 为进一步的遗传育种研究提供一 种新的途径。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 103525863 B 2016.10.19 CN 103525863 B 1.一种枣树抗病基因转化的方法， 其特征在于： 所述方法具体步骤如下： (1)预培养受体材料； 选择大枣组培苗进行取材， 组培苗应生长健壮， 无玻璃化及枯黄 现象， 高度13cm， 贴近培养基的茎基部粗度目测高于1mm， 每段茎段长度为11.5cm， 至少 保留一个芽， 将剪取的茎段浅嵌于分化培养基表面， 培养基厚度12cm， 每瓶培养基体积15 20ml， 每瓶培养基可放68个茎段。
4、； 将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养26d， 培养温度25左右； (2)制备侵染液： 包括： 农杆菌菌液制备： 挑取农杆菌菌株LBA4404的单菌落接种到 5ml含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液体培养基中， 在温度2530， 震荡转速160 200rpm条件下培养1248h， 然后取15ml转接于100ml含有50mg/L卡那霉素的YEP液体 培养基中， 在温度2530、 转速160200rpm的条件下培养1224h， 菌液OD6000.30.7 时作为备用菌液； MS母液的制备： 本发明所用MS母液为MS培养基常用量的全量MS母液， 按 每升培养基常规用量配制，。
5、 为包括大量元素、 微量元素、 铁盐和有机物四类溶液的混合液， 母液混匀后高压灭菌备用； (3)侵染受体材料： 先将制备好的农杆菌菌液和MS母液按1/31/2体积比混合， 将混合 液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.26.7， 备用； 再将已预培养的受体材料茎段取出， 置于 无菌空培养皿中， 立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段， 再在无菌条件下进行适当刻伤， 对 照材料同时进行同样刻伤处理； 刻伤处理后， 将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内 侵染1520min， 侵染液体积以没过侵染材料为宜， 侵染期间用手间歇摇动侵染瓶， 以使材 料与侵染液充分接触； (4)共培养： 侵染结束， 取出受体茎段。
6、， 用无菌滤纸吸干表面多余液体， 转接于表面加盖 一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上， 仍按每瓶培养基68个茎段放置； 将封好 口的培养瓶置于黑暗条件下共培养24d， 培养温度2328左右； 对照组同样处理； ( 5 )抑菌及卡那霉素筛选培养： 共培养结束， 将受体材料转接于含有卡那霉素 (kanamycin)和抑菌素Cef(头孢霉素)的筛选培养基上继续培养， 分3个阶段进行， 各阶段的 培养基均调节为pH6.27.0； 第一阶段卡那霉素20mg/L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg/L， 培 养610d； 第二阶段卡那霉素40mg/L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg/L， 。
7、培养1520d； 第三 阶段卡那霉素60mg/L， 抑菌素Cef(头孢霉素)200mg/L， 培养2030d； (6)分子检测： 经过上述两个阶段的Cef抑菌和卡那霉素筛选培养， 20d后， 受体茎段表 现出明显分离生长状态， 超过1/3的茎段出现由黄化至枯死的变化， 约2/3茎段萌发出绿色 的抗性新芽， 抗性芽长度为0.51cm； 对存活的抗性芽苗进行采样， 提取抗性芽的DNA并进 行PCR扩增检测， 提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法， 采用CcRIPII2基因序列资 料设计引物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103525863 B 2 一种枣树抗病基因转化的方法 技术领域。
8、 0001 本发明涉及一种枣树抗病基因转化的方法， 属于植物生物技术领域。 背景技术 0002 自古以来， 枣因具有很高的营养保健和药用价值， 受到人们广泛欢迎， 这也使枣产 业成为一些地方经济支柱产业之一， 但枣疯病的蔓延却严重制约了枣产业的健康可持续发 展， 影响了人们对枣果的旺盛需求， 限制了枣产区的经济发展步伐。 0003 1983年来， 植物基因工程发展很快， 但是在果树上应用的研究还很少， 由于果树育 种周期长， 不断地摸索试验快速有效的育种方法是很有意义的。 对于枣疯病的防治， 多采用 化学防治和物理防治等方法， 但效果都难以持久。 因此， 利用基因工程技术， 寻找一种以枣 树本。
9、身为基础， 从根本上解决问题的方法， 提高枣树自身抵抗枣疯病病毒的能力， 成为解决 此问题的一种有效途径。 0004 本项技术发明采用的农杆菌介导的转化方法是目前应用最广的基因转化方法， 具 有操作简便、 成本低、 转化率高的特点， 广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 但其也具有一 定局限性， 即基因介导的效率易受到很多因素的影响， 如受体材料的部位、 年龄、 生长状态 等， 这就需要寻找最适合的搭配组合， 最大限度地提高转化效率。 0005 在实际操作中， 农杆菌介导法要求先建立较完善的植物受体系统， 一般采用的植 物受体材料是叶盘或愈伤组织， 这样可以大大提高转化效率， 但对于很多难于建立高。
10、效再 生体系的木本植物的基因转化就有了很大限制。 在枣树等木本植物基因转化试验中还存在 基因转化困难， 效率低、 周期长、 转化后嵌合体现象严重等问题， 因此， 如何解决枣树等木本 植物基因转化困难并进一步提高基因转化效率成为当前一个亟需解决的问题。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服上述技术的缺陷， 提供一种以枣树组培苗茎段为受体材 料， 以pH6.27.0的MS母液与农杆菌菌液的混合液为侵染液， 受体转化后共培养采用双层 培养基， 抗生素筛选分3个阶段进行的基因转化方法， 以解决木本植物枣树基因转化困难的 问题。 0007 为了实现上述目的， 本发明的技术方案如下： 0008 一种枣。
11、树抗病基因转化的方法， 具体步骤如下： 0009 (1)预培养受体材料： 选择大枣组培苗进行取材， 组培苗应生长健壮， 无玻璃化及 枯黄现象， 高度13cm， 贴近培养基的茎基部粗度目测高于1mm， 每段茎段长度为11.5cm， 至少保留一个芽， 将剪取的茎段浅嵌于分化培养基表面， 培养基厚度12cm， 每瓶培养基体 积约1520ml， 每瓶培养基可放68个茎段； 将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2 6d， 培养温度25左右。 0010 (2)制备侵染液： 包括： 农杆菌菌液制备： 挑取农杆菌菌株LBA4404(由中科院遗 传所提供)的单菌落接种到5ml含有50mg L卡那霉素(Kana。
12、mycin)的YEP液体培养基中， 在温 说明书 1/6 页 3 CN 103525863 B 3 度2530， 震荡转速160200rpm条件下培养1248h， 然后取15ml转接于100ml含有 50mg L卡那霉素的YEP液体培养基中， 在温度2530、 转速160200rpm的条件下培养12 24h， 菌液OD6000.30.7时作为备用菌液； MS母液的制备： 本发明所用MS母液为MS培养 基常用量的全量MS母液， 按每升培养基常规用量配制， 为包括大量元素、 微量元素、 铁盐和 有机物四类溶液的混合液， 母液混匀后高压灭菌备用。 0011 (3)侵染受体材料： 先将制备好的农杆菌菌。
13、液和MS母液按1 31 2体积比混合， 将 混合液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.26.7， 备用； 再将已预培养的受体材料茎段取出， 置于无菌空培养皿中， 立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段， 再在无菌条件下进行适当刻 伤， 对照材料同时进行同样刻伤处理。 刻伤处理后， 将受体材料转移至已盛有侵染液的培养 瓶内侵染1520min， 侵染液体积以没过侵染材料为宜， 侵染期间用手间歇摇动侵染瓶， 以 使材料与侵染液充分接触。 0012 (4)共培养： 侵染结束， 取出受体茎段， 用无菌滤纸吸干表面多余液体， 转接于表面 加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上， 仍按每瓶培养基68个茎段放置。
14、。 将 封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养24d， 培养温度2328左右。 对照同样处理。 0013 (5)抑菌及卡那霉素筛选培养： 共培养结束， 将受体材料转接于含有卡那霉素 (kanamycin)和抑菌素Cef(头孢霉素)的筛选培养基上继续培养， 分3个阶段进行， 各阶段的 培养基均调节为pH6.27.0。 第一阶段卡那霉素20mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg L， 培 养610d； 第二阶段卡那霉素40mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg L， 培养1520d； 第三阶 段卡那霉素60mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)200mg L， 培养2030d。 0014。
15、 (6)分子检测： 经过上述两个阶段的Cef抑菌和卡那霉素筛选培养， 20d后， 受体茎 段表现出明显分离生长状态， 超过1 3的茎段出现由黄化至枯死的变化， 约2 3茎段萌发出 绿色的抗性新芽， 抗性芽长度大约0.51cm。 对存活的抗性芽苗进行采样， 提取抗性芽的 DNA并进行PCR扩增检测， 提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法， 采用CcRIPII2基 因序列资料， 设计引物： 0015 引物1： 5 TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT3 ； 0016 引物2： 5 TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA3 。 0017 通过采用上述基因转化技术方。
16、案， 以枣树组培苗茎段为受体材料， 以MS母液与农 杆菌菌液配伍的混合液为侵染液， 受体转化后共培养采用双层培养基， 抗生素筛选分3个阶 段进行的基因转化方法， 可以明显提高基因转化效率， 经PCR初次检测， 阳性条带检出率可 达100， 对检出的抗性芽Kan纯化培养， 连续继代6次， 抗性苗检出率稳定在50以上。 本实 验方案具有转化材料易得， 转化过程简单易行， 周期短， 可重复性强的优点， 为木本植物宁 阳大枣在基因转化技术方面提供了新的突破。 0018 该发明的有益效果在于： 本发明方案找到了适合宁阳大枣基因转化的材料部位为 茎段， 材料易得， 只要建立快繁无菌体就可以进行基因转化试验。
17、， 突破了基因转化对受体材 料高效再生状态的限制； 采用双层培养基进行共培养， 既有效保证了受体的充足营养， 又克 服了共培养期间因农杆菌过度繁殖对受体材料正常生长的抑制作用， 并减轻了后期抑菌困 难的问题； 在抑菌及卡那霉素筛选培养阶段， 分别以3种筛选培养基逐步进行， 改善了脱离 母体瓶苗茎段的营养状况， 减低和缓解了抑菌筛选药剂对受体材料的毒害作用。 本发明方 案为难于在短时间内获得高效再生体系的枣树等木本植物提供了一种简单有效的基因转 说明书 2/6 页 4 CN 103525863 B 4 化方法， 具有较高的可重复性， 在一定程度上缩短了枣树遗传育种的周期， 使木本植物宁阳 大枣难。
18、于进行基因介导的难题和因受体材料原因导致的侵染效率低下问题得以改善， 为进 一步的抗病遗传育种研究提供一种新的途径。 附图说明 0019 图1为本发明中抗性芽PCR产物电泳图谱(M： DNAmarker， DL2000； 28： 未转基因植 株； 127： 转基因植株； CK+： 阳性对照， 质粒DNA； CK： 阴性对照， 水)。 0020 图2为本发明实施例中抗病性试验PCR检测。 具体实施方式 0021 下面结合实施例进一步阐述该发明的具体实施方式。 0022 实施例1： 0023 选择泰山林科院自主培养的宁阳大枣组培苗进行取材， 组培苗应生长健壮， 无玻 璃化及枯黄现象， 高度1cm，。
19、 贴近培养基的茎基部粗度目测应不低于1mm， 每段茎段长度应为 1cm， 至少保留一个芽， 将剪取的茎段浅嵌于分化培养基表面。 每瓶培养基可放8个茎段。 将 嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2d， 培养温度25左右。 0024 挑取农杆菌菌株LBA4404(由中科院遗传所提供)的单菌落接种到5ml含有50mg L Kan(kanamycin， 卡那霉素)的YEP液体培养基中， 在温度28， 震荡转速170rpm条件下培养 24h， 然后取1ml转接于100ml含有50mg LKan的YEP液体培养基中， 在温度28、 转速180rpm 的条件下震荡培养16h， 至OD6000.4时作为备用。
20、菌液。 0025 以MS培养基常用量的全量MS母液， 按每升培养基常规用量配制， 为包括大量元素、 微量元素、 铁盐和有机物四类溶液的混合液。 母液混匀后高压灭菌备用。 0026 先将制备好的农杆菌菌液和MS母液按1 2体积比混合， 并将混合液倒入空的无菌 培养瓶， 并调节pH6.7备用； 再将已预培养的受体材料茎段取出， 置于无菌空培养皿中， 立即 用配制好的侵染液濡湿受体茎段， 再在无菌条件下进行适当刻伤对照材料同时进行同样刻 伤处理。 刻伤处理后， 将受体材料转移至盛有侵染液的培养瓶内侵染20min， 侵染液体积以 没过侵染材料为宜， 侵染期间用手间歇摇动侵染瓶， 以使材料与侵染液充分接。
21、触； 侵染结 束， 取出受体茎段， 用无菌滤纸吸干表面多余液体， 转接于双层培养基上， 仍按每瓶培养基8 个茎段放置。 将封好口的受体材料培养瓶置于黑暗条件下共培养2d， 培养温度24左右。 对 照同样处理。 0027 共培养结束， 将受体材料转接于含有Kan(kanamycin， 卡那霉素)和抑菌素Cef(头 孢霉素)的筛选培养基上继续培养， 分3个阶段进行， 各阶段的培养基均调节为pH6.27.0。 3个不同阶段不同设置分别为， 第一阶段Kan浓度20mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg L， 培 养时间7d； 第二阶段Kan浓度50mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg。
22、 L， 培养时间28d。 第三阶 段卡那霉素60mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)200mg L， 培养2030d。 0028 经过上述3个阶段的Cef抑菌和Kan筛选培养， 28d后， 受体茎段表现出明显分离生 长状态， 超过1 3的茎段出现由黄化至枯死的变化， 约2 3茎段萌发出绿色的抗性新芽， 抗性 芽长度大约1cm。 本发明方案试验中对存活的抗性芽苗进行采样， 提取抗性芽的DNA并进行 PCR扩增检测， 提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法， 采用CcRIPII2基因序列资 说明书 3/6 页 5 CN 103525863 B 5 料， 设计引物： 0029 引物1： 5 T。
23、CATGGCACCTGATATCACCACCGCT3 ； 0030 引物2： 5 TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA3 ； 0031 PCR反应体系： 0032 ddH2O(16 L) 0033 10Buffer(内含20mmo1 LMgC12)(2 L) 0034 Primer1(0.8 L) 0035 Primer2(0.8 L) 0036 TemplateDNA(1 L) 0037 TaqE(0.3 L) 0038 Tote1(21 L)反应程序： 94预变性4min； 94变性45s； 55复性40s； 72扩增 1min； 共34cycle； 72延伸5min。 00。
24、39 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， 1.0的琼脂糖凝胶电泳， EB染色观察。 0040 GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并拍照留存。 0041 对抗性芽的PCR检测结果表明， 阳性条带检出率为76， 经对检出的抗性芽Kan纯 化培养， 连续继代6次， 抗性苗检出率稳定在55以上， 表明此方法有利于促进枣树基因转 化效率， 见附图1。 0042 实施例2： 0043 选择泰山林科院自主培养的宁阳大枣组培苗进行取材， 组培苗应生长健壮， 无玻 璃化及枯黄现象， 高度2cm， 贴近培养基的茎基部粗度目测应不低于2mm， 每段茎段长度应为 2cm， 至少保留一对芽， 将剪取的。
25、茎段浅嵌于分化培养基表面。 每瓶培养基可放6个茎段。 将 嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养4d， 培养温度25左右。 0044 挑取农杆菌菌株LBA4404(由中科院遗传所提供)的单菌落接种到5ml含有50mg L Kan(kanamycin， 卡那霉素)的YEB液体培养基中， 在温度28， 震荡转速190rpm条件下培养 20h， 然后取2ml转接于100ml含有50mg LKan的YEP液体培养基中， 在温度28、 转速170rpm 的条件下培养20h， 至OD6000.6时作为备用菌液。 0045 以MS培养基常用量的全量MS母液， 按每升培养基常规用量配制， 为包括大量元素、 微量。
26、元素、 铁盐和有机物四类溶液的混合液。 母液混匀后高压灭菌备用。 0046 先将制备好的农杆菌菌液和MS母液按1 3体积比混合， 将混合液倒入空的无菌培 养瓶并调节pH6.4， 备用； 再将已预培养的受体材料茎段取出， 置于无菌空培养皿中， 立即用 配制好的侵染液濡湿受体茎段， 再在无菌条件下进行适当刻伤， 对照材料同时进行同样刻 伤处理。 刻伤处理后， 先将经刻伤处理的对照转移至分化培养基， 再将受体材料转移至盛有 侵染液的培养瓶内侵染15min， 侵染液体积以没过侵染材料为宜， 侵染期间用手间歇摇动侵 染瓶， 以使材料与侵染液充分接触； 0047 侵染结束， 取出受体茎段， 用无菌滤纸吸干。
27、表面多余液体， 转接于分化培养基上， 仍按每瓶培养基6个茎段放置。 将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养3d， 培养温度25 左右。 对照同样处理。 共培养结束， 将受体材料转接于含有Kan(kanamycin， 卡那霉素)的筛 选培养基上继续培养， 分3个阶段进行。 各阶段的培养基均调节为pH6.27.0。 3个不同阶段 不同设置分别为， 第一阶段Kan浓度20mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)400mg L， 培养时间7d； 第 说明书 4/6 页 6 CN 103525863 B 6 二阶段Kan浓度50mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)300mg L， 培养时间28d。 第三阶段卡。
28、那霉素 60mg L， 抑菌素Cef(头孢霉素)200mg L， 培养2030d。 0048 经过上述两个阶段的Cef抑菌和Kan筛选培养， 21d后， 受体茎段表现出明显分离生 长状态， 超过1 3的茎段出现由黄化至枯死的变化， 约2 3茎段萌发出绿色的抗性新芽， 抗性 芽长度大约0.7cm。 本发明方案试验中对存活的抗性芽苗进行采样， 提取抗性芽的DNA并进 行PCR扩增检测。 提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法， 采用CcRIPII2基因序列资 料， 设计引物： 0049 引物1： 5 TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT3 ； 0050 引物2： 5 TATT。
29、AGGCAGCGGATGGGGCGGGAA3 ； 0051 PCR反应体系： 0052 ddH2O(16 L) 0053 10Buffer(内含20mmo1 LMgC12)(2 L) 0054 Primer1(0.8 L) 0055 Primer2(0.8 L) 0056 TemplateDNA(1 L) 0057 TaqE(0.3 L) 0058 反应程序： 95预变性4min； 94变性45s； 55复性40s； 72扩增1.5min； 共30个 循环； 72延伸7min。 0059 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， EB染色观察。 0060 GeneGenius全自动凝胶成像分析系统。
30、观察结果并照相。 0061 对采用此方法进行基因转化获得的抗性芽进行采样、 PCR检测， 结果表明， 阳性条 带检出率为78， 对检出的抗性芽在添加Kan的培养基上纯化培养， 连续继代6次后再次检 测， 500bP的阳性条带检出率稳定为50。 这充分说明此方法适合于枣树基因转化。 0062 实施例3： 0063 转基因植株的抗病性检测： 0064 选择PCR检测阳性条带的健壮植株进行抗病性检测， 在实验室无菌条件下进行。 0065 具体方法是： 0066 (1)先从大田采集枣疯病发作病树的病枝， 按外植体消毒程序进行表面消毒处理， 每10克枝叶为一份， 然后将10克无菌枝叶研磨成糊状， 加20。
31、ml无菌水稀释并混匀， 静置 10min， 取上清液为抗病试验侵染液。 0067 (2)剪取转化植株茎段为侵染受体材料， 长度13cm， 贴近培养基的茎基部粗度目 测应不低于12mm， 每段茎段长度应为11.5cm， 至少保留一对芽， 每瓶培养基放8个茎段， 共设5个重复。 将剪取的茎段置于无菌空培养皿中， 立即用制备好的侵染液濡湿受体茎段， 再在无菌条件下进行适当刻伤， 对照材料同时进行同样刻伤处理。 刻伤处理后， 再将受体材 料转移至已盛有侵染液的培养皿内侵染20min， 侵染液体积以没过侵染材料为宜， 侵染期间 用手间歇摇动侵染瓶， 以使材料与侵染液充分接触。 0068 侵染结束， 取出。
32、受体茎段， 用无菌滤纸吸干表面多余液体， 转接于分化培养基上， 培养温度2328， 正常光照培养。 连续继代6次(2030d 代)后， 观察瓶苗生长状况， 接种 病源菌的转基因植株叶片未发现病源感染的典型症状， 生长势较强， 而对照苗发现7株感官 说明书 5/6 页 7 CN 103525863 B 7 表现叶片褪绿、 小叶、 生长势弱等症状。 对供试植株的PCR检测结果表明， 转基因植株未发现 枣疯病植原体标记产物的阳性表达， 未转基因植株有7株出现枣疯病阳性表达， 病毒感染率 达到17.5， 说明转基因植株较未转基因植株对枣疯病植原体表现出较高的抗性， 见附图 2。 0069 以上所述是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 103525863 B 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 103525863 B 9 。