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1、(10)申请公布号 CN 103468826 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103468826 A *CN103468826A* (21)申请号 201210185329.0 (22)申请日 2012.06.06 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 陈力 闻玉梅 王蕾 谢幼华 梁米芳 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 一种检测和评价抗病毒感染活性的方法 (。
2、57) 摘要 本发明涉及抗体工程和抗病毒医药领域， 涉 及一种快速有效的测定重组人抗乙型肝炎病毒抗 体抗病毒功能的方法。本发明利用沉降性病毒复 合物技术， 建立了一种检测和评估分子抗病毒能 力的新方法。该方法是通过检测受试分子在血 清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力， 检测 分子的抗病毒和抗感染能力 ； 所述的病原体是病 毒。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染 药物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操 作过程简单， 结果重复性好， 是对现有抗病毒药物 功能性检测和评估方法的补充， 该方法的建立为 目前还没有有效的细胞和动物感染模型病毒的药 物研发， 提供了一种新的选择。 本发明还涉及抗。
3、病 毒感染活性的检测试剂、 检测过程中出现的沉降 性病原体复合物和上述检测方法的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103468826 A CN 103468826 A *CN103468826A* 1/1 页 2 1. 一种检测和评价抗病毒感染活性的方法， 其特征在于， 通过检测受试分子在血清中 诱导产生沉降性病原体复合物的能力， 检测分子的抗病毒和抗感染能力 ； 所述的病原体是 病毒。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 。
4、其特征在于， 该方法依次包括下列步骤 ： （1） 取离体血液样本， 分离获得病原体血清样本 ； （2） 将病原体血清样本与检测试剂混合后， 加入受试分子 ； （3） 步骤 （2） 获得的混合物在 4-37 摄氏度静置 0.5-15 小时， 以 1， 000-12， 000 转 / 分 的速度离心 30 分钟 ； （4） 离心后的混合物取上清分离病原体核酸后， 测定病原体核酸量。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述的分离病原体核酸的方法是密度梯度 离心或者 PEG 沉淀。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的沉降性病原体复合物包括病原体和 表面粘联分子的多。
5、聚体。 5. 一种抗病毒感染活性的检测试剂， 其特征在于， 所述的检测试剂包括试剂 A 和试剂 B。 6.如权利要求5所述的抗病毒感染活性的检测试剂， 其特征在于， 所述的试剂A是表面 粘联分子的多聚体。 7. 一种沉降性病原体复合物， 其特征在于， 该沉降性病原体复合物包括病原体和表面 粘联分子的多聚体。 8. 如权利要求 7 所述的沉降性病原体复合物， 其特征在于， 所述的病原体是病毒。 9.权利要求1所述的方法的应用， 其特征在于， 利用该方法筛选或者界定具有抗HBV感 染的小分子化合物、 蛋白或者核酸。 10. 如权利要求 9 所述的应用， 其特征是， 利用该方法筛选或者界定抗 HBV。
6、 的多克隆抗 体或者单克隆抗体。 权 利 要 求 书 CN 103468826 A 2 1/5 页 3 一种检测和评价抗病毒感染活性的方法 技术领域 0001 本发明涉及抗体工程和抗病毒医药领域， 具体涉及一种快速有效的测定重组人抗 乙型肝炎病毒抗体抗病毒功能的方法。 背景技术 0002 人乙型肝炎病毒 （human hepatitis B virus,HBV） 感染是全球性的公共卫生问 题， 根据世界卫生组织 （ （World Health Organization， WHO） 的统计， 全球范围内有超过 20 亿人曾感染过 HBV， 其中， 3.5 亿正遭受慢性 HBV 感染之苦 （WHO。
7、,2000） 。我国为乙型肝炎的 高发区。2006 年全国病毒性肝炎血清流行病学调查数据显示， 在全部人群中乙肝表面抗原 （HBsAg） 的阳性率为 7.18%。据此估计我国有 9300 万人为 HBV 携带者， 其中， 3000 万例为慢 性乙型肝炎患者。研究还显示， 慢性的 HBV 感染又与肝硬化和肝癌的发病率和死亡率密切 相关。 0003 乙肝病毒是 DNA 病毒， 具部分环状双链的 DNA。基因组长度约为 3.2kb， 含有四个 基本阅读框架， 分别是编码核心蛋白 （核心抗原） 和 e 蛋白 （e 抗原） 的 C 基因 ； 编码大、 中和 小表面蛋白 （表面抗原） 的 S 基因 ； 编。
8、码聚合酶的 P 基因和编码 X 蛋白的 X 基因。人乙型肝 炎病毒具有种群和组织特异性， 只感染人类的肝细胞。 0004 乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上， 通过未知的机制， 病毒外膜与细胞膜 发生融合， 病毒核衣壳被释放到细胞质中并解聚， 病毒基因组转移到被感染细胞的细胞核 内， 在细胞修复酶的作用下形成闭合环状 DNA（cccDNA） 。随后， 病毒以 cccDNA 为模板转 录产生四种 mRNA， 分别是 3.5kb 的 pgRNA、 2.4kb 的 mRNA、 2.1kb 的 mRNA 和 0.8kb 的 mRNA。 2.4kb 和 2.1kb 的 mRNA 指导表面蛋白的翻译 ；。
9、 0.8kb 的 mRNA 指导 X 蛋白的翻译 ； 而 3.5kb 的 pgRNA 除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外， 还作为病毒的前基因组 RNA， 被新产生的核 心蛋白和聚合酶包裹， 形成新的核衣壳。在核衣壳中， 病毒聚合酶以 pgRNA 为模板通过反转 录合成新的 DNA 基因组。最终， 完成 DNA 复制的核衣壳被表面蛋白包裹， 形成成熟的病毒粒 子， 分泌出细胞， 开始新的感染周期。 0005 在 HBV 感染者的血清中可见三种不同形态的病毒颗粒， 即大球型颗粒 （又称为 Dane 颗粒） 、 小球形颗粒和管型颗粒。虽然这三种形式的颗粒都具有乙型肝炎表面抗原 （HBsAg） ， 但。
10、是只有大球型颗粒内部含病毒的双链 DNA 分子， 并具感染性。同时值得注意 的是， 小球形颗粒， 也称亚病毒颗粒， 一般在血液中可比 Dane 颗粒多出 10， 000 至 1， 000， 000 倍。部分病人自然感染状态下会出现保护性抗体。研究表明， 乙型肝炎病毒表面抗原 （HBsAg） 的主要抗原为 “a” 决定簇。免疫显性 “a” 表位在所有病毒血清中存在。治疗慢性 病毒感染的抗体都是抗 HBsAg。 0006 人抗乙肝病毒抗体 （HBIG） 系从乙型肝炎疫苗免疫健康人群中， 采集高效价血浆或 血清后， 分离提取制备的免疫球蛋白制剂， 在临床上被用于降低 HBV 的感染率。在中国和其 它。
11、 HBV 高发地区， 母婴传播是 HBV 的主要的感染途径之一。临床研究显示， HBIG 与重组 HBV 疫苗联合使用是目前阻断 HBV 母婴传递最有效的手段， 其保护率达 95% 左右。乙肝表面抗 说 明 书 CN 103468826 A 3 2/5 页 4 原 (HBsAg) 阳性母亲所产新生儿出生后 24h 内使用乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白 (HBIG)， 已 在 慢性乙型肝炎防治指南 (2010 年版 ) 中被建议。器官移植后乙肝病毒感染是影响手术 成功率的主要因素。高剂量的 HBIG 抑制肝脏移植后 HBV 再感染率的成功率达 60% 至 85%。 临床研究表明， 围产期的母婴传播率与。
12、母体病毒载量高度相关， 肝脏移植后 HBV 再感染的 风险也与病毒载量直接相关。HBIG 的使用可能降低病毒的载量。 0007 由于 HBIG 的生产和临床应用分别存在着血源稀缺和血源性传播疾病感染等隐 忧 , 重组型人抗乙肝单抗 （mAb） 已受到了医药产业界的关注。值得注意的是， 虽然治疗性 单抗药物 （mAbs） 在过去的 20 年里已悄然成为推动生物医药产业发展的主力， 但是单抗技 术在感染性疾病领域的应用相对滞后， 目前只有一个抗 - 呼吸道合胞病毒的单抗药物用于 临床。Shlomo Dagan 等人在 2001 年报导了两个抗 HBV 人单抗的联合用药的一期临床试验 结果后， 有关。
13、抗 HBV 单抗的研究进展缓慢， 其中的一个重要原因， 就是缺乏评估重组人抗乙 肝单抗 （mAb） 中和病毒能力的评估系统。 0008 与 HIV 和 HCV 不同， HBV 至今未建立可靠的细胞感染模型和动物保护模型。多年 以来， 人原代肝细胞是研究 HBV 病毒感染性唯一的一种细胞。但是， 人原代肝细胞很难培 养， 不能在体外繁殖并且需要特殊的生长因子来维持其原代的分化状态。即使在培养过程 中加入二甲基亚砜 （DMSO） 和聚乙二醇 （PEG） ， 也只能有限的改善 HBV 病毒的感染力感染细 胞以扩增病毒的能力。再加上来源困难等其它问题， 人原代肝细胞很难被应用到以细胞为 基础的体外中和。
14、实验中。人肝癌细胞系 （HepG2） 细胞在培养中加入二甲基亚砜 （DMSO） 和 5-aza-2 - 脱氧胞啶后能探测到病毒抗原的存在， 可是， 这个结果的重复性差。从原发性 肝癌和慢性 HCV 共感染的一位女性病人中分离出的 HepaRG 细胞在感染前先通过二甲基亚 砜 （DMSO） 和皮质醇 （hydrocortisone） 的前处理达到了成功感染 HBV 的目的， 但这个细胞系 不是很稳定且处理过程繁琐。而且， 成功建立 HBV 感染的人细胞系只能产生病毒颗粒， 不能 用于体外病毒中和实验。 0009 树鼩的原代肝细胞被发现具有感染人 HBV 的能力， 并且感染后能探测到乙肝表面 抗原。
15、和乙肝 e 抗原的分泌的能力。有些实验室正用树鼩的原代肝细胞作为多肽抗体的评 估。但是， 只有原代分离的树鼩肝细胞具有感染和复制病毒能力。时效性短， 来源复杂， 可 重复率低， 也限制了它应用到体外中和病毒实验中。 0010 利用抗体工程技术可以设计、 构建、 表达和生产具有高度特异性的抗病毒单克隆 抗体。如何检测和判定单抗的抗感染能力， 去伪存真， 是将单抗成功导入临床应用的关键。 虽然细胞感染模型和动物保护模型已成功应用于部分病毒， 如 HIV 和 HCV 等的研究， 但是， 受体外细胞感染系统培养和感染条件及动物模型的异种性等因素的限制， 细胞感染模型和 动物保护模型的实际应用效率和价值。
16、尚待观察。 此外， 一些具高度种属， 组织和细胞特异性 的病毒感染， 如 HBV 感染， 以及一些新发和突发性的感染病毒， 至今还没有相应的细胞感染 和动物保护模型。因此， 医疗和制药界急需一个快速， 高效和通用的检测系统， 作为现有方 法和手段的补充。 发明内容 0011 本发明的目的是提供一种在快速有效的测定抗感染分子抗病毒能力的方法。 0012 本发明的另一个目的是利用上述检测方法筛选具有抗 HBV 感染的小分子化合物、 说 明 书 CN 103468826 A 4 3/5 页 5 蛋白或者核酸。 0013 本发明要解决的问题是建立一个快速有效的检测系统， 以界定抗 HBV 单抗和其它 。
17、抗病毒分子和制剂的抗感染能力。 0014 临床研究显示， HBV 被动免疫和 HBIG 主动免疫都可以有效的控制 HBV 的感染率， 提示虽然 HBV 病毒感染的靶细胞为肝细胞， 血液却是抗 HBV 感染的主要屏障。此外， 业界都 清楚， 无论是细胞感染模型、 动物保护模型还是临床感染， 病毒的感染率都与病毒的载量相 关。因此本发明假设， 受试分子在血液中调控病毒载量的能力， 与其抗感染能力相关。并在 此基础上， 利用沉降性病毒复合物技术， 建立了一个新的抗感染检测系统。 0015 闻玉梅等利用沉降性抗原抗体复合物技术， 设计和生产了具有免疫再生能力的治 疗性疫苗， 并应用于持续性乙型肝炎的基。
18、础研究和临床治疗， 该技术已获得国内外专利。 沉 降性病原体复合物是对沉降性抗原 / 抗体复合物技术的延伸。病原体复合物是包含病原体 以及表面粘联分子的多聚体。 0016 沉降性病原体复合物技术的新颖性是利用不同的病毒复合物在血样中的不同沉 降条件， 以及感染性病毒颗粒的分子特点， 检测受试样品从血样中清除病毒的能力。 病毒与 单抗和其它抗病毒分子和制剂可以借助静电力、 氢键、 范德华力等次级键可逆性结合而形 成的多分子复合物。 0017 本发明提供了一种检测和评价抗病毒感染活性的方法， 通过检测受试分子在血清 中诱导产生沉降性病原体复合物的能力， 检测分子的抗病毒和抗感染能力。 0018 该。
19、方法依次包括下列步骤 ： 0019 （1） 取离体血液样本， 分离获得病原体血清样本 ； 0020 （2） 将病原体血清样本与试剂 A 和试剂 B 混合后， 加入受试分子 ； 0021 （3） 步骤 （2） 获得的混合物在 4-37 摄氏度静置 0.5-15 小时， 以 1， 000-12， 000 转 / 分的速度离心 30 分钟 ； 0022 （4） 离心后的混合物取上清分离病原体核酸后， 测定病原体核酸量。 0023 所述的病原体是病毒， 例如在实施例中针对的是 HBV 病毒。 0024 步骤 （3） 所述的离心的速度， 较好的是 10， 000-12， 000 转 / 分。 0025 。
20、用荧光实时 PCR 定量测定病原体核酸量。 0026 所述的沉降性病原体复合物包括病原体和表面粘联分子的多聚体。其中， 病原体 可以是病毒， 例如在实施例中针对的是 HBV 病毒。 0027 本发明中涉及一种沉降性病原体复合物， 该沉降性病原体复合物包括病原体和表 面粘联分子的多聚体。所述的病原体是病毒。 0028 利用该方法检测受试样品从血样中清除病毒的过程如下。 含病原体血清样本与检 测价抗病毒感染活性的试剂混合后， 加入受试分子。混合物在特定温度中静置后， 离心。取 上清分离病原体核酸后， 测定病原体核酸量。 0029 样品在特定条件下病毒的清除率的计算方法是 ： 0030 病毒的清除率。
21、 =（对照组病毒载量 （Xc） - 样品组病毒载量 （Xt） ） / 对照组病毒载 量 （Xc） 。 0031 上述方法中， 可以将混合物置于在离心试管中。 0032 静置的时间是 0.5-15 小时， 静置的特定温度的范围是 4-37 度 （摄氏度） 。 说 明 书 CN 103468826 A 5 4/5 页 6 0033 静置后的离心速度的范围是 1， 000-12， 000 转 / 分， 较好的 5， 000-10， 000 转 / 分。 离心时间可以是 20-60 分钟。例如采用 30 分钟。 0034 测定病原体核酸量可以使用荧光实时 PCR 定量测定法。 0035 含病原体血清样。
22、本与检测价抗病毒感染活性的试剂可以按比例混合。 混合比例为 1:1000-10 ： 1， 体积比。 0036 其中， 检测抗病毒感染活性的试剂包括试剂A和试剂B。 所述的试剂A是表面粘联 分子的多聚体。 0037 利用上述检测和评价抗病毒感染活性的方法可以筛选并界定具抗感染能力的受 测分子 （受试分子） 。所述的受测分子是抗 HBV 的多克隆抗体或者单克隆抗体。 0038 已知病毒可以通过物理的、 化学的方法， 分离和纯化。 这些方法是本领域技术人员 所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于 ： 密度梯度离心、 PEG沉淀等。 与超离心法相比， 本发明无需超离心机等仪器和设备， 操作过程简单易。
23、行 ； 与 PEG 沉淀法相比， 本方法具病毒 特异性沉降等特点， 有临床实用性。 0039 酶联免疫吸附法 （Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是常用的免疫检 测手段， 临床上用于检测抗乙肝病毒表面抗体， 抗乙肝病毒衣壳抗体等。与 ELISA 相比， 本 发明所检测的病毒和抗感染物质之间的相互作用发生在液相的血清中， 没有受到器皿和其 它粒子表面分子的影响， 具有生理学和病理学意义。 0040 利用本发明的方法检测了 HBIG， 人抗 HBV 单抗 BC1， 人 IgG， 人白蛋白， 和其它动物 IgG 清除病人血清中 HBV 病毒的能力。结果显。
24、示， 在同样蛋白浓度条件下 （1-50 微克 / 毫 升） ， HBIG 和人抗 HBV 单抗的病毒清除率在 70% 以上， 与人 IgG， 人白蛋白和异源 IgG 比较， HBIG 和人抗 HBV 单抗具特异性清除 HBV 的能力。 0041 本发明利用沉降性病毒复合物技术， 建立了一种检测和评估分子抗病毒能力的新 方法。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒和控制病毒感染的能力。 本方法操作过程简单， 结果重复性好， 是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充， 该方法的建立为目前还没有有效的细胞和动物感染模型病毒 （如 HBV） 的药物研发， 提供了 一种新的选择。 附图说。
25、明 0042 图 1 ： HBV 单抗与 HBIG 的病毒清除能力。 0043 图 2 ： 沉降相关性实验。 0044 图 3 ： 人 HBV 单抗的特异性。 具体实施方式 0045 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。除非另有描述， 本发明的实施将采用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的常规技术， 这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中 有完整的描述 ： 例如， Sambrook 分子克隆实验指南 第2版(1989) ；DNA克隆 第I和II卷 (D.N.Glover 编辑 1985) ；寡核苷酸。
26、合成 (M.J.Gait 编辑， 1984) ；核酸杂交 (B.D.Hames 和S.J.Higgins编辑.1984) ；蛋白质纯化 ： 原理和实践 第2版(Springer-Verlag， N.Y.)， 说 明 书 CN 103468826 A 6 5/5 页 7 以及 实验免疫学手册 I-IV 卷 (D.C.Weir 和 C.C.Blackwell 编辑 1986)， 或者， 可按照试 剂生产商所提供的说明书进行。 0046 实施例 1 ： HBV 单抗与 HBIG 的抗感染性能力 0047 利用本发明建立的检测方法， 分别检测HBV单抗与HBIG的抗病毒活性。 HBIG为由 中生集团生。
27、产的人抗乙肝病毒球蛋白， 人源化抗乙肝病毒单克隆抗体由中国疾病预防控制 中心病毒病预防控制所提供。 0048 具体检测步骤是 ： 0049 （1） 取离体血液样本， 分离获得病原体血清样本 ； 0050 （2） 将病原体血清样本与试剂 A 和试剂 B 按 1 ： 4.5 ： 4.5 混合后， 加入 0.5%Volume 受试分子 （分为 HBV 单抗组和 HBIG 组） ； 0051 （3） 室温静置 3 小时， 以 10， 000 转 / 分的速度离心 30 分钟 ； 0052 （4） 离心后的混合物取上清分离病原体核酸后， 荧光实时 PCR 定量测定病原体核 酸量。样品在特定条件下病毒的清。
28、除率的计算方法是 ： 0053 100%- 对照组病毒载量 （Xc） - 样品组病毒载量 （Xt） / 对照组病毒载量 （Xc） 。 0054 结果显示， HBV 单抗的病毒清除率为 87%， HBIG 病毒清除率为 96.8%。HBIG 和抗 HBV 单抗同具抗病毒能力， 两者间无显著性差异， HBV 单抗与 HBIG 具生物等效性。 0055 实施例 2 ： HBIG 和抗 HBV 单抗的抗病毒能力与病毒复合物的形成和沉降相关 0056 图 2 为沉降特异性实验的结果。 0057 按照实施例 1 的方法检测病毒 DNA， 只是 HBV 单抗和 HBIG 处理血清样本后不做沉 降处理， 检测。
29、病毒 DNA。 0058 实验结果表明， 不做沉降处理组的 HBV 单抗 BC1 和 HBIG 不能从血清中清除病毒。 沉降性病毒复合体的形成和检测为检测的必要条件。 0059 实施例 3 人 HBV 单抗 BC1 的特异性实验 0060 图 3 为人 HBV 单抗 BC1 的特异性实验。 0061 按照实施例 1 的方法检测病毒 DNA。 0062 结果显示， HBV 单抗中和病毒的能力为 93%（P=0.0001） ， 与 HBIG 中和病毒的能力 没有显著性差异。与人血清白蛋对照相比， HBIG 和抗 HBV 单抗 BC1 的病毒清除能力具特异 性。 说 明 书 CN 103468826 A 7 1/2 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103468826 A 8 2/2 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103468826 A 9 。