一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711051269.2 (22)申请日 2017.10.31 (71)申请人 云南省烟草农业科学研究院 地址 650031 云南省昆明市圆通街33号 (72)发明人 高玉龙李文正王丙武宋中邦 李梅云焦芳婵吴玉萍李永平 徐向丽 (74)专利代理机构 昆明知道专利事务所(特殊 普通合伙企业) 53116 代理人 姜开侠谢乔良 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别烟草镉转运基因NtHM。

2、A2野生型和 突变体的分子标记与应用 (57)摘要 本发明公开了一种鉴别烟草镉转运基因 NtHMA2野生型和突变体的分子标记与应用。 与 NtHMA2野生型位点检测相关的标记， 其核苷酸序 列如SeqNo.1所示； 与NtHMA2突变体位点检测相 关的标记， 其核苷酸序列如SeqNo.2所示。 应用， 其特征在于所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2 野生型和突变体的分子标记在利用突变体hma- 2h23改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。 本发明的分子标记具有简单、 快速的优势。 该分 子标记可以应用于利用突变体hma2-2h23对烟草 品种的低镉改良的回交过程中。 权利要求书2页 说明书6。

3、页 序列表2页 附图3页 CN 107586880 A 2018.01.16 CN 107586880 A 1.一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记， 其特征在于与NtHMA2 野生型位点检测相关的标记， 其核苷酸序列如Seq No.1所示； 与NtHMA2突变体位点检测相 关的标记， 其核苷酸序列如Seq No.2所示。 2.根据权利要求1所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记， 其 特征在于NtHMA2突变体为hma2-2h23突变体。 3.一种权利要求1或2所述鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的 引物对， 其特征在于包括第。

4、一轮PCR引物和第二轮PCR引物， 其中， 第一轮PCR引物为： 上游引物： HMA2-F： AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT； 下游引物： HMA2-R： CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT； 第二轮PCR引物为： 上游引物： HMA2-2H23-dC1F： GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGGA； 下游引物： HMA2-2H23-dC1R： CTTCTATGCTGGCAAGCTTCCGAAG。 4.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记 的应用， 其特征在于所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的。

5、分子标记在利用 突变体hma-2h23改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。 5.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记 的鉴定方法， 其特征在于包括以下步骤： （1） 利用第一轮PCR引物对烟草基因组进行PCR扩增； （2） 第一轮PCR产物稀释2倍后利用第二轮PCR引物进行第二轮PCR扩增； （3） 第二轮PCR产物经纯化后利用BsmFI酶切， 如果PCR产物能被BsmFI酶切， 则为野生 型； 如果PCR产物不能被BsmFI酶切， 则为突变体。 6.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴 定方法， 其特征在于。

6、步骤 （1） 中所述的PCR扩增利用ExTaq进行 （Takara） ， 25L体系， PCR体系 包括以下成分： ExTaq 0.125L 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5L MgCl2 2L dNTP(2.5mM) 2L 基因组DNA 0.5L 上游引物HMA2-F （10M） 0.5L 下游引物HMA2-R （10M） 0.5L 灭菌超纯水 16.875 L。 7.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴 定方法， 其特征在于步骤 （1） 中所述的PCR扩增反应条件为： 94预变性5min； 94 30s， 58 30。

7、s， 72 90s， 32个循环； 72 7min。 8.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴 定方法， 其特征在于步骤 （2） 中所述的PCR扩增反应体系为50L， 包括以下成分： ExTaq 0.25L 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 5L 权利要求书 1/2 页 2 CN 107586880 A 2 MgCl2 4L dNTP(2.5mM) 4L 第一轮PCR产物稀释2倍液 0.5L 上游引物HMA2-2H23-DC1F 1L 下游引物HMA2-2H23-DC1R 1L 灭菌超纯水 34.25L。 9.根据权利要求5所述。

8、的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴 定方法， 其特征在于步骤 （2） 中所述的PCR扩增反应条件为： 94预变性5min； 94 30s， 55 30s， 72 30s， 32个循环； 72 7min。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107586880 A 3 一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记 与应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突 变体的分子标记与应用。 背景技术 0002 镉( Cd)、 砷( As) 、 铬( Cr) 和汞( Hg) 等是公认的对植物和人体危害比较大。

9、的 重金属元素， 其中镉对人体的伤害最大。 烟草 （Nicotiana tabacum） 是重要的经济作物， 是 茄科一年生草本植物， 而且烟草是富镉作物， 其对镉的富集系数达到10， 所以近年来关于降 低烟草中的镉含量也逐渐成为烟草减害研究的一个热点。 0003 镉对人体的危害巨大， 过量的镉进入人体内可能对血管造成损害； 另外镉元素对 肠道吸收铁具有抑制作用， 还会干扰钴、 铜、 锌等微量元素的代谢过程， 引起肺、 肾、 肝等人 体脏器损害， 最终可能导致致癌、 致畸和致突变等作用。 0004 拟南芥中AtHMA2、AtHMA4主要负责锌和镉从根部向地上部的转运。NtHMA2基因突 变或干。

10、涉后可以降低地上部镉的镉含量 （Hermand等， 2014， Metallomics， 6 （8） ： 1427- 1440） 。 为了降低烟草镉含量， 利用EMS诱导我国大面积种植烟草品种云烟87， 并从中筛选到 一个NtHMA2基因终止突变体， 命名为hma2-2h23。 镉其镉含量可以降低到野生型的60%左右。 突变体hma2-2h23可以应用于烟草育种培育低镉含量的烟草品种。 开发一种简单、 方便、 有 效的区分突变体与野生型品种的分子标记， 以实现对突变型的精准鉴定， 对后续利用突变 位点进行育种筛选具有重要价值。 发明内容 0005 本发明的第一目的在于提供一种鉴别烟草镉转运基因。

11、NtHMA2野生型和突变体的 分子标记； 第二目的在于提供所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标 记的应用。 0006 本发明的第一目的是这样实现的， 与NtHMA2野生型位点检测相关的标记， 其核苷 酸序列如Seq No.1所示； 与NtHMA2突变体位点检测相关的标记， 其核苷酸序列如Seq No.2 所示。 0007 本发的第二目的是这样实现的， 所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变 体的分子标记在利用突变体hma-2h23改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。 0008 本发明与现有的技术具有如下优点和效果： （1） 开发了一种用于区分烟草镉转运基因Nt。

12、HMA2突变体与野生型的分子标记， 包括两 对PCR扩增引物 （第一轮PCR引物HMA2-F/HMA2-R， 第二轮PCR引物HMA2-2H23-DC1F /HMA2- 2H23-DC1R） 和一个限制性内切酶BsmFI。 0009 （2） 本发明的功能性标记通过常规PCR扩增和酶切反应， 能够特异性地检测NtHMA2 基因突变后的低镉突变体hma2-2h23， 而不需要通过测序检测突变等位基因。 本标记更加简 说明书 1/6 页 4 CN 107586880 A 4 单、 快捷。 该标记可以应用于利低镉突变体hma2-2h23培育低镉烟草材料的过程中， 尤其是 回交改良低镉特性时， 每个回交。

13、世代都要选择杂合基因型， 该标记可以准确选择目标基因 型 （杂合型） 与轮回亲本回交。 附图说明 0010 图1为烟草镉转运基因NtHMA2野生型序列与突变体hma2-2h23序列比对结果； 图2为第一轮PCR上游引物 （HMA2-F） 和下游引物 （HMA2-R） 扩增产物电泳图， 其中M为 100bp DNA Ladder， 1-7为突变位点杂合材料， 8-12为野生型材料， 13-15为突变位点突变 纯合材料； 图3为第二轮PCR上游引物 （HMA2-2H23-DC1F） 和下游引物 （HMA2-2H23-DC1R） 扩增产物 电泳图， 其中M为100bp DNA Ladder， 1-7。

14、为突变位点杂合材料， 8-12为野生型材料， 13-15 为突变位点突变纯合材料； 图4为第二轮PCR产物经BsmFI酶切后电泳图， 其中M为100bp DNA Ladder， 1-7为突变位 点杂合材料， 8-12为野生型材料， 13-15为突变位点突变纯合材料； 图5 为样品测序结果， 方框所示为突变碱基位点， 上为样品1： 突变位点为碱基T和C混 合， 显示双峰， 杂合突变； 中为样品8： 突变位点为碱基C， 显示单峰， 野生型纯合； 下为样品 13： 突变位点为碱基T， 显示单峰， 突变体纯合。 具体实施方式 0011 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明， 但不以任何方式对本发。

15、明加以 限制， 基于本发明教导所作的任何变换或替换， 均属于本发明的保护范围。 0012 本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记， 与NtHMA2 野生型位点检测相关的标记， 其核苷酸序列如Seq No.1所示； 与NtHMA2突变体位点检测相 关的标记， 其核苷酸序列如Seq No.2所示。 0013 NtHMA2突变体为hma2-2h23突变体。 0014 本发明所述鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的引物对， 包 括第一轮PCR引物和第二轮PCR引物， 其中， 第一轮PCR引物为： 上游引物： HMA2-F： AATATAGAGATGGCC。

16、AATGAAGGT； 下游引物： HMA2-R： CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT； 第二轮PCR引物为： 上游引物： HMA2-2H23-dC1F： GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGGA； 下游引物： HMA2-2H23-dC1R： CTTCTATGCTGGCAAGCTTCCGAAG。 0015 本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的应用为 所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记在利用突变体hma-2h23改 良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。 0016 本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变。

17、体的分子标记的鉴定方 法， 包括以下步骤： （1） 利用第一轮PCR引物对烟草基因组进行PCR扩增； （2） 第一轮PCR产物稀释2倍后利用第二轮PCR引物进行第二轮PCR扩增； 说明书 2/6 页 5 CN 107586880 A 5 （3） 第二轮PCR产物经纯化后利用BsmFI酶切， 如果PCR产物能被BsmFI酶切， 则为野生 型； 如果PCR产物不能被BsmFI酶切， 则为突变体。 0017 步骤 （1） 中所述的PCR扩增利用ExTaq进行 （Takara） ， 25L体系， PCR体系包括以下 成分： ExTaq 0.125L 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ fre。

18、e) 2.5L MgCl2 2L dNTP(2.5mM) 2L 基因组DNA 0.5L 上游引物HMA2-F （10M） 0.5L 下游引物HMA2-R （10M） 0.5L 灭菌超纯水 16.875 L。 0018 步骤 （1） 中所述的PCR扩增反应条件为： 94预变性5min； 94 30s， 58 30s， 72 90s， 32个循环； 72 7min。 0019 步骤 （2） 中所述的PCR扩增反应体系为50L， 包括以下成分： ExTaq 0.25L 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 5L MgCl2 4L dNTP(2.5mM) 4L 第一轮PCR产物稀释。

19、2倍液 0.5L 上游引物HMA2-2H23-DC1F 1L 下游引物HMA2-2H23-DC1R 1L 灭菌超纯水 34.25L。 0020 步骤 （2） 中所述的PCR扩增反应条件为： 94预变性5min； 94 30s， 5530s， 72 30s， 32个循环； 72 7min。 0021 本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记， 与NtHMA2 野生型位点检测相关的核苷酸序列如下所示 （Seq No.1） ： GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGCACAGCTTGTCGAAGATGCTCAGAACAAGAAATCAAAAACCCAAAGATACA 。

20、TCGACAAGTGTGCTAAATATTATACACCAGGTTAGTGAATCTTATGTTGTGCCACATCAAGTCAAAAAATGCACGTA CCGTGTGAACTTGTTCTTTGTCTTATGAATCACGTCACTATCCTCTCCCTTTTCGATATGAGATTTCCCTAAGGTGT CATATGAATCCCTTCTTCGGAAGCTTGCCAGCATAGAAG 与NtHMA2突变体位点检测相关的核苷酸序列如下所示 （Seq No.2） ： GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGCATAGCTTGTCGAAGATGCTCAGAACAAGAAATCAAAAACCC。

21、AAAGATACA TCGACAAGTGTGCTAAATATTATACACCAGGTTAGTGAATCTTATGTTGTGCCACATCAAGTCAAAAAATGCACGTA CCGTGTGAACTTGTTCTTTGTCTTATGAATCACGTCACTATCCTCTCCCTTTTCGATATGAGATTTCCCTAAGGTGT CATATGAATCCCTTCTTCGGAAGCTTGCCAGCATAGAAG 本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的鉴定方法， 具 体操作如下： 采用巢式PCR进行 说明书 3/6 页 6 CN 107586880 A 6 第一轮PCR。

22、上游引物： HMA2-F： AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT （Seq No.3） ， 第一轮下游引 物： HMA2-R： CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT （Seq No.4） ； 第二轮PCR上游引物： HMA2-2H23-dC1F： GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGGA （Seq No.5） ， 第二 轮下游引物： HMA2-2H23-dC1R： CTTCTATGCTGGCAAGCTTCCGAAG （Seq No.6） 所述的用于鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记在烟草育种辅助 选择中的应用。 0022 应用上述引物鉴别烟。

23、草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的方法， 其特征包括以 下步骤： （1） 利用第一轮PCR上游引物 （HMA2-F） 和下游引物 （HMA2-R） 对待鉴定材料DNA进行扩 增， 扩增产物作为模板利用第二轮PCR上游引物 （HMA2-2H23-dC1F） 和下游引物 （HMA2-2H23- dC1R） 进行第二轮扩增。 0023 （2） 对第二轮PCR扩增产物利用BsmFI酶切， 并进行电泳分析， 如果PCR产物能被 BsmFI酶切， 酶切产物为35bp和231bp两条片段 （琼脂糖凝胶电泳只能看到231bp的片段） ， 则 为野生型NtHMA2； 如果PCR产物不能被BsmFI酶切， 。

24、依然为266bp， 则为纯合突变体hma2- 2h23； 如果酶切产物为35bp、 231bp和266bp三条带 （琼脂糖凝胶电泳只能看到231bp和266bp 两条带） ， 则为野生型和突变体的杂合体。 0024 步骤 （1） 中所述的PCR扩增利用ExTaq进行 （Takara） ， 25L体系。 PCR体系包括以下 成分： ExTaq 0.125L 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5L MgCl2 2L dNTP(2.5mM) 2L 基因组DNA 0.5L 上游引物HMA2-F （10M） 0.5L 下游引物HMA2-R （10M） 0.5L 灭菌超纯水 1。

25、6.875 L 第一轮PCR扩增反应程序优选为： 94预变性5min； 94 30s， 58 30s， 72 90s， 32 个循环； 72 7min。 扩增的目的条带大小为1552bp。 扩增产物稀释2倍后进行第二轮PCR。 0025 第二轮PCR体系为50L， 包括以下成分： ExTaq 0.25L 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 5L MgCl2 4L dNTP(2.5mM) 4L 第一轮PCR产物稀释2倍液 0.5L 上游引物HMA2-2H23-DC1F 1L 下游引物HMA2-2H23-DC1R 1L 灭菌超纯水 34.25L 第二轮PCR扩增反应程序优选为。

26、： 94预变性5min； 94 30s， 5530s， 72 30s， 32 个循环； 72 7min。 扩增的目的条带大小为266bp。 说明书 4/6 页 7 CN 107586880 A 7 0026 下面以具体实施案例对本发明做进一步说明： 实施例1 一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体hma2-2h23的分子标记的建立。 0027 引物设计 突变体hma2-2h23是通过EMS诱变获得的， 其突变方式为877位核苷酸由C变为T， 形成一 个终止密码子TAG使该蛋白提前终止。 利用dCAPS Finder 2.0在线设计软件 （http： / helix.wustl.edu。

27、/dcaps/dcaps.html） ， 根据突变序列和野生型序列设计引物， 引物序列如 下： 上游引物HMA2-2H23-dC1F： GATTGTGCGGTGGCTAGGATGGGA （Seq No.5） ， 下游引物HMA2-2H23-dC1R： CTTCTATGCTGGCAAGCTTCCGAAG （Seq No.6） 。 0028 上述引物扩增突变型和野生型产物都是266bp， 野生型PCR产物可以被限制性内切 酶BsmFI切成35bp和231bp两条片段， 而突变型PCR产物不可以被BsmFI酶切。 0029 由于HMA2-2H23-dC1F/HMA2-2H23-dC1R扩增产物小， 。

28、容易产生非特异性。 为了增加 扩增特异性和稳定性， 在上述引物扩增区段的外侧设计一对引物， 利用外侧引物 （第一轮 PCR） 扩增产物作为模板再利用引物对HMA2-2H23-dC1F/HMA2-2H23-dC1R扩增。 第一轮PCR引 物序列如下： 上游引物： HMA2-F： AATATAGAGATGGCCAATGAAGGT （Seq No.3） ， 下游引物： HMA2-R： CTAAAATTTATATGACCAAGTACTT （Seq No.4） ； 上述第一轮PCR引物HMA2-F/ HMA2-R扩增产物为1552bp。 0030 实施例2 利用上述分子标记分析利用突变体hma2-2h2。

29、3回交改良云烟87低镉特性的BC3F2群体 中的15个材料的基因型。 0031 （1） 烟草叶片基因组DNA提取 利用DNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN， 德国） 试剂盒提取烟草叶片DNA。 具体步骤如 下： 将样品液氮研磨， 并用1.5ml离心管收取； 加入400ul的AP1溶液， 4ul的RNA酶混匀 ； 把样 品放入65水浴锅水浴10min， 期间摇匀3次； 往样品中加入130ul P3溶液， 冰浴5mim； 高速 离心， 13200rpm， 5min； 取上层液倒入紫色过滤柱， 13200rpm， 2min离心； 将滤液转入新的 1.5mL离心管并加入675ul。

30、的AW1溶液混匀;把混匀样品溶液分2次转入淡黄色过滤柱并进行 10000rpm， 1min离心， 弃除滤液； 把淡黄色过滤柱放入新的2ml离心管中并加入500ul的AW2 溶液， 进行10000rpm， 1min离心， 弃滤液 (此步骤重复两次)； 再把弃除滤液的淡黄色过滤柱 进行空转 （10000rpm， 1min） ， 将空转好的淡黄色过滤柱放入新的1.5ml离心管中加入50ul AE溶液后静置5min， 放入离心机进行10000rpm， 1min离心， 去除淡黄色过滤柱， 放入4冰箱 保存。 0032 （2） 利用鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记分析15个BC3F2。

31、回 交世代材料NtHMA2基因型。 0033 利用第一轮PCR引物 （HMA2-F/HMA2-R） 进行扩增， 利用ExTaq （Takara） 进行， 总体 积25L， 包括以下成分： ExTaq酶0.125L， 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5L， MgCl2 2 L， dNTP(2.5mM) 2L， 基因组DNA 0.5L， 上游引物HMA2-F （10M） 0.5L， 下游引物HMA2-R （10 M） 0.5L， 灭菌超纯水16.875 L。 反应程序为： 94预变性5min； 94 30s， 58 30s， 72 说明书 5/6 页 8 CN 107。

32、586880 A 8 90s， 32个循环； 72 7min。 0034 吸取5L扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增的目的条带大小为1552bp。 电 泳检测正确后进行第二轮PCR。 0035 第一轮PCR扩增产物稀释2倍后进行第二轮PCR。 第二轮PCR体系为50L， 包括以下 成分： ExTaq 0.25L， 10 x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 5L， MgCl2 4L， dNTP(2.5mM) 4L， 第 一轮PCR产物稀释2倍液 0.5L， 上游引物HMA2-2H23-DC1F 1L， 下游引物HMA2-2H23-DC1R 1L， 灭菌超纯水 34.25L。

33、。 第二轮PCR扩增反应程序为： 94预变性5min； 94 30s， 55 30s， 72 30s， 32个循环； 72 7min。 0036 扩增产物利用PCR产物纯化试剂盒 （QIAGEN） 进行纯化， 具体步骤： 在PCR 产物里 加5倍体积的PB溶液， 混匀。 将上述溶液转移至紫色过滤柱， 12000 rmp离心30s。 弃滤 液， 往过滤柱里加750 L PE， 12000 rmp离心30s。 弃滤液， 过滤柱12000rpm转离心1min。 将过滤柱转移至新的1.5mL离心管， 在过滤柱里加20L buffer PE， 12000 rmp， 离心1min 收集PCR纯化产物， 贮。

34、存于4。 0037 利用BsmFI （NEB） 酶切， 酶切检测体系为20L， 包括灭菌超纯水： 14.5L， BsmF I : 0.5L， CutsmartTM:2.5L， 第二轮PCR纯化产物： 2.5L。 37酶切2h。 酶切产物经3%琼脂糖 凝胶电泳检测 （图4） ， 纯合突变体不能被酶切， 仍然为266bp一条带； 野生型可以被酶切成 35bp和231bp两条带， 但是由于35bp条带太小， 在琼脂糖凝胶电泳上无法显示， 所以只能看 到比纯合突变体小35bp的一条231bp的带； 杂合型有可以看到231bp和266bp两条带。 酶切结 果 （图4） 与测序结果 （图5） 一致， 该标。

35、记可以代替以往的测序方法， 对NtHMA2突变体进行准 确鉴别。 说明书 6/6 页 9 CN 107586880 A 9 SEQUENCE LISTING 云南省烟草农业科学研究院 一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记与应用 2017 6 PatentIn version 3.3 1 266 DNA NtHMA2野生型位点核苷酸序列 1 gattgtgcgg tggctaggat ggcacagctt gtcgaagatg ctcagaacaa gaaatcaaaa 60 acccaaagat acatcgacaa gtgtgctaaa tattatacac caggt。

36、tagtg aatcttatgt 120 tgtgccacat caagtcaaaa aatgcacgta ccgtgtgaac ttgttctttg tcttatgaat 180 cacgtcacta tcctctccct tttcgatatg agatttccct aaggtgtcat atgaatccct 240 tcttcggaag cttgccagca tagaag 266 2 266 DNA NtHMA2突变体位点核苷酸序列 2 gattgtgcgg tggctaggat ggcatagctt gtcgaagatg ctcagaacaa gaaatcaaaa 60 acccaaag。

37、at acatcgacaa gtgtgctaaa tattatacac caggttagtg aatcttatgt 120 tgtgccacat caagtcaaaa aatgcacgta ccgtgtgaac ttgttctttg tcttatgaat 180 cacgtcacta tcctctccct tttcgatatg agatttccct aaggtgtcat atgaatccct 240 tcttcggaag cttgccagca tagaag 266 3 24 DNA HMA2-F 3 aatatagaga tggccaatga aggt 24 4 25 DNA HMA2-R 4。

38、 ctaaaattta tatgaccaag tactt 25 序列表 1/2 页 10 CN 107586880 A 10 5 24 DNA HMA2-2H23-dC1F 5 gattgtgcgg tggctaggat ggga 24 6 25 DNA HMA2-2H23-dC1R 6 cttctatgct ggcaagcttc cgaag 25 序列表 2/2 页 11 CN 107586880 A 11 图 1 图 2 说明书附图 1/3 页 12 CN 107586880 A 12 图 3 图 4 说明书附图 2/3 页 13 CN 107586880 A 13 图 5 说明书附图 3/3 页 14 CN 107586880 A 14 。