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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811189758.9 (22)申请日 2018.10.12 (71)申请人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市南沙区环市大 道南路25号华工大广州产研院 (72)发明人 娄文勇曾英杰宗敏华杨继国 阳辉蓉程建华 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 何淑珍冯振宁 (51)Int.Cl. C12P 19/04(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内 生真菌多。
2、糖的方法 (57)摘要 本发明公开了一种液态发酵制备高免疫活 性铁皮石斛内生真菌多糖的方法。 该方法采用液 体发酵的方式获取高活性多糖， 在PDB培养基中 补充葡萄糖， 酵母粉， KCl和KH2PO4， 通过液体发 酵的方式获取4种铁皮石斛内生真菌多糖DY1、 DY2、 DG1、 DG2， 其分子量分别为1 .3kDa ， 174.6kDa， 147.3kDa， 152.8kDa,所获取的多糖组 分对可激活小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫应答， 提 高其白细胞介素-6、 肿瘤坏死因子、 NO的分泌， 表 明本发明所获取的多糖具有增强免疫的活性。 而 且本发明工艺简单易行， 条件温和， 设备要求。
3、低， 为实现铁皮石斛内生真菌多糖的有效综合开发 应用提供了新途径。 权利要求书1页 说明书5页 附图12页 CN 109234333 A 2019.01.18 CN 109234333 A 1.一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： （1） 将活化后的铁皮石斛内生真菌种子液接种到添加了葡萄糖、 酵母粉、 KCl和KH2PO4的 PDB培养基中发酵培养； （2） 将步骤 （1） 所得发酵液过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 纯化后得到铁皮石斛内生真菌多糖。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述活化所用的培养基为pH 6.0-。
4、 6.5的PDB培养基。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述活化是在26-28活化5-7 d。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述铁皮石斛内生真菌为 Fusarium solani DO7。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 活化后的铁皮石斛内生真菌种 子液接种量为15-20 vol%。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 添加了葡萄糖、 酵母粉、 KCl和 KH2PO4的PDB培养基的pH为 6.0-6.5。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中。
5、， PDB培养基添加了9.0-9.8 g/ L葡萄糖， 0.60-0.69 g/L酵母粉， 0.01-0.05 g/L KCl和0.01-0.05 g/L KH2PO4。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述发酵培养的温度为26-28。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述发酵培养的时间为13-15 d。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 将醇沉后的粗多糖配置为 0.1-0.2 g/mL的溶液， 然后采用Sevage法脱除蛋白和色素、 DEAE-52纤维素树脂和Sephadex G-200葡聚糖凝胶进一步。
6、纯化； 其中采用AB-8大孔吸附树脂脱除蛋白和色素。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109234333 A 2 一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法 技术领域 0001 本发明涉及高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的液态发酵综合开发应用领域， 特 别涉及一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法。 背景技术 0002 铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是一种重要的药用兰花， 在 世界各地的传统草药制剂和药典中具有重要意义。 最近， 来自铁皮石斛的多糖由于其重要 的生物学特性引起了人们的特别关注， 如体外免疫调节和体内、。
7、 改善肺功能、 维持结肠健 康、 抗肿瘤、 抗氧化、 抗诱变活性等。 由于其广泛的生物学特性， 铁皮石斛被广泛用作药物、 营养品和食品中的有效成分。 然而， 对这些极为稀缺的野生资源的需求日益增加， 导致其过 度开发和栖息地受损， 这使得重要的兰花物种目前面临灭绝的威胁。 同时， 不断增长的需求 也导致价格急剧上涨， 因此越来越多的研究人员开始关注铁皮石斛。 然而， 迄今为止， 关于 从铁皮石斛分离的内生真菌的多糖可以获得有限的信息， 以改变当前的情况， 例如供应短 缺和植物资源的高价格。 0003 当植物内生真菌在宿主植物的细胞间和/或细胞内健康组织中定殖时， 一些内生 真菌可以产生与宿主相。
8、同或相似的次级代谢产物。 研究发现， 红豆杉(Taxus brevifolia) 的韧皮部(内皮)分离出的真菌内生菌Taxomyces andreanae产生的紫杉醇和相关化合物也 是短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的主要生物成分。 根据上述理论和实践， 本发明从铁皮 石斛中分离内生真菌， 具有生产生物多糖的能力， 并对其液体发酵培养基进行优化， 提高内 生真菌多糖的产量， 为以后工业化生产奠定基础。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的 方法。 本发明的铁皮石斛内生真菌多糖所采用的基础培养基为PDB培养基， 补充添加成分为 葡。
9、萄糖， 酵母粉， KCl和KH2PO4， 在此条件下， 发酵结束后， 经过浓缩、 醇沉、 提取、 纯化得到4种 多糖组分： DY1、 DY2、 DG1、 DG2， 得到的多糖组分不仅产量高而且具有很强的免疫活性。 0005 本发明的目的通过以下技术方案实现。 0006 一种液态发酵制备高免疫活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法， 包括以下步骤： 0007 (1)将活化后的铁皮石斛内生真菌种子液接种到已灭菌的添加了葡萄糖、 酵母粉、 KCl和KH2PO4的马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基中发酵培养； 0008 (2)将步骤(1)所得发酵液过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 纯化后得到铁皮石斛内生真菌 多糖。。
10、 0009 优选的， 步骤(1)所述活化所用的培养基为pH 6.0-6.5的PDB培养基。 0010 优选的， 步骤(1)所述活化25-28活化5-7d。 0011 进一步优选的， 活化的条件为28、 160rpm、 5d。 0012 优选的， 步骤(1)所述铁皮石斛内生真菌为Fusarium solani DO7， 保藏单位为中 说明书 1/5 页 3 CN 109234333 A 3 国典型培养物保藏中心， 菌种保藏号为CCTCC NO:M2017145， 保藏日期为2017年3月27日， 专 利申请号为201710512714.4。 0013 优选的， 步骤(1)中， 活化后的铁皮石斛内。
11、生真菌种子液接种量为15-20vol。 0014 优选的， 步骤(1)中， 添加了葡萄糖、 酵母粉、 KCl和KH2PO4的PDB培养基的pH为6.0- 6.5。 0015 优选的， 步骤(1)中， PDB培养基添加了9.0-9.8g/L葡萄糖， 0.60-0.69g/L酵母粉， 0.01-0.05g/L KCl和0.01-0.05g/L KH2PO4。 0016 优选的， 步骤(1)中， 采用1M HCl调整PDB培养基的pH为6.5。 0017 优选的， 步骤(1)所述灭菌的条件为121灭菌20min。 0018 优选的， 步骤(1)所述发酵培养的温度为26-28。 0019 优选的， 步。
12、骤(1)所述发酵培养的时间为13-15d。 0020 进一步优选的， 液体培养基培养条件为： 28， 13d， PDB培养基添加了9.8g/L葡萄 糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4。 0021 优选的， 步骤(2)中， 将醇沉后的粗多糖配置为0.1-0.2g/mL的溶液， 然后采用 Sevage法脱除蛋白和色素、 DEAE-52纤维素树脂和Sephadex G-200葡聚糖凝胶进一步纯化。 0022 进一步优选的， 醇沉后的粗多糖配置为0.2g/mL的溶液。 0023 进一步优选的， 已收集的粗多糖经Sevage法(氯仿： 正丁醇5： 1， v。
13、/v)脱除蛋白， 对收集的洗脱组分减压浓缩， 收集洗脱液于紫外可见分光光度计进行扫描， 确认蛋白和色 素已被去除。 其中采用AB-8大孔吸附树脂脱除蛋白和色素， 避免了使用有机溶剂脱除蛋白 质造成的危害。 0024 进一步优选的， 对脱除蛋白和色素的组分进一步采用DEAE-52纤维素阴离子交换 树脂进行纯化， 洗脱液分别为0、 0.2、 0.4、 0.6M的NaCl溶液， 苯酚硫酸法检测洗脱液中多糖 浓度， 根据苯酚硫酸法测定的吸光度变化绘制洗脱曲线， 得到不同多糖组分， 合并相同组分 的收集管浓缩后， 蒸馏水透析(截留分子量3500Da)48h， 去除NaCl,减压浓缩， 得到不同的纯 化组。
14、分DY1、 DY2、 DG1、 DG2。 0025 进一步优选的， 采用Sephadex G-200对所得到DY1、 DY2、 DG1、 DG2进一步纯化， 确定 其是否为单一多糖组分， 洗脱液为蒸馏水， 苯酚硫酸法跟踪监测所收集的组分。 0026 优选的， 发酵完成后， 过滤， 减压浓缩， 5000rpm离心5min， 流水透析72-80h(透析袋 截留分子量3500Da),减压浓缩， 即得固态发酵粗多糖。 0027 一种液态发酵制备高活性铁皮石斛内生真菌多糖的方法， 包括以下步骤： 0028 (1)将活化的Fusarium solani DO7菌株接种于已灭菌的液态培养基中， 培养后过 滤。
15、、 浓缩、 醇沉、 提取、 纯化后获得纯化多糖组分， 收集纯化多糖组分； 0029 (2)取对数生长期的RAW264.7细胞， 调整密度为2105/mL， 加到96孔板， 37、 5 CO2贴壁培养24h后， 吸取培养液， 分别加入纯化的多糖组分DY1、 DY2、 DG1、 DG2(62.5、 125、 250、 500、 1000 g/mL)、 20ng/mL的脂多糖LPS， 每个样本设置3个平行组， 封口膜封好板后置 于37、 含5CO2恒温培养箱孵育24h， 收集上清液； 0030 (3)根据Grisee试剂盒说明取已收集的上清液100ul于96孔板， 加入等体积的 Grisee试剂混合。
16、， 室温下震荡反应10min后在540nm波长处测定吸光度， 根据NO2-标准曲线 计算上清液中NO释放量； 说明书 2/5 页 4 CN 109234333 A 4 0031根据ELISA试剂盒说明测定已收集上清液的细胞因子(TNF- 、 IL-6)的释 放量。 0032 进一步地， 步骤(2)中在对RAW264.7细胞加药之前， 首先通过MTT(四甲基偶氮唑 蓝)比色法进行细胞毒性试验， 检查内生真菌多糖组分的细胞毒性， 即对RAW264.7细胞的生 长抑制作用。 0033 0034 与现有技术相比， 本发明具有如下优点和有益效果： 0035 (1)本发明采用PDB培养基补充葡萄糖， 酵母。
17、粉， KCL和KH2PO4进行多糖发酵， 产物产 量、 活性均有提高， 制备过程绿色、 环保。 0036 (2)本发明制备方法工艺简单易行， 条件温和， 设备要求低， 为实现铁皮石斛内生 真菌多糖的有效综合开发应用提供了新途径。 附图说明 0037 图1a、 图1d是在补充成分的PDB培养基发酵获取的粗多糖经DEAE-52纯化的曲线 图。 0038 图1b、 图1c、 图1e、 图1f在补充成分的PDB培养基发酵获取的粗多糖经Sephadex G200纯化的曲线图。 0039 图2a-图2e分别是气相色谱法测定所获取单糖标准曲线、 纯化多糖组分DY1,DY2, DG1,DG2的单糖组成图。 0。
18、040 图3a-图3d分别是气相色谱法测定所获取纯化多糖组分DY1,DY2,DG1,DG2的分子 量图。 0041 图4a-图4e分别是纯化的多糖组分对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性， 细胞增 殖， 细胞因子IL-6， TNF- ,NO的影响柱状图。 具体实施方式 0042 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的描述， 但本发明并不 局限于此。 0043 实施例1 0044 (1)铁皮石斛内生真菌Fusarium solani DO7在pH 6.5的PDB培养基中28活化培 养5d， 得到发酵菌种种子液； 0045 (2)根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加9.8g/。
19、L葡萄糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4， 1M HCl调整pH 6.5,分装到1L的锥形瓶中， 每瓶200mL， 封口 后121灭菌20min， 取出后冷却， 接种15(v/v)的种子液， 28发酵13天； 待发酵完成后， 过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 浓缩、 冻干得到粗多糖样品， 产量2.920.36g/L； 0046 (3)将得到的粗多糖样品用蒸馏水溶解为2mg/ml的溶液， 采用Sevage法脱除蛋白 (氯仿： 正丁醇5： 1， v/v)和色素， 全波长扫面检测蛋白和色素脱出效果， 然后减压浓缩得 脱蛋白色素的粗多糖； 然后采用DEAE。
20、-52纤维素阴离子交换树脂纯化粗多糖， 洗脱液为浓度 说明书 3/5 页 5 CN 109234333 A 5 0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8的NaCl溶液， 自动收集器收集不同浓度的洗脱液， 苯酚硫酸法检测洗脱 液多糖浓度， 绘制洗脱曲线， 得到多糖组分DY1、 DY2、 DG1、 DG2， 对得到的组分采用 SephadexG-200进一步纯化， 确定DEAE-52纯化的组分为单一组分(见图1a-图1f)； 对收集到 的多糖组分采用气相色谱法测定其分子量及单糖组成(见图2a-图2e， 图3a-图3d)， 结果表 明DY1、 DY2、 DG1、 DG2单糖组成分别为鼠李糖： 木糖。
21、： 葡萄糖： 半乳糖1.5:1.7:4.1:3.9， 鼠 李糖： 阿拉伯糖： 葡萄糖： 半乳糖1.7:1.3:3.4:2.9， 阿拉伯糖： 甘露糖： 葡萄糖： 半乳糖 1:2.1:3.2:2.8， 阿拉伯糖： 甘露糖： 葡萄糖： 半乳糖1:2.8:1.9:4.3； 分子量分别为： 1.3kDa， 174.6kDa， 147.3kDa， 152.8kDa。 0047 (4)取已传代培养23代的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7通过MTT比色法测定多糖 纯化组分DY1、 DY2、 DG1、 DG2对其生长抑制作用， 结果表明所得多糖组分对RAW264.7几乎无 抑制作用， 即无明显的细胞毒性(见图4。
22、a-图4e)， 可进行后续实验研究； 然后评价所得纯化 组分对RAW264.7细胞的增殖活性及免疫活性的影响， 结构表明不同浓度的多糖组分均能促 进RAW264.7细胞的增殖； 并且均能不同程度激活RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF- )、 白细胞介素-6(IL-6)， 表明DGS1和DGS2具有较高的增强机体免疫的作用。 0048 实施例2 0049 (1)铁皮石斛内生真菌Fusarium solani DO7在pH 6.5的PDB培养基中28活化培 养5d， 得到发酵菌种种子液； 0050 (2)配置PDB发酵培养基， 1M HCl调整pH 6.5,分装到1L的锥形瓶中， 每瓶2。
23、00mL， 封 口后121灭菌20min， 取出后冷却， 接种15(v/v)的种子液， 28发酵13天； 待发酵完成 后， 过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 浓缩、 冻干得到粗多糖样品， 产量2.420.36g/L， 本实施例的多 糖产量明显低于补充添加9.8g/L葡萄糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4的 发酵培养基。 0051 实施例3 0052 (1)铁皮石斛内生真菌Fusarium solani DO7在pH 6.5的PDB培养基中26活化培 养5d， 得到发酵菌种种子液； 0053 (2)根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加9.8g/L。
24、葡萄糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4， 1M HCl调整pH 6.5,分装到1L的锥形瓶中， 每瓶200mL， 封口 后121灭菌20min， 取出后冷却， 接种15(v/v)的种子液， 28发酵13天； 待发酵完成后， 过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 浓缩、 冻干得到粗多糖样品， 产量2.130.24g/L； 多糖产量明显低 于种子培养基在28培养时的产量(2.920.36g/L)。 0054 实施例4 0055 (1)铁皮石斛内生真菌Fusarium solani DO7在pH 6.5的PDB培养基中28活化培 养7d， 得到发酵菌种种子液。
25、； 0056 (2)根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加9.8g/L葡萄糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4， 1M HCl调整pH 6.5,分装到1L的锥形瓶中， 每瓶200mL， 封口 后121灭菌20min， 取出后冷却， 接种15(v/v)的种子液， 28发酵13天； 待发酵完成后， 过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 浓缩、 冻干得到粗多糖样品， 产量2.770.13g/L； 多糖产量与种子 培养基培养5d时的产量(2.920.36g/L)无显著性差异(p0.05)， 所以从成本效益考虑 选取种子培养基培养时间为5d。 说明书 4/5 页。
26、 6 CN 109234333 A 6 0057 实施例5 0058 (1)铁皮石斛内生真菌Fusarium solani DO7在pH 6.5的PDB培养基中26活化培 养5d， 得到发酵菌种种子液； 0059 (2)根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加9.8g/L葡萄糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4， 1M HCl调整pH 6.5,分装到1L的锥形瓶中， 每瓶200mL， 封口 后121灭菌20min， 取出后冷却， 接种15(v/v)的种子液， 28发酵15天； 待发酵完成后， 过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 浓缩、 冻干得到粗多糖样。
27、品， 产量2.820.25g/L； 多糖产量与发酵 时间为13天时产量稍低， 但无明显差别(2.920.36g/L)， 所以选取发酵时间为13d。 0060 实施例6 0061 (1)铁皮石斛内生真菌Fusarium solani DO7在pH 6.5的PDB培养基中26活化培 养5d， 得到发酵菌种种子液； 0062 (2)根据确定的组成配置PDB发酵培养基并添加9.8g/L葡萄糖， 0.69g/L酵母粉， 0.05g/L KCl和0.05g/L KH2PO4， 1M HCl调整pH 6.5,分装到1L的锥形瓶中， 每瓶200mL， 封口 后121灭菌20min， 取出后冷却， 接种15(v。
28、/v)的种子液， 26发酵15天； 待发酵完成后， 过滤、 浓缩、 醇沉、 透析、 浓缩、 冻干得到粗多糖样品， 产量2.620.25g/L； 多糖产量与发酵 时间为13天时的产量有显著差异(2.920.36g/L)， 且偏低， 所以选取发酵时间为13d。 说明书 5/5 页 7 CN 109234333 A 7 图1a 图1b 说明书附图 1/12 页 8 CN 109234333 A 8 图1c 图1d 说明书附图 2/12 页 9 CN 109234333 A 9 图1e 说明书附图 3/12 页 10 CN 109234333 A 10 图1f 图2a 说明书附图 4/12 页 11 。
29、CN 109234333 A 11 图2b 图2c 说明书附图 5/12 页 12 CN 109234333 A 12 图2d 图2e 说明书附图 6/12 页 13 CN 109234333 A 13 图3a 图3b 说明书附图 7/12 页 14 CN 109234333 A 14 图3c 图3d 说明书附图 8/12 页 15 CN 109234333 A 15 图4a 说明书附图 9/12 页 16 CN 109234333 A 16 图4b 说明书附图 10/12 页 17 CN 109234333 A 17 图4c 说明书附图 11/12 页 18 CN 109234333 A 18 图4d 图4e 说明书附图 12/12 页 19 CN 109234333 A 19 。