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1、(10)申请公布号 CN 102051406 A (43)申请公布日 2011.05.11 CN 102051406 A *CN102051406A* (21)申请号 200910207455.X (22)申请日 2009.11.03 C12Q 1/26(2006.01) (71)申请人 凯熙医药 ( 武汉 ) 有限公司 地址 430079 湖北省武汉市东湖高新技术开 发区高新大道 166 号 (72)发明人 曾慧慧 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 (54) 发明名称 一种用于预报人体发生异常增殖或肿瘤发生 风险的检测方法 (57) 摘。
2、要 本发明涉及一种用于预报人体异常增殖或肿 瘤发生风险的检测方法， 所述检测方法包括测定 样品中的下述指标 ： 1)用DTNB直接测定样品中总 巯基含量 ； 2) 采用特异性的硫氧还蛋白还原酶抑 制剂化合物， 选择性地抑制样本中的硫氧还蛋白 还原酶活性后， 再用 DTNB 测定样品中其他巯基物 质的含量， 所述的特异性的硫氧还蛋白还原酶抑 制剂化合物为具有 TrxR 抑制活性的硒啉类化合 物 ； 3) 用总巯基含量减去其他巯基含量， 即得样 品中的TrxR的含量和活性。 本发明的检测结果可 用于异常增殖或肿瘤发生风险， 并具有特异性和 高选择性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国。
3、国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 16 页 附图 1 页 CN 102051412 A1/2 页 2 1. 一种用于预报人体异常增殖或肿瘤发生风险的检测方法， 所述检测方法包括测定样 品中的下述指标 ： 1) 用 DTNB 直接测定样品中总巯基含量 ； 2) 采用特异性的硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物， 选择性地抑制样本中的硫氧还蛋白 还原酶活性后， 再用 DTNB 测定样品中其他巯基物质的含量， 所述的特异性的硫氧还蛋白还 原酶抑制剂化合物为具有 TrxR 抑制活性的硒啉类化合物 ； 3) 用总巯基含量减去其他巯基含量， 即得样品中的 TrxR 的含量和活性。 。
4、2. 根据权利要求 1 所述的方法， 所述的硒啉类化合物选自具有下述 I-X 结构的硒啉类 有机硒化合物 ： 权 利 要 求 书 CN 102051406 A CN 102051412 A2/2 页 3 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 所述样品选自血液或组织， 优选为血液。 4. 一种预报异常增生或肿瘤发生风险的方法， 包括 ： 1) 正常人群或未见异常者的 TrxR 活性低于 1 ； 2) 异常增生人群或者异常增生高风险人群的 TrxR 活性大于 1， 总巯基量不低 于 30， 优选不低于 40 ； 3) 肿瘤病人或肿瘤高风险人群的 TrxR 活性大于 1， 总巯基量不超过 3。
5、0。 权 利 要 求 书 CN 102051406 A CN 102051412 A1/16 页 4 一种用于预报人体发生异常增殖或肿瘤发生风险的检测方 法 技术领域 0001 本发明属于检测方法领域， 具体涉及一种用于预报人体异常增殖或肿瘤发生风险 的检测方法。 背景技术 0002 生物个体在各种因子的刺激下使细胞分裂活跃， 细胞数量增多， 产生各种疾病， 称 之为异常增生， 如代偿性增生、 再生性增生、 内分泌性增生等。异常增生与肿瘤发生密切相 关。 因此， 有效检测或预报异常增生对预报异常增殖或肿瘤发生风险具有十分重要的意义。 然而， 目前国内外预报异常增生的检测方法未见报道。国内外临床。
6、使用的肿瘤标志物主要 用于检测肿瘤形成后抗体或蛋白水平， 不能用于预报异常增殖或肿瘤发生风险。 0003 硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白还原酶 (Thioredoxin reductase， TrxR)、 硫氧还 蛋白(thioredoxin， Trx)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH)， 该系统在肿瘤的发生、 发展、 转移、 浸润、 耐药、 肿瘤血管发生等方面发 挥着重要作用。 已有研究表明， 硫氧还蛋白系统与癌症的关系密切 ： 1)Trx和TrxR为癌症的 标志性物 ： TrxR 在肿瘤细胞中表达量是。
7、正常组织的 10 倍。Turunen 等通过免疫组化的方法 研究了 Trx 和 TrxR 在乳腺癌患者体内的表达情况， 结果是 Trx 和 TrxR 在患者细胞质中的 阳性率分别为67和59， 在细胞核中的阳性率为55和6。 并且， Trx在细胞核和细胞 质中均为阳性的乳腺癌患者的癌细胞增殖很快， 病程很短。 Lincoln等采用免疫细胞化学法 测定 TrxR 在人原发乳腺癌、 甲状腺癌、 前列腺癌、 结肠直肠癌及恶性黑色素瘤中的定位与 表达， 结果显示， 侵袭力强的肿瘤过度表达 TrxR， 且增殖力强、 凋亡率低、 转移力高。Yoo MH 等人完成的肿瘤细胞 TrxR1 基因敲除实验证明， 。
8、TrxR1 在肿瘤细胞中是必不可少的 ； 2)Trx 系统参与肿瘤发展的不同阶段， 并表现出在肿瘤细胞中过量表达、 促进肿瘤增殖、 表达促存 活信号和启动促存活过程等特点。因此， 检测机体的 TrxR 水平对预报异常增殖或肿瘤发生 具有非常重要的作用。 0004 CN1166651C、 CN1281593C、 CN1242999C、 CN1280279A、 CN1704408A、 CN1704409A、 CN1704410A、 CN1853627A、 CN1990475A 和 CN200910077161.X 分别公开了 “具有抗炎和抗 肿瘤作用 R- 双或糖苯丙异硒唑取代化合物” 、“苯并异。
9、硒唑衍生物的免疫调节和生物治疗作 用” 、“苯并异硒唑衍生物及其应用” 、“双苯并异唑酮类化合物及其合成和应用” 、“异硒唑酮类 化合物和其配合物及其应用” 、“具有抗纤维化及抑制明胶酶活性的化合物及其应用” 、“苯并 异硒唑酮衍生物及其制备方法与应用” 、“双苯并异硒唑乙烷环糊精或环糊精衍生物包合物及 其制备方法和其用途” 、“取代苯并异硒唑酮类化合物及其用途” 、“硫氧还蛋白还原酶抑制剂 化合物及其制备方法和其应用” 。这些申请或专利所公开的内容均作为本申请的参考。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种用于预报人体异常增殖或肿瘤发生风险的检测方法， 说 明 书 CN 1020514。
10、06 A CN 102051412 A2/16 页 5 所述检测方法包括测定样品 ( 如人血或组织 ) 中的下述指标 ： 0006 1) 用 DTNB 直接测定样品中总巯基含量 ； 0007 2) 采用特异性的硫氧还蛋白还原酶抑制剂化合物， 选择性地抑制样本中的硫氧还 蛋白还原酶活性后， 再用 DTNB 测定样品中其他巯基物质的含量， 所述的特异性的硫氧还蛋 白还原酶抑制剂化合物为具有TrxR抑制活性的硒啉类化合物， 优选为具有下述I-X结构的 硒啉类有机硒化合物 ： 0008 0009 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A3/16 页 6 0010 其中， 。
11、有机硒化合物 I-X 的制备、 确认和应用可全文参考 CN200910077161.X 所公 开的技术内容 ； 0011 3) 用总巯基含量减去其他巯基含量， 即得样品中的 TrxR 的含量和活性。 0012 进一步， 所述样品选自血液或组织， 优选为血液。 0013 本发明采用特异性的 TrxR 抑制剂抑制 TrxR 活性， 通过背景扣除法测定生物样本 中的 TrxR 活性， 来预报人体异常增殖或肿瘤发生风险。 0014 抗氧化能力 / 氧化应激水平与肿瘤发生发展密切相关。抗氧化能力弱， 氧化应激 水平升高， 则预示着肿瘤发生的可能。定量检测血液中的总巯基含量可作为机体抗氧化 能力或抗氧化能。
12、力的整体水平的一项有效检测指标 (Kleinman WA， Richie JP Jr.Status 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A4/16 页 7 of glutathione and other thiols and disulfides in human plasma.Biochem Pharmacol.2000 Jul 1 ； 60(1) ： 19-29)。 丙二醛(MDA)是脂质过氧化损伤的终产物， 测定血 液中的 MDA 含量可以有效地反映机体的氧化应激水平。 0015 研究证明， 硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白在多种肿瘤中高度表达， 并与肿瘤的。
13、 发生、 发展、 转移、 浸润、 耐药、 肿瘤血管发生密切相关。 细胞分泌硫氧还蛋白进入外周血液， 肿瘤病人血液中硫氧还蛋白的含量远高于健康人， 并且与肿瘤疾病的进程和病人的生存期 密切相关。因此， 以硫氧还蛋白系统的功能评价为主导的， 抗氧化能力 / 氧化应激水平的综 合评价系统， 符合肿瘤疾病的发生特点。 0016 目前， 国际上采用硫代葡萄糖金 (Aurothioglucose， 结构式见式 1) 抑制法测定 TrxR活性， 其工作原理是 ： 一是用DTNB测定样品中的总还原能力 ； 二是用Aurothioglucose 抑制样品中TrxR的活性后， 再测定DTNB的还原能力 ； 三是计。
14、算样品前后两次还原能力的差 值来测定样品中 TrxR 的活性。但是， Aurothioglucose 缺乏特异性， 对样品中的其他巯基 物质也可发生封闭作用， 不适用于直接测定血液或组织样品中的 TrxR 活性。例如， Hill KE 等 (Determination of thioredoxin reductase activity in rat liver supernatant. Anal Biochem. ， 1997， Nov 1 ； 253(1) ： 123-5) 采用 Aurothioglucose 测定大鼠肝匀浆 中的 TrxR 活性时， 要先对肝匀浆进行透析处理， 以除去其中。
15、的小分子巯基物质 ( 如谷胱甘 肽)后， 再加入Aurothioglucose测定其TrxR活性。 可见， 其他小分子巯基物质(如谷胱甘 肽)可干扰硫代葡萄糖金对TrxR的活性测定。 另一研究结果表明， Aurothio-glucose会增 加血液中巯基物质与 DTNB 的反应速率 (Hu ML， Dillard CJ， Tappel AL In vivo effects of aurothioglucose and sodium thioglucose on rat tissue sulfhydryl levels and plasma sulfhydryl reactivity.Agent。
16、s Actions .1988， Aug ； 25(1-2) ： 132-8)。 0017 0018 本发明所用的硒啉类化合物， 尤其是硒啉类有机硒化合物I-X对TrxR具有强效的 抑制作用。体外抑制试验显示， 有机硒化合物 I-X 对哺乳动物 TrxR 具有强抑制作用， 其半 数抑制浓度为 0.35M( 如图 1 所示 )。 0019 本发明所用的硒啉类化合物， 尤其是有机硒化合物I-X对TrxR的抑制作用具有高 选择性， 截至目前为止， 该类化合物是报道的唯一具有特异靶向的 TrxR 抑制剂， 可有效结 合在 TrxR 的 SeCys/Cys 活性位点而发挥抑制作用， 从而高度选择性地抑制。
17、 TrxR( 如图 2 所 示 )。 0020 另外， 本发明所用的硒啉类化合物， 尤其是有机硒化合物 I-X 对 TrxR 的抑制作用 不受体系中其他巯基物质的干扰， 具有高选择性。 研究表明， 即使样品体系中存在高浓度的 其他巯基物质时， 如 0.5mM 还原型谷胱甘肽， 本发明所用的硒啉类化合物， 尤其是有机硒化 合物 I-X 依然对 TrxR 表现高选择性的强抑制作用 ( 如图 3 所示 )。 0021 因此， 本发明所用的硒啉类化合物， 尤其是有机硒化合物 I-X 可作为 TrxR 的特异 性抑制剂， 用于测定复杂体系中 TrxR 酶的活性， 所述复杂体系包括人血和组织样本。 说 明。
18、 书 CN 102051406 A CN 102051412 A5/16 页 8 0022 由于硫氧还蛋白还原酶可以催化还原 5， 5- 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )(DTNB) 分 子中二硫键， 使其还原为 5- 巯基 -2- 硝基苯甲酸 (TNB)， 而 TNB 在 405 412nm 处有强烈的 紫外吸收， 可通过检测单位时间内 TrxR 催化 DTNB 的量来反映该酶的活性。 0023 本发明的目的在于提供一种预报异常增生或肿瘤发生风险的方法， 包括 ： 1) 正常 人群或未见异常者的 TrxR 活性低于 1 ； 2) 异常增生人群或者异常增生高风险人群的 TrxR 活性大于 1，。
19、 总巯基量不低于 30， 优选不低于 40 ； 3) 肿瘤病人或肿瘤高风险人群的 TrxR 活 性大于 1， 总巯基量不超过 30。 0024 本发明试剂盒的组成包括 ： 0025 ( 一 ) 检测试剂 0026 1.DTNB 粉末 49.8mg， 避光， 室温保存 ； 0027 2.NADPH 粉末 4.2mg， 避光， -20保存 ； 0028 3.10 工作液 (1M 磷酸钾缓冲液， PH 7.4， 内含 73.1mg EDTA， 5mg BSA。)2mL， 4保存 ； 0029 4.TrxR 抑制剂溶液 (2.5mM 的有机硒化合物 I-X)， 100uL， -20保存 ； 0030 。
20、5. 阳性对照 ： 大鼠肝脏 TrxR， 5 Unit， -20保存 ； 0031 6.TNB 标准品 ； 0032 所述的检测试剂可用于 100 次测试 ； 0033 ( 二 ) 其他 0034 1.96 空板或者比色杯 ； 0035 2. 酶标仪或分光光度计 (405 412nm)。 0036 本发明试剂盒的测定过程包括 ： 0037 ( 一 ) 溶液的配制 0038 1.1 工作液 (assay buffer) 0039 取 2mL 的 10 工作液 (0.5M 磷酸钾缓冲液， PH7.4) 用去离子水定容至 20mL( 内 含 73.1mg 乙二胺四乙酸 (EDTA)， 5mg 牛血清。
21、白蛋白 (BSA)， 室温下使用， 可供 100 孔检测 ； 0040 2. 称取 39.6mg DTNB 溶解于 10mL 的 1 工作液中， 避光室温保存， 现用现配 ； 0041 3. 称取 4.2mg NADPH 溶解于 2ml 的 1 工作液中， 避光 4待用， 临用前避光恢复 至室温 ； 0042 4.TrxR抑制剂工作液(25M) ： 取10l抑制剂储备液(2.5mM)， 加入1工作液， 稀释至 1mL， 供 50 孔检测， 室温下使用。 0043 ( 二 ) 操作步骤 0044 1. 取 96 孔板， 板底洁净透明， 在 405nm 处无干扰吸收 ； 0045 2. 样品孔加入。
22、 ： 20l 样品 +60l 0.1M 磷酸钾缓冲液 ； 0046 3. 样品 + 抑制剂孔加入 ： 20l 样品 +20l 抑制剂工作液 +40l0.1M 的 1 工 作液 (0.05M 磷酸钾缓冲液 ) ； 0047 4. 将加样后的 96 孔板置于 37， 避光孵育 1h ； 0048 5.向各个样孔加入20l的NADPH工作液后， 再加入100l的DTNB工作液， 室温 下， 波长 405nm 处， 立即记录初始吸光度值 (A0s) 并连续测定 420s 吸光度值 (A420s)。 0049 或者各孔加样方式见表 1。 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412。
23、 A6/16 页 9 0050 表 1 加样方式 0051 0052 根据 TrxR 活性决定， 可不设阳性对照组。 0053 各物质终浓度为 ： 5mM 的 5， 5- 二硫代双 (2- 硝基苯甲酸 )， 0.2mM 的烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸 (NADPH)， 10mM 的 EDTA， 0.2mg/mL 的 BSA， 2.5M 的有机硒抑制剂。 0054 结果计算， 0055 其中， A/min (A样品 420s-A样品 0s)-(A样品抑制剂 420s-A样品抑制剂 0s)/7min ； 可得硫氧还 蛋白还原酶活性， 即每分钟每 mL 样品催化 DTNB 的纳摩尔量。 附图说明 0056。
24、 图 1 乙烷硒啉对大鼠动物硫氧还蛋白还原酶的体外抑制活性 ； 0057 图 2 乙烷硒啉对谷胱甘肽还原酶的抑制作用 ； 0058 图 3 谷胱甘肽对乙烷硒啉酶抑制作用的影响。 具体实施方式 0059 以下将结合实施例具体说明本发明， 本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方 案， 并非限定本发明的实质。 0060 实施例 1TrxR 活性与人体异常增生或肿瘤发生风险的研究采用本发明的试剂盒， 测定了 58 例临床检测为正常人和 20 人次肿瘤病人的血液中硫氧还蛋白还原酶的活性， 用 于预报人体发生异常增生或肿瘤发生的风险。 0061 表 2TrxR 活性与人体异常增生或肿瘤发生风险的研究 00。
25、62 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A7/16 页 10 0063 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A8/16 页 11 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A9/16 页 12 0064 0065 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A10/16 页 13 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A11/16 页 14 0066 0067 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A12/16 页 15。
26、 0068 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A13/16 页 16 0069 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A14/16 页 17 0070 注 ： 异常增生程度依次为 ： 正常， 正常 -( 需要复查或定期检查 )， 正常 -( 异常增 生相关 )， TRCA/ 正， TRCA+， TRCA+， TRCA+， TRCA+， 大于 TRCA+(TRCA 代表肿瘤病 人 TR 水平， + 代表 TR 活性程度 )。 0071 由表 2 可见， 44 例未见异常者有 7 例提示有异常增生表现， 建议定期检查， 且 70 正常。
27、人群的TrxR活性低于1 ； 14例有异常增生人群的TrxR活性大于1， 且总巯基量在30以 上 ； 多数肿瘤病人的 TrxR 大于 1， 且总巯基量不超过 30。 0072 实施例 2TrxR 活性与人体异常增生或肿瘤发生风险的研究 0073 本发明的检测方法用于预报 300 例人次的异常增生或肿瘤发生风险， 得出 ： 超过 70的人群未见异常者， 其TrxR活性低于1 ； 超过70的异常增生人群的TrxR活性大于1， 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A15/16 页 18 总巯基量在 30 以上 ； 70以上的肿瘤病人的 TrxR 活性大于， 总巯基量不。
28、超过 30。 0074 表 3 本方法与临床诊断比较 0075 0076 本表中数据基于总例数 300 中绝对临床正常， 绝对临床评价异常增生， 临床已判 断为肿瘤病人的三种人群得出 0077 本发明的检测方法用于预报表 2 中 78 例人的肿瘤发生风险， 得出 ： 80以上肿瘤 病人的 TrxR 活性大于 1， 而总巯基量在 30-40， 且与正常人群的 TrxR 活性和总巯基量存在 显著差异。 0078 与目前临床上广泛使用的甲胎蛋白 (AFP) 和癌胚抗原 (CEA) 检测法相比 ( 通常检 测敏感 45 -60 )， 本发明的预报方法的敏感性显著高于 CEA 和 AFP 检测法， 具有临床应 用价值。 0079 表 4 临床恶性肿瘤中 AFP 和 CEA 检测结果 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A16/16 页 19 0080 0081 其中， AFP 和 CEA 数据源自陈永伟等，放射免疫学杂志 ， 2001 年， 第 14 卷第 5 期 ： 318。 说 明 书 CN 102051406 A CN 102051412 A1/1 页 20 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102051406 A 。