一种bcl-2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 101993930 A (43)申请公布日 2011.03.30 CN 101993930 A *CN101993930A* (21)申请号 200910056167.9 (22)申请日 2009.08.10 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 芮屈生物技术 ( 上海 ) 有限公司 地址 201108 上海市闵行区光华路 728 号 4 幢 426 室 (72)发明人 张云福 裘建英 (74)专利代理机构 上海翼胜专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 31218 代理人 翟羽 (54) 发明名称 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒及其 检测方法和。

2、应用 (57) 摘要 本发明涉及一种 bcl-2 基因的原位杂交检测 试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探 针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一 种 bcl-2 基因原位杂交检测方法。 另外，本发明 还提供了试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应 用。 本发明优点在于 ：本发明提供的试剂盒具 有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方 法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用 和推广。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 CN 101993934 A1/1 页 2 1. 一种 。

3、bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用， 所述的 试剂盒包括杂交探针、 标记物， 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所 示的 RNA 序列。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的标记物选自放射性核素或非 放射性标记物。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的放射性核素选自 3H、35S、125I 或32P 中的一种。 5. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的非放射性标记物选自。

4、生物素、 地高 辛、 碱性磷酸酶、 辣根过氧化酶或荧光素中的一种。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的非放射性标记物优选自地高辛。 7. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述的试剂盒还包括增效剂， 所述的 增效剂是碱性磷酸酶抗体。 8. 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物， 其特征在于， 所述 的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示， 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 9. 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： a、 将权利要求 8 所述试剂盒中的。

5、杂交探针与底物中待测 RNA 接触， 形成杂交复合体 ； b、 检测 a 步骤得到的杂交复合体。 10.根据权利要求9所述的检测方法， 其特征在于 ： a步骤中形成杂交复合体的条件为 ： 核酸杂交的温度为 42 ； 核酸杂交的时间为 16-24 小时， 所述的底物选用血液细胞标本或 组织细胞标本。 权 利 要 求 书 CN 101993930 A CN 101993934 A1/9 页 3 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应 用 【技术领域】 0001 本发明涉及一种试剂盒， 具体地说关于一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用 【背景技术】 00。

6、02 癌症也叫恶性肿瘤， 肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下， 局部组织的细胞异常 增生而形成的局部肿块。癌症病变的基本单位是癌细胞。人体细胞老化死亡后会有新生 细胞取代它， 以维持机体功能， 人体绝大部分细胞都可以增生， 但这种增生是有限度的， 而 癌细胞的增生则是无止境的， 这使患者体内的营养物质被大量消耗。 同时， 癌细胞还能释放 出多种毒素， 使人体产生一系列症状， 晚期时它转移到全身各处生长繁殖， 最后导致人体消 瘦、 无力、 贫血、 食欲不振、 发热及脏器功能受损等， 器官功能衰竭而死亡。 0003 根据国内外权威机构提供的资料， 我国每年癌症的新增人数 160 万， 死亡人数近 1。

7、60万， 患者600万， 全球每年新增癌症患者800万， 死亡人数接近800万， 患者约有8400万 人， 到 2020 年以上人数将翻一番， 这是一组可怕的数字。而且， 绝大部分癌症患者都只有很 短的生存期， 人类到目前为止还没战胜癌症这一恶疾， 如何做到治愈癌症的关键是要做到 基因水平的早期诊断。 0004 癌症从癌前变到形成癌症， 需要几年时间， 要做到早期检测、 诊断、 预后的检测及 诊治后的复发、 转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。 0005 bcl-2 基因是从 B 细胞滤泡性淋巴瘤染色体断裂点发现的凋亡抑制基因， 它可 以使细胞寿命延长， 生长失去平衡， 造成细胞数目的积聚。

8、， 而对细胞的增殖没有明显影响。 bcl-2 基因可以抑制多种组织的细胞凋亡， 作为重要的凋亡抑制基因在多种肿瘤中被研 究。Masuda 等研究发现， 肾盂和输尿管移行细胞癌 bcl-2 阳性率随肿瘤细胞分级的升高而 升高。高江平等研究发现， bcl-2 阳性的上尿路上皮肿瘤患者的复发频率高于阴性患者。 bcl-2 阳性患者 4 年之后的存活率曲线与阴性患者明显分离， bcl-2 免疫染色可作为中长 期存活的预后指标。在早期胃癌研究中发现， bcl-2 表达水平升高者容易发生浸润与转移， bcl-2-2psi 为一种缩短了的新的 bcl-2。bcl-2 基因有非常重要的临床癌症检测指标性意 义。

9、。 0006 随着分子生物技术日益完善， 功能基因组学， 癌症基因组学等研究的深入展开， 至 今， 我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断， 在癌变前期或癌细胞形成 ( 单克隆 时 ) 就能做到早期预测诊断。采用核酸原位杂交技术检测 bcl-2 基因， 对临床的各种类型 癌症的基因食品的早期诊断有非常重要的临床意义。 0007 本发明的原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技 术结合起来， 以标记的核酸分子为探针， 在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。 其原 理是使含有特异序列、 经过标记的核酸单链 ( 即探针 )， 在适宜条件下与组织细胞中。

10、的互补 核酸单链即靶核酸发生杂交， 再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 A2/9 页 4 从而在细胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。 【发明内容】 0008 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。 0009 本发明的再一的目的是， 提供一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒。 0010 本发明的另一的目的是， 提供一种 bcl-2 基因的原位杂交检测方法。 0011 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ： 0012 一种 bcl-2 。

11、基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症疾病药物中的应用， 所 述的试剂盒包括杂交探针、 标记物， 所述的杂交探针序列如 SEQ ID ： bcl-2 基因， 序列号 NM_000633， 6492bp， mRNA， 18q21.3， cds ： 4941213bp。 0013 所述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示的 RNA 序列。 0014 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 0015 所述的放射性核素选自 3H、35S、125I 或32P 中的一种。 0016 所述的非放射性标记物选自生物素、 地高辛、 碱性磷酸酶、 辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。 0017 所述的。

12、非放射性标记物优选自地高辛。 0018 所述的试剂盒还包括增效剂， 所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。 0019 为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 0020 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物， 其中所述的杂交 探针序列如 SEQ ID NO.1 所示， 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 0021 为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 0022 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测方法， 该方法包括以下步骤 ： 0023 a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测 RNA 接触， 形成杂交复合体 ； 0024 b、 检测 a。

13、 步骤得到的杂交复合体。 0025 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针， 杂交液， 显色剂， 增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知， 具体操作步骤是标本处理、 预杂交、 杂 交、 免疫组化染色、 镜下进行定量分析、 结果报告， 其中杂交的具体步骤包括 ： 0026 仪器操作 ： 0027 1). 将待测标本放入反应槽中 ； 0028 2). 仪器自动弃去液体， 自动加消化液 ； 0029 3). 仪器自动弃去液体， 自动后固定 ； 0030 4). 仪器自动弃去液体， 自动预杂交 (42 ) ； 0031 5). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ； 0032 6).。

14、 仪器自动弃去液体， 自动杂交 (42 ) ； 0033 7). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ； 0034 8). 仪器自动弃去液体， 自动与 DIG 抗体培养 ( 室温 ) ； 0035 9). 仪器自动弃去液体， 自动清洗， 显色 ； 0036 10). 取出封片镜检。 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 A3/9 页 5 0037 本发明优点在于 ： 0038 1、 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、 特异性强的特点。 0039 2、 本发明的检测方法操作方便、 简单， 能在区级以上医院普遍使用和推广。 0040 3、 本发明的临床意义是更早期跟踪检测癌症。

15、发生动态过程， 以及用于癌症预防医 学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物， 以及影像 医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测 bcl-2 异常表达， 在影像医学检查及 其它检查未发现占位性癌症病灶之前， 癌症生化指标未产生异常之前， 亦未形成肿块之前， 能及早做到以上基因表达异常的信息采集， 给临床癌症病患一个真正的预后早期诊断。这 样才有可能实施癌症的早期诊断、 早期预防、 早期治疗， 有可能从源头上彻底根治癌症恶 疾。 【附图说明】 0041 图 1 是本发明实施例中癌症病人 bcl-2 过量表达图片。 0042 图 2 是本发明实施例中正常人 bc。

16、l-2 表达图片。 【具体实施方式】 0043 下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。 0044 实施例 1 0045 一种 bcl-2 基因的原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针、 标记物、 增效剂， 其中， 所 述的杂交探针序列如 SEQ ID NO.1 所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和 标本组成如下 ： 0046 消化液 100l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 0047 保护液 100l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 0048 预杂交液 1300l/ 管 2 管 / 盒 无色透明液体 0049 正义杂交液 10l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 005。

17、0 反义杂交液 10l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 0051 封闭液 1000l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 0052 碱性磷酸酶抗体 1l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 0053 显色剂 A 175l/ 管 1 管 / 盒 黄色液体 0054 显色剂 B 320l/ 管 1 管 / 盒 无色透明液体 0055 缓冲液 I 10 x 90ml/ 瓶 1 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 0056 缓冲液 II 10 x 80ml/ 瓶 1 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 0057 缓冲液 III 10 x 20m/ 瓶 3 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 0058 缓。

18、冲液 IV 10 x 90ml/ 瓶 1 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 0059 固定液 90ml/ 瓶 1 瓶 / 盒 无色透明液体 0060 阳性对照标本 6 片 / 盒 0061 上述试剂成分说明 ： 所有试剂购自 SIGMA) 0062 1、 消化液 ： 20mg/ml 蛋白酶 K， 100mg 蛋白酶 K， 加 DEPC-H2O 5ml ； 0063 2、 保护液 ： 0.2g 的 glycine 加入 1ml 的 1 缓冲液 I ； 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 A4/9 页 6 0064 3、 预杂交液 ： 1 缓冲液 II 7.5ml 。

19、0065 50D 3ml 0066 10mg/ml yest t-RNA 750ul 0067 11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0068 0.04M EDTA 3ml 0069 50 formamide 15ml 0070 4、 封闭液 ： 0.03g 的 bloking( 购买自罗氏公司 ) 加入 1ml 1 缓冲液 III ； 0071 5、 10 x 缓冲液 I ： (PH7.1-7.4) 0072 NaCl 80g 0073 Na2HPO4.12H2O 360g 0074 KCl 2g 0075 KH2PO42g 0076 加三蒸水至 1l， 并高压灭菌。

20、 ； 0077 6、 10 x 缓冲液 II ： (PH7.0) 0078 NaCl 175.3g 0079 柠檬酸钠 88.2g 0080 HCl 几滴 0081 加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ； 0082 7、 缓冲液 III ： (PH7.9) 0083 Tris 121.1g 0084 NaCl 87.66g 0085 HCl 60ml 左右 0086 加三蒸水至 1l， 并高压灭菌 ； 0087 8、 缓冲液 IV ： 0088 1M Tris-HCl(PH9.5) ： Tirs 121.1g 加 HCl 3ml 左右， 加水 900ml， 调 PH 至 9.5， 加 水至 1l，。

21、 并高压灭菌 ； 0089 1M NaCl ： NaCl 58.44 加水至 1l， 并高压灭菌 ； 0090 0.5M MgCl2： 101.65g MgCl2.6H2O 加水至 1l， 并高压灭菌 ； 0091 9、 固定液 ： 多聚甲醛 40g 加 1 缓冲液 I 至 1l， 稍加热 ( 约 50-60 度 ) 搅拌至溶 解 ； 0092 10、 显色剂 A ： NBT 1g 加 70 DMF11.44ml ； 0093 11、 显色剂 B ： BCIP 1g 加 100 DMF30ml。 0094 本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 0095 实施例 2 0096 一种 bcl。

22、-2 基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用 0097 一、 标本处理 0098 1、 用 10ml 的离心管， 装 4.5ml 淋巴细胞分离液， 再将 3ml 抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液 ( 血淋巴细胞分离液 1 1.5) 的离心管中， 2000r/min 离心 10min ； 0099 2、 吸取中间层白细胞至另一离心管中， 再在此管中加入约两倍的 1 缓冲液 I， 混 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 A5/9 页 7 匀， 1500g/min 离心 10min ； 0100 3、 弃上清 . 沉淀加入约两倍的 1 缓冲液 I， 混匀， 1500g/。

23、min 离心 10min ； 0101 4、 弃上清， 并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。 再将沉淀制成悬液， 滴在玻片上 推片， 自然干燥。( 有条件的医院可以用制片机制片。)3ml 血， 可以做 4 张片子 ； 0102 5、 用 40ml 4固定液， 在玻璃缸中， 固定 30min， 再用 1 缓冲液 I 洗 5min。每缸 可以放 16 片 ； 0103 6、 标本可保存在 -20， 或继续做实验。 0104 二、 将试剂盒中试剂配制成使用浓度 0105 1、 将 10 缓冲液 I 用三蒸水按 1 10 稀释成 1 缓冲液 I ； 0106 2、 将 20 缓冲液 II 用三蒸水按 1。

24、 10 稀释成 2 缓冲液 II ； 0107 按 1 100 稀释成 0.2 缓冲液 II ； 按 1 200 稀释成 0.1 缓冲液 II ； 0108 3、 将 10 缓冲液 III 用三蒸水按 1 10 稀释成 1 缓冲液 III ； 0109 4、 10 缓冲液 IV 用三蒸水按 1 10 稀释成 缓冲液 IV( 取 1#， 2#， 3# 各 10ml， 加水至 100ml 既可 )。 0110 三、 实验步骤 ： 0111 1、 取每位待检者标本两张， ( 另外两张留作复查用 ) 及阳性对照标本两张 ( 每次 实验做一对阳性对照 ) ； 0112 2、 在玻璃缸里加消化液 ( 消化。

25、液 100ul 加 1 缓冲液 199.9ml， 即为使用浓 度 )20ml。37水浴预热 10 分钟。放进 16 张玻片， 37处理 12min， 再用 1 缓冲液 I 洗 5min ； 0113 3、 用 0.2的保护液 ( 保护液 1ml 加 1 缓冲液 I99ml 即为使用浓度 ) 洗 10min， 三蒸水洗 5min， 以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥 ； 0114 4、 将玻片放入保湿盒内， 加预杂交液 20ul/ 片 . 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42恒温水浴箱中 3h 以上 ； 0115 5、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内， 用 70， 90， 95。

26、的乙醇各洗 2min， 自然干燥 ； 0116 6、 将玻片放入保湿盒内， 每位病人标本两张， 一张加正义杂交液 20ul/ 片， 另一张 加反义杂交液 20ul/ 片， 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42恒温水浴箱中 16-24h ； 0117 7、 取出玻片， 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内 0118 在 42恒温水浴箱中用 2 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min 0119 在 42恒温水浴箱中用 0.2 缓冲液 II 洗一次， 每次 15min 0120 在 42恒温水浴箱中用 0.1 缓冲液 II 洗两次， 每次 15min ； 0121 8、 用 1 缓冲液 III 洗 。

27、30s， 取出玻片， 自然干燥 ； 0122 9、 将玻片放入保湿盒内， 加 0.5 l 封闭液 (1ml 封闭液加 5ml 1 缓冲液 III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒， 在室温下作用 30min ； 0123 10、 取出玻片， 用 1 缓冲液 III 洗 30s， 自然干燥 ； 0124 11、 将玻片放入保湿盒内， 加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1缓冲液III)100ul/ 片， 盖紧保湿盒在室温下作用 30min ； 0125 12、 取出玻片， 用 1 缓冲液 III 洗 3 次， 每次 15min ； 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 。

28、A6/9 页 8 0126 13、 1缓冲液IV洗2min， 加显色剂(显色剂A73.3ul， 显色剂B157.5ul加到30ml 1 缓冲液 IV 中， 混匀 )， 室温避光 12h 以上 ； 0127 14、 用三蒸水洗5min， 自然干燥， (用甘油加10的1缓冲液I混匀)封片镜检。 0128 四、 结果判断 0129 在光镜下计数 100-300 个细胞， 计算染上紫色细胞的百分比。 0130 阳性对照标本加反义杂交液的应该 80以上染上紫色。 0131 所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。 0132 地高辛标记的 cDNA、 RNA 和寡核苷酸探针， 不但探针的具有生物素标记优点， 。

29、还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点 )， 将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测 RNA 核酸进行杂交， 再用免疫组化的方法显色， 在光镜下观察 mRNA 的存在和定位， 根据染色的细胞数， 判断目的基因的表达量。 0133 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术， 该方法通过检测底物细胞中的 bcl-2 基因表达量， 用来确定癌症是否发生。临床研究表明， bcl-2 基因是癌症的特异基因， 因为 bcl-2 基因在正常人中不表达， 唯独在癌表达， 说明癌症已经发生， 用来确定癌症是否 发生， 或是正常。从而获得癌症的诊断信息。 0134 本发明实施例采样为 。

30、： 癌症病人 5 名， 正常对照组 5 名。抽所有待检人的外周血 3-5 毫升 ( 分离白细胞 ) 做原位杂交。结果表示， 所有癌症患者 bcl-2 基因有过度表达， 细 胞染色 ； 正常对照组 bcl-2 基因不表达， 细胞无染色。具体结果请见图 1 和图 2。 0135 实施例 3 0136 用bcl-2基因试剂盒检测癌症疾病与用CD147基因试剂盒检测癌症疾病之间平行 实验。 0137 为了科学评价上述基因各自在癌症疾病的特异性、 敏感性、 准确性。 我们用平行试 验的方法， 同时检测上述基因的 mRNA， 检测技术采用核酸原位杂交技术， 用同一例癌症疾病 患者的外周血， 同时检测bcl。

31、-2基因和CD147(CD147基因-CD147序列号 ： AB085790， 972bp， cds ： 40849bp)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、 免疫组化染色、 镜下记数、 结果报告等均 采用实施例 1 和实施例 2 的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂 )。发现 bcl-2 基因在 癌症疾病病人中表达量比CD147基因在同一疾病病人的表达量要高。 结果表明， bcl-2基因 对癌症疾病诊断的特异性、 敏感性、 准确性比 CD147 基因更好， 原位杂交基因表达图显示， bcl-2 基因的表达量是 70， CD147 基因的表达量是 50。本发明的试剂盒作于癌症疾病 诊断的指标有非。

32、常重要的临床意义。 0138 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 0139 SEQUENCE LISTING 0140 芮屈生物技术 ( 上海 ) 有限公司 0141 一种 bc1-2 基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 0142 / 0143 1 0144 PatentIn version 3.3 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 A7/9 页 9 0145 1 0146 6492 0147 DNA 01。

33、48 智人 (Homo sapiens) 0149 1 0150 tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60 0151 ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120 0152 attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180 0153 ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa。

34、 gtagactgat attaacaata 240 0154 cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300 0155 cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360 0156 cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420 0157 ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg gcgagaggtg。

35、 ccgttggccc ccgttgcttt 480 0158 tcctctggga aggatggcgc acgctgggag aacagggtac gataaccggg agatagtgat 540 0159 gaagtacatc cattataagc tgtcgcagag gggctacgag tgggatgcgg gagatgtggg 600 0160 cgccgcgccc ccgggggccg cccccgcacc gggcatcttc tcctcccagc ccgggcacac 660 0161 gccccatcca gccgcatccc gggacccggt cgccaggacc。

36、 tcgccgctgc agaccccggc 720 0162 tgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgct cagcccggtg ccacctgtgg tccacctgac 780 0163 cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc cgcgacttcg ccgagatgtc 840 0164 cagccagctg cacctgacgc ccttcaccgc gcggggacgc tttgccacgg tggtggagga 900 0165 gctcttcagg gacggggtga actgggggag gattgtggcc。

37、 ttctttgagt tcggtggggt 960 0166 catgtgtgtg gagagcgtca accgggagat gtcgcccctg gtggacaaca tcgccctgtg 1020 0167 gatgactgag tacctgaacc ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctggga 1080 0168 tgcctttgtg gaactgtacg gccccagcat gcggcctctg tttgatttct cctggctgtc 1140 0169 tctgaagact ctgctcagtt tggccctggt gggagct。

38、tgc atcaccctgg gtgcctatct 1200 0170 gggccacaag tgaagtcaac atgcctgccc caaacaaata tgcaaaaggt tcactaaagc 1260 0171 agtagaaata atatgcattg tcagtgatgt accatgaaac aaagctgcag gctgtttaag 1320 0172 aaaaaataac acacatataa acatcacaca cacagacaga cacacacaca cacaacaatt 1380 0173 aacagtcttc aggcaaaacg tcgaatcagc tat。

39、ttactgc caaagggaaa tatcatttat 1440 0174 tttttacatt attaagaaaa aaagatttat ttatttaaga cagtcccatc aaaactcctg 1500 0175 tctttggaaa tccgaccact aattgccaag caccgcttcg tgtggctcca cctggatgtt 1560 0176 ctgtgcctgt aaacatagat tcgctttcca tgttgttggc cggatcacca tctgaagagc 1620 0177 agacggatgg aaaaaggacc tgatcattgg。

40、 ggaagctggc tttctggctg ctggaggctg 1680 0178 gggagaaggt gttcattcac ttgcatttct ttgccctggg ggctgtgata ttaacagagg 1740 0179 gagggttcct gtggggggaa gtccatgcct ccctggcctg aagaagagac tctttgcata 1800 0180 tgactcacat gatgcatacc tggtgggagg aaaagagttg ggaacttcag atggacctag 1860 0181 tacccactga gatttccacg ccgaag。

41、gaca gcgatgggaa aaatgccctt aaatcatagg 1920 0182 aaagtatttt tttaagctac caattgtgcc gagaaaagca ttttagcaat ttatacaata 1980 0183 tcatccagta ccttaagccc tgattgtgta tattcatata ttttggatac gcacccccca 2040 说 明 书 CN 101993930 A CN 101993934 A8/9 页 10 0184 actcccaata ctggctctgt ctgagtaaga aacagaatcc tctggaactt g。

42、aggaagtga 2100 0185 acatttcggt gacttccgca tcaggaaggc tagagttacc cagagcatca ggccgccaca 2160 0186 agtgcctgct tttaggagac cgaagtccgc agaacctgcc tgtgtcccag cttggaggcc 2220 0187 tggtcctgga actgagccgg ggccctcact ggcctcctcc agggatgatc aacagggcag 2280 0188 tgtggtctcc gaatgtctgg aagctgatgg agctcagaat tccactgt。

43、ca agaaagagca 2340 0189 gtagaggggt gtggctgggc ctgtcaccct ggggccctcc aggtaggccc gttttcacgt 2400 0190 ggagcatggg agccacgacc cttcttaaga catgtatcac tgtagaggga aggaacagag 2460 0191 gccctgggcc cttcctatca gaaggacatg gtgaaggctg ggaacgtgag gagaggcaat 2520 0192 ggccacggcc cattttggct gtagcacatg gcacgttggc tgtg。

44、tggcct tggcccacct 2580 0193 gtgagtttaa agcaaggctt taaatgactt tggagagggt cacaaatcct aaaagaagca 2640 0194 ttgaagtgag gtgtcatgga ttaattgacc cctgtctatg gaattacatg taaaacatta 2700 0195 tcttgtcact gtagtttggt tttatttgaa aacctgacaa aaaaaaagtt ccaggtgtgg 2760 0196 aatatggggg ttatctgtac atcctggggc attaaaaaaa 。

45、aaatcaatgg tggggaacta 2820 0197 taaagaagta acaaaagaag tgacatcttc agcaaataaa ctaggaaatt tttttttctt 2880 0198 ccagtttaga atcagccttg aaacattgat ggaataactc tgtggcatta ttgcattata 2940 0199 taccatttat ctgtattaac tttggaatgt actctgttca atgtttaatg ctgtggttga 3000 0200 tatttcgaaa gctgctttaa aaaaatacat gcatctc。

46、agc gtttttttgt ttttaattgt 3060 0201 atttagttat ggcctataca ctatttgtga gcaaaggtga tcgttttctg tttgagattt 3120 0202 ttatctcttg attcttcaaa agcattctga gaaggtgaga taagccctga gtctcagcta 3180 0203 cctaagaaaa acctggatgt cactggccac tgaggagctt tgtttcaacc aagtcatgtg 3240 0204 catttccacg tcaacagaat tgtttattgt gac。

47、agttata tctgttgtcc ctttgacctt 3300 0205 gtttcttgaa ggtttcctcg tccctgggca attccgcatt taattcatgg tattcaggat 3360 0206 tacatgcatg tttggttaaa cccatgagat tcattcagtt aaaaatccag atggcaaatg 3420 0207 accagcagat tcaaatctat ggtggtttga cctttagaga gttgctttac gtggcctgtt 3480 0208 tcaacacaga cccacccaga gccctcctgc。

48、 cctccttccg cgggggcttt ctcatggctg 3540 0209 tccttcaggg tcttcctgaa atgcagtggt gcttacgctc caccaagaaa gcaggaaacc 3600 0210 tgtggtatga agccagacct ccccggcggg cctcagggaa cagaatgatc agacctttga 3660 0211 atgattctaa tttttaagca aaatattatt ttatgaaagg tttacattgt caaagtgatg 3720 0212 aatatggaat atccaatcct gtgctg。

49、ctat cctgccaaaa tcattttaat ggagtcagtt 3780 0213 tgcagtatgc tccacgtggt aagatcctcc aagctgcttt agaagtaaca atgaagaacg 3840 0214 tggacgtttt taatataaag cctgttttgt cttttgttgt tgttcaaacg ggattcacag 3900 0215 agtatttgaa aaatgtatat atattaagag gtcacggggg ctaattgctg gctggctgcc 3960 0216 ttttgctgtg gggttttgtt acctggtttt aataacagta aatgtgccca gcctcttggc 4020 0217 cccagaactg tacagtattg tggctgcact tgctctaaga gtagttgatg ttgcattttc 4080 0218 cttattgtta aaaacatgtt agaagcaatg。