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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410152878.7 (22)申请日 2014.04.16 (73)专利权人 中国科学院青岛生物能源与过程 研究所 地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 (72)发明人 咸漠杨建明邹慧斌冯红茹 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11419 代理人 何自刚王玉松 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12P 5/02(2006.01) C12R 1/19(200。
2、6.01) (56)对比文件 CN 103571820 A,2014.02.12, 苏思正等.异戊二烯合成酶 （IspS） 在大肠杆 菌中的表达及其产异戊二烯的研究. 生物加工 过程 .2011,第9卷(第3期),第6-10页. Yaru Zhao et al.Biosynthesis of isoprene in Escherichia coli via methylerythritol phosphate(MEP) pathway. Appl microbiol biotechnol .2011,第90卷 (第6期),第1915-1922页. 审查员 许慧娜 (54)发明名称 一种产异戊二。
3、烯基因工程菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种产异戊二烯基因工程菌 及其应用， 属于基因工程技术领域。 本发明通过 将含有乙酰辅酶A酰基转移酶、 3-羟-3甲基戊二 酰辅酶A合酶、 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、 末端 烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因转 化入宿主菌获得重组菌， 并利用重组菌发酵生产 异戊二烯。 本发明所提供的方法大大缩短了大肠 杆菌利用外源MVA途径合成异戊二烯的反应过 程， 由乙酰辅酶A仅需5步反应就可合成异戊二 烯， 避免了由于过多外源基因的表达而导致的对 细胞自身代谢的影响。 同时， 通过对发酵条件的 优化， 发酵产物异戊二烯的产量可达39.49 g/L。 权利。
4、要求书1页 说明书5页 序列表9页 附图4页 CN 104031872 B 2016.08.17 CN 104031872 B 1.一种产异戊二烯的基因工程菌， 其特征在于， 是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转 移酶、 3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、 末端烯烃形成脂肪酸脱羧 酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌； 所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)； 表达乙酰辅酶A酰基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转 移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE如SEQIDNO.1所示； 表达3-羟-3甲基戊二酰辅 酶A合酶的基因是3-。
5、羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS如SEQIDNO.2所示； 表达末端烯 烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT如SEQIDNO.3所示； 表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM如SEQIDNO.4所示。 2.一种利用权利要求1所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法， 其特征在于， 通过化 学合成或克隆获得乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、 3-羟-3甲 基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、 末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因 OhydEM， 构建含有上述基因的重组菌， 再利用重组菌发酵生产异戊二烯。 3.根据权利要求。
6、2所述方法， 其特征在于， 步骤如下： 1)分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因， 3-羟- 3甲基戊二酰辅酶A合酶基因,末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶基因； 2)将步骤1)所得的基因连接到表达载体上， 获得重组质粒； 3)将步骤2)所得的重组质粒转化到宿主菌， 获得重组菌； 4)利用步骤3)所得重组菌， 发酵生产异戊二烯。 4.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤1)中所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基 戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE如SEQIDNO.1所示。 5.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤1)中所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A。
7、合酶 基因mvaS如SEQIDNO.2所示。 6.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤1)中所述末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基 因OleT如SEQIDNO.3所示。 7.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 步骤1)中所述油酸水合酶基因OhydEM如SEQ IDNO.4所示。 8.根据权利要求3所述方法， 其特征在于， 具体步骤如下： 1)分别化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE， 3-羟-3 甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS， 末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因 OhydEM， 并分别与载体pGH连接； 2)将步骤1)所得的含有基因mva。
8、E或基因mvaS的pGH载体与pACYDuet-1载体重组后获得 重组质粒pACY-mvaE-mvaS； 将步骤1)所得的含有基因OleT或基因OhydEM的pGH载体与 pCOLADuet-1载体重组后获得重组质粒pCOLA-OleT-OhydEM； 3)将步骤2)中所得的重组质粒pACY-mvaE-mvaS和pCOLA-OleT-OhydEM转化入大肠杆菌 E.coliBL21(DE3)中， 获得重组菌； 4)利用步骤3)所得重组菌发酵生产异戊二烯。 9.权利要求1的基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104031872 B 2 一种产异戊二烯基因工程菌及。
9、其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种产异戊二烯基因工程菌及其应用， 属于基因工程技术领域。 技术背景 0002 异戊二烯是一种重要的化工平台化合物， 其95用于合成橡胶； 也是丁基橡胶的 第二单体。 此外， 异戊二烯还广泛应用于农药、 医药、 香料及粘结剂等领域。 0003 目前， 异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、 异戊烯脱氢法、 化学合成法 (包括异丁烯-甲醛法、 乙炔-丙酮法、 丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。 然而， 随着化 石资源的日益枯竭， 原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。 0004 生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，。
10、 即甲羟戊酸 (MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。 MVA途径主要存在于真核生物、 古细菌和高等 植物的细胞液中， 而MEP途径存在于植物的质体， 细菌， 藻类。 这两类代谢途径的最终产物都 是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate， DMAPP)， 之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。 0005 利用MVA途径和MEP途径生产异戊二烯的反应分别涉及8和9步反应， 反应涉及过多 的基因。 随着分子生物学技术的发展， 研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。 例如 PiaLindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊。
11、二烯的生产， 取得了50微克/克干细胞/天的 产率(PiaLindberg等， 2009)， 但藻类生长缓慢、 生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶 颈问题。 Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中， 进而利用 工程菌发酵生产异戊二烯(美国专利公开， 2009/0203102)。 该工程菌中获得外源MVA途径时 需要转入多达8个异源基因， 由于过多的异源基因表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱， 影 响细胞的正常生长代谢。 发明内容 0006 为避免代谢途径过长可能导致的细胞自身代谢紊乱的问题， 本发明提出利用可再 生资源葡萄糖为原料， 通过缩短MVA途径。
12、的反应步骤， 完成生物催化剂的制备， 构建了具有 简短的异戊二烯代谢途径的基因工程菌。 本发明所采取的技术方案如下： 0007 一种产异戊二烯的基因工程菌， 是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、 3- 羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、 末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油 酸水合酶的基因得到的重组菌。 0008 所述基因工程菌的宿主菌是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)； 所述表达乙酰辅酶A酰 基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶基因mvaE， GenBank登录序列号为AAG02438； 所述表达3-羟-3甲基戊二。
13、酰辅酶A合酶 的基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS， GenBank登录序列号为AAG02439； 所述表 达末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT， GenBank登 录序列号为ADW41779.1； 所述表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM， GenBank登 说明书 1/5 页 3 CN 104031872 B 3 录序列号为ACT54545.1。 0009 本发明还提供了一种利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法， 是通过化学 合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、 3-羟-3 甲基戊二酰。
14、辅酶A合酶基因mvaS、 末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因 OhydEM， 构建含有上述基因的重组菌， 再利用重组菌发酵生产异戊二烯。 0010 具体地， 本发明利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法步骤如下： 0011 1)分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因， 3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因， 末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶； 0012 2)将步骤1)所得的基因连接到表达载体上， 获得重组质粒； 0013 3)将步骤2)所得的重组质粒转化到宿主菌， 获得重组菌； 0014 4)利用步骤3)所得重组菌， 发酵生产异戊二烯。 。
15、0015 所述方法步骤1)中所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因 mvaE， GenBank登录序列号为AAG02438。 0016 所述方法步骤1)中所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS， GenBank登录序列 号为AAG02439。 0017 所述方法步骤1)中所述末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT， GenBank登录序列 号为ADW41779.1。 0018 所述方法步骤1 )中所述油酸水合酶基因OhydEM， GenBank登录序列号为 ACT54545.1。 0019 所述利用基因工程菌生物合成异戊二烯的方法的具体步骤如下： 0020 1)分别化学合。
16、成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE， 3- 羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS， 末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶 OhydEM， 并分别与载体pGH连接； 0021 2)将步骤1)所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH载体与pACYDuet-1载体重组后 获得重组质粒pACY-mvaE-mvaS； 将步骤1)所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH载体与 pCOLADuet-1载体重组后获得重组质粒pCOLA-OleT-OhydEM； 0022 3)将步骤2)中所得的重组质粒pACY-mvaE-mvaS和pCOLA-OleT-Ohy。
17、dEM转化入大肠 杆菌E.coliBL21(DE3)中， 获得重组菌； 0023 4)利用步骤3)所得重组菌发酵生产异戊二烯。 0024 在本发明的另一方面， 提供了本发明的基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。 0025 本领域技术人员应该理解， 为在重组细胞中更好地表达， 上述各种酶的基因序列 或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根据所用的宿主细胞的 密码子偏好性进行密码子优化。 0026 本领域技术人员还应该理解， 上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同 或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常规分子克隆技术克隆到宿主细胞中。 另外， 这 些核苷酸片段还可以与适当的表。
18、达控制元件(例如， 启动子， 增强子等)可操作地连接。 这些 都在本领域技术人员的能力范围之内。 这些核苷酸片段可操作性连接可以借助于接头也可 以不用接头， 这可以由本领域技术人员根据实际需要进行适当的选择。 0027 本领域技术人员还应该理解， 在选择适当的宿主细胞构建好能够从乙酰辅酶A合 说明书 2/5 页 4 CN 104031872 B 4 成 -或 -蒎烯的重组细胞后， 本领域技术人员能够根据技术常识或经过有限次实验确定合 适的培养条件(例如， 发酵培养的温度、 搅拌速度、 pH值、 溶氧率、 发酵时间等参数)， 也能够 选择合适的诱导剂， 确定加入诱导剂的时机， 等等。 0028 。
19、本发明的有益效果： 本发明所提供的方法大大缩短了大肠杆菌外源MVA途径的反 应过程， 以乙酰辅酶A作为原料合成异戊二烯只需要5步反应， 仅涉及5种酶， 避免了由于过 多外源基因的表达而导致的对细胞自身代谢的影响， 最终在大肠杆菌中构建生物基异戊二 烯合成途径。 提供的生物合成异戊二烯新方法大大缩短了工程大肠杆菌利用外源途径合成 异戊二烯的反应过程， 具有重要的社会意义和有益效果。 附图说明 0029 图1是利用乙酰辅酶A生物合成异戊二烯代谢途径示意图。 0030 图2是pFHR-1质粒图谱。 0031 图3是pFHR-2质粒图谱。 0032 图4是pFHR-3质粒图谱。 0033 图5是异戊二。
20、烯标准品与发酵产物异戊二烯的GC-MS分析图谱。 0034 图6显示IPTG浓度对工程菌产异戊二烯的影响。 0035 图7显示诱导温度对工程菌产异戊二烯的影响。 具体实施方式 0036 下面通过实施例对本发明做进一步说明， 但本发明不受实施例的限制。 0037 通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅 酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE， SEQIDNO.1)， 3-羟-3-甲基戊 二酰辅酶A合酶基因(mvaS， SEQIDNO.2)； 来源于Jeotgalicoccussp.ATCC8456的末端烯 烃形成脂肪酸脱羧酶。
21、基因( OleT ,SEQIDNO .3 )和来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌 (Elizabethkingiameningoseptica)的油酸水合酶基因(OhydEM,SEQIDNO.4)， 利用葡萄 糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成异戊二烯， 缩短了异戊二烯的代谢途径(图1)。 0038 实施例1外源基因的克隆和表达载体的构建 0039 1.外源基因的克隆 0040 1.1粪肠球菌MVA上游代谢途径基因的克隆 0041 来自于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaS基因(GenBankNo.AAG02439)， mvaE基因(GenBankNo.AAG02438)由上海捷。
22、瑞公司通过化学合成方法获得。 之后分别与载 体pGH(购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接获得pGH/mvaS,pGH/mvaE。 0042 1.2OleT,OhydEM基因的克隆 0043 来自于Jeotgalicoccussp.ATCC8456的OleT基因(GenBankNo.ADW41779.1)， Elizabethkingiameningoseptica的OhydEM基因(GenBankNo.ACT54545.1)由上海捷瑞公 司进行化学合成， 分别连入pGH载体上分别形成pGH/OleT,pGH/OhydEM载体。 0044 2表达载体的构建 0045 2.1pFHR-1载体构建 。
23、0046 将pGH-OleT与pCOLADuet-1载体(Novagen)分别用BamH 和Sac 进行双酶切， 载体 说明书 3/5 页 5 CN 104031872 B 5 与外源片段按摩尔比1:5的比例， 4连接过夜或16连接46h， 连接产物转化E.coliDH5 ， 然后涂布加有50mgmL-1卡那霉素的LB固体平板， PCR筛选阳性克隆， 从阳性克隆中提取 重组质粒pFHR-1(pCOLA-OleT， 图2)后， 再通过限制性酶切和测序鉴定。 0047 2.2pFHR-2载体构建 0048 将pCOLA-OleT(pFHR-1)与pGH-OhydEM载体分别用BglII和NdeI进。
24、行双酶切， 载体 与外源片段按摩尔比1:5的比例， 4连接过夜或16连接46h， 连接产物转化E.coliDH5 ， 然后涂布加有50mgmL-1卡那霉素的LB固体平板， PCR筛选阳性克隆， 从阳性克隆中提取 重组质粒pFHR-2(pCOLA-OleT-OhydEM， 图3)后， 再通过限制性酶切和测序鉴定。 0049 2.3pFHR-3载体构建 0050 将pACY-mvaE-mvaS-ispSPa载体(pYJM20， 实验室保存)与pACYDuet-1载体分别用 NcoI和PstI进行双酶切， 载体pACYDuet-1与外源片段mvaE-mvaS按摩尔比1:5的比例， 4连 接过夜或16。
25、连接46h， 连接产物转化E.coliDH5 ， 然后涂布加有34 gmL-1氯霉素的LB 固体平板， PCR筛选阳性克隆， 从阳性克隆中提取重组质粒pYJM3(pACY-mvaE-mvaS， 图4)后， 再通过限制性酶切和测序鉴定。 0051 实施例2重组菌株的构建和发酵培养 0052 将构建好的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中， 通过摇瓶发酵对重组菌进行发酵 培养， 利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和气相色谱(GC)分别对发酵产物进行定性和定量 的检测。 0053 2.1E.coli重组菌株的构建 0054 将pFHR-2(pCOLA-OleT-OhydEM)和pFHR-3(pACY-。
26、mvaE-mvaS)重组质粒共同热击转 化E.coliBL21(DE3)感受态细胞， 涂布于加有氯霉素和卡那霉素的LB固体平板， 通过PCR筛 选获得阳性克隆， 由此获得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大肠杆菌。 0055 2.2工程大肠杆菌的培养 0056 将活化后的工程大肠杆菌按1:100的比例接种到含有氯霉素和卡那霉素的LB液体 培养液中， 37,180rpm条件下振荡培养， 当OD600nm为0.6-0.8时， 在菌液中加入诱导剂IPTG 至终浓度0.5mmolL-1， 然后转入在30， 180rpm条件下， 继续培养。 当工程菌株诱导24h后， 取顶空气体1ml， 利用GC-MS。
27、定性检测。 0057 GC-MS检测条件： GC-MS仪器型号： ThermoGCTraceITQ1110； 分离柱型号： HP- INNOWax30m*0.25mm*0.25um； 离子源： EI； 进样量： 0.2ml； 检测器： ICR； 柱温： 40保温5min， 然后以20/min的速度升温至75， 保温1min， 然后再以20/min的速度升至245， 保温 5min。 0058 GC-MS检测结果如图5所示， 该结果表明： 发酵产物与异戊二烯标准品气相色谱出 峰时间及质谱特征一致， 从而确定发酵产物为异戊二烯。 0059 实施例3不同发酵条件对重组菌产量的影响 0060 不同的发。
28、酵条件， 如诱导温度， 转速， 诱导剂浓度， 氮源， 底物浓度， 培养基pH值及 成分配比等， 会影响发酵产物异戊二烯的产量。 本发明检测了不同的诱导温度， 诱导剂浓度 对异戊二烯产量的影响。 培养方法同实施例2， 利用GC对发酵产物进行定量。 0061 GC检测条件： GC系统采用山东鲁南瑞虹SP-6890型气相色谱仪， 色谱柱为HP- INNOWAXcolumn(25m250 m0.2 m)， 检测器为FID检测器； 气化室温度200， 检测器温度 说明书 4/5 页 6 CN 104031872 B 6 230， 载气流速： 1ml/min。 柱温:50恒温。 0062 3.1E.col。
29、i重组菌株的构建 0063 将pFHR-2(pCOLA-OleT-OhydEM)和pFHR-3(pACY-mvaE-mvaS)重组质粒共同热击转 化E.coliBL21(DE3)感受态细胞， 涂布于加有氯霉素和卡那霉素抗生素的LB固体平板， 通 过PCR筛选获得阳性克隆， 由此获得含有pFHR-2和pFHR-3的工程大肠杆菌。 0064 3.2研究不同IPTG(异丙基- -D-硫代半乳糖苷)浓度对异戊二烯产量的影响 0065 挑取单克隆于5mlLB小瓶中培养活化过夜， 按1接种于100ml含有Cm+Kan抗生素 的液体发酵培养基中， 37振荡培养4h， 当OD600nm0.6-0.8左右， 加。
30、入不同浓度IPTG (0.125mM， 0.25mM， 0.5mM， 0.75mM,1mM,1.125mM,1.25mM)在30条件下进行诱导培养。 培养 48h后取1ml顶空气体进行GC测定。 检测结果如图6所示， 结果表明： IPTG浓度为1mM时， 异戊 二烯产量最高， 为35.43 g/L。 0066 3.3研究不同诱导温度对异戊二烯产量的影响 0067 挑取单克隆于5mlLB小瓶中培养活化过夜， 按1接种于100ml含有Cm+Kan抗生素 的液体发酵培养基中， 37,180rpm条件下振荡培养， 当OD600nm为0.6-0.8时， 在菌液中加入 诱导剂IPTG至终浓度1mmolL-。
31、1， 然后转入不同温度下(25， 28， 30， 34， 37)进行 诱导培养。 培养48h后取1ml顶空气体进行GC测定。 检测结果如图7所示， 结果表明： 诱导温度 为37时， 异戊二烯产量最高， 为39.49 g/L。 0068 应该理解， 尽管参考其示例性的实施方案， 已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解， 在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范 围的条件下， 可以在其中进行各种形式和细节的变化， 可以进行各种实施方案的任意组合。 说明书 5/5 页 7 CN 104031872 B 7 0001 序列表 1/9 页 8 CN 104031872 。
32、B 8 0002 序列表 2/9 页 9 CN 104031872 B 9 0003 序列表 3/9 页 10 CN 104031872 B 10 0004 序列表 4/9 页 11 CN 104031872 B 11 0005 序列表 5/9 页 12 CN 104031872 B 12 0006 序列表 6/9 页 13 CN 104031872 B 13 0007 序列表 7/9 页 14 CN 104031872 B 14 0008 序列表 8/9 页 15 CN 104031872 B 15 0009 序列表 9/9 页 16 CN 104031872 B 16 图1 图2 说明书附图 1/4 页 17 CN 104031872 B 17 图3 图4 说明书附图 2/4 页 18 CN 104031872 B 18 图5 说明书附图 3/4 页 19 CN 104031872 B 19 图6 图7 说明书附图 4/4 页 20 CN 104031872 B 20 。