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1、(10)授权公告号 CN 102071231 B (45)授权公告日 2012.12.12 CN 102071231 B *CN102071231B* (21)申请号 201010567804.1 (22)申请日 2010.11.30 C12P 17/14(2006.01) (73)专利权人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区朝晖六区 专利权人 浙江九洲药业股份有限公司 (72)发明人 欧志敏 沈文和 隋志红 陈庆美 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 王兵 CN 1887880 A,2007.01.03, 全文 . WO 2007。
2、/081065 A1,2007.07.19, 全文 . CN 101230319 A,2008.07.30, 全文 . (54) 发明名称 一种微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋 喃的方法 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 微 生 物 转 化 制 备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法 ： 在 pH 5.0 8.0 的磷酸盐缓冲液中， 以 3- 酮基四氢呋喃为底物、 以酿酒酵母 CGMCC No.2266 发酵获得的含酶菌体 细胞为生物催化剂， 于 25 45下转化反应 8 40 小时， 反应结束后， 转化液经分离纯化得到所 述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃 ； 本。
3、发明有益效果主 要体现在 ： (1) 生产菌株安全无毒， 易于大规模培 养， 成本低廉 ； (2) 操作简便， 反应过程中不需要 添加价格昂贵的辅酶， 收率高 ； (3) 易于实现大规 模工业化生产 ； (4) 反应条件温和， 环境友好。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曹丙洲 权利要求书 2 页 说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 8 页 1/2 页 2 1. 一种微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所述方法是以 3- 酮基四氢呋喃为底物， 以酿酒酵母 （Saccharomyces。
4、 cerevisiae） CGMCCNo.2266 发酵获 得的含酶菌体细胞为生物催化剂， 进行转化反应制得所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 2.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所 述方法为 ： 在pH 5.08.0的磷酸盐缓冲液中， 以3-酮基四氢呋喃为底物， 以酿酒酵母CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂， 于2545下转化反应840小时， 反应结 束后， 转化液经分离纯化得到所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 3.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所 述 3- 。
5、酮基四氢呋喃在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为 110mmol/L。 4.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所 述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为 170g/g 底物。 5.如权利要求2所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所 述磷酸盐缓冲液中还添加有终浓度为 10150g/L 的葡萄糖作为辅助底物。 6.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所 述含酶菌体细胞按照以下方法制备 ： 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 接种至发酵培养基中， 摇 床转速为 150200r/min， 2。
6、635培养 1830h， 将发酵液离心， 制得含酶菌体细胞。 7. 如权利要求 1 所述的微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于 所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃分离纯化方法如下 ： 反应结束后， 将转化液 4000r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在 乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 8. 如权利要求 1 所述的微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于 所述方法按照以下。
7、步骤进行 ：（1） 斜面培养 ： 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 接种到斜面培养 基， 2635培养 46 天得菌体斜面 ；（2） 种子培养 ： 从菌体斜面取一接种环菌体转接到种 子培养基， 2635， 摇床转速为 150200r/min， 培养 1826h 得种子液 ；（3） 发酵培养 ： 取种 子液， 以体积分数 1020% 的接种量接种于发酵培养基中， 培养温度为 2635， 摇床转速为 150200r/min， 培养 1830h， 将发酵液离心， 分离得到所述含酶菌体细胞 ；（4） 生物转化 ： 在 pH 5.08.0 的磷酸盐缓冲液中， 加入终浓度为 110mmol/L 的 。
8、3- 酮基四氢呋喃， 再添加终 浓度为 10150g/L 的葡萄糖作为辅助底物， 以及细胞干重为 3- 酮基四氢呋喃质量 150 倍 的含酶菌体细胞， 于 2545下转化反应 840 小时， 反应结束制得转化液 ；（5） 分离纯化 ： 将转化液于 4000r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分， 抽滤， 滤液减压 蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 9.如权利要求1所述的微生物转化制备S-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法， 其特征在于所 述方法按照以下步。
9、骤进行 ： （1） 斜面培养 ： 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 接种到斜面培养基， 2635培养 46 天得 菌体斜面 ； 所述的斜面培养基终浓度组成为 ： 麦芽汁515g/L， 酵母粉24g/L， 蛋白胨46g/ L， 葡萄糖 712g/L， 琼脂 1525g/L， 自然 pH 值， 溶剂为水 ； （2） 种子培养 ： 从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基， 2635， 摇床转速为 权 利 要 求 书 CN 102071231 B 2 2/2 页 3 150200r/min， 培养 1826h 得种子液 ； 所述的种子培养基终浓度组成为 ： 葡萄糖 2632g/ L， 酵 母 。
10、粉 24g/L， 硫 酸 铵 36g/L， 无 水 MgSO40.20.4g/L， K2HPO43H2O 0.51.5g/L， KH2PO40.61.5g/L， 用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的 pH 值为 7.0， 溶剂为水 ； （3） 发酵培养 ： 取种子液， 以体积比 1020% 的接种量接种于发酵培养基中， 培养温度为 2635， 摇床转速为 150200r/min， 培养 1830h 得到含有含酶菌体细胞的发酵液， 离心分 离得到所述含酶菌体细胞 ； 所述发酵培养基终浓度组成为 ： 葡萄糖 2632g/L， 酵母粉 24g/ L， 硫酸铵 36g/L， 无水 MgSO4。
11、0.20.4g/L， K2HPO43H2O 0.51.5g/L， KH2PO40.61.5g/L， 用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的 pH 值为 7.0， 溶剂为水 ； （4） 生物转化 ： 在 pH 5.08.0 的磷酸盐缓冲液中， 加入 110mmol/L 的 3- 酮基四氢呋 喃， 再添加终浓度 10150g/L 的葡萄糖作为辅助底物， 以及细胞干重为 3- 酮基四氢呋喃 150 倍的含酶菌体细胞， 于 2545下转化反应 840 小时， 反应结束制得转化液 ； （5） 分离纯化 ： 反应结束后将转化液 4000r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液 用等。
12、体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫 酸钠除去水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 权 利 要 求 书 CN 102071231 B 3 1/8 页 4 一种微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 特别涉及一种 以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266为生物催化剂、 以3-酮基四氢呋 喃为底物制备 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的新方。
13、法。 ( 二 ) 背景技术 0002 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃 (S)-(+)-3-Hydroxytetrahydrofuran)， CAS 登录号 ： 86087-23-2， 分子式 C4H8O2， 分子量 88.11。(S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃是合成治疗艾滋病药 物安普那韦的一个重要的中间体。在二苯醚类除草剂农药中引入 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋 喃基团后可以明显提高二苯醚类除草剂的除草活性和选择性。 0003 文献报道中 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的合成可以通过二氢呋喃的不对称硼 氢化或氢硅化得到， 需要手性催化剂， 手性催化剂制备过程繁琐， 价格昂贵 ；。
14、 可以通过 4-氯-3-羰基丁酸酯的不对称氢化-还原-分子内醚化制备， 该方法成本较高， 不适于工业 化生产 ； 可以通过 3- 羟基四氢呋喃消旋体的酶法拆分制备， 酶法拆分的拆分效率最高只能 达到 50， 生产效率较低 ； 可以通过苹果酸的还原 - 分子内醚化合成， 但此方法需要用昂贵 的氢化铝锂来还原苹果酸二酯， 而且需要保护仲羟基以防止消旋。上述的制备方法多数情 况下产物的光学纯度不够， 或者存在着分离提取困难等不利于工业化生产的因素。 0004 采用微生物转化法不对称还原 3- 酮基四氢呋喃可以获得对映体过剩值较高的光 学纯 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃， 常温常压下即可实现转化。
15、， 反应条件温和， 环境友好， 成本 低廉。微生物细胞中含有还原过程中需要的辅酶供氢体， 同时微生物细胞中含有丰富的酶 系有利于通过在反应液中添加廉价的辅助底物 ( 如蔗糖或葡萄糖 ) 实现辅酶的原位再生， 大大提高底物的转化效率， 理论上底物可以 100地转化为 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃。微 生物易于大规模培养， 易于工业化生产。因此， 微生物转化法是制备 (S)-(+)-3- 羟基四氢 呋喃的绿色合成工艺。 ( 三 ) 发明内容 0005 本发明目的是提供一种微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 该方法 催化效率高、 反应条件温和、 环境友好、 成本低廉， 易于。
16、工业化生产。 0006 本发明采用的技术方案是 ： 0007 一种微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 所述方法是以 3- 酮基四氢 呋喃为底物， 以酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266 发酵获得的含酶菌 体细胞为生物催化剂， 进行转化反应制得所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 0008 本发明所述方法在如下条件下进行 ： 在pH 5.08.0的磷酸盐缓冲液中， 以3-酮 基四氢呋喃为底物， 以酿酒酵母CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂， 于 25 45下转化反应 8 40 小时， 反应结束后，。
17、 转化液经分离纯化得到所述 S-(+)-3- 羟 基四氢呋喃。 说 明 书 CN 102071231 B 4 2/8 页 5 0009 所述 3- 酮基四氢呋喃在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为 1 10mmol/L。 0010 所述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为 1 70g/g3- 酮基四氢呋喃底物 ； 所述含 酶菌体细胞干重的测定是将发酵液离心分离后， 弃去上清液， 将湿细胞在 120烘干 48 小 时至恒重， 测定干细胞的重量 ； 取部分发酵液中离心所得湿细胞测定细胞干重， 计算出发酵 液中单位含酶菌体细胞中干细胞比率， 再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体 细胞发酵液用量。 0011。
18、 所述磷酸盐缓冲液中添加有终浓度为 10 150g/L 的葡萄糖作为辅助底物， 有利 于提高底物的摩尔转化率。 0012 所述含酶菌体细胞按照以下方法制备 ： 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 接种至发酵培 养基中， 摇床转速为 150 200r/min， 26 35培养 18 30h， 将发酵液离心， 制得含酶菌 体细胞。 0013 本发明所述 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃分离纯化方法如下 ： 反应结束后， 将转化液 4000r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙 酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分， 。
19、抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙 酸乙酯， 即得所述 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 0014 所述的微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 推荐按照以下步骤进行 ： (1)斜面培养 ： 将酿酒酵母CGMCC No.2266接种到斜面培养基， 2635培养46天得菌 体斜面 ； 所述的斜面培养基终浓度组成为 ： 麦芽汁515g/L， 酵母粉24g/L， 蛋白胨4 6g/L， 葡萄糖 7 12g/L， 琼脂 15 25g/L， 自然 pH 值， 溶剂为水 ； (2) 种子培养 ： 从菌体斜 面取一接种环菌体转接到种子培养基， 26 35， 摇床转速为 150 200r/min， 。
20、培养 18 26h得种子液 ； 所述的种子培养基终浓度组成为 ： 葡萄糖2632g/L， 酵母粉24g/L， 硫酸 铵 3 6g/L， 无水 MgSO40.2 0.4g/L， K2HPO43H2O0.5 1.5g/L， KH2PO40.6 1.5g/L， 用 NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0， 溶剂为水 ； (3)发酵培养 ： 取种子液， 以体积 分数 10 20的接种量接种于发酵培养基中， 培养温度为 26 35， 摇床转速为 150 200r/min， 培养 18 30h， 将发酵液离心， 分离得到含酶菌体细胞 ； 所述发酵培养基终浓度 组成为 ： 葡萄糖 26 32g/。
21、L， 酵母粉 2 4g/L， 硫酸铵 3 6g/L， 无水 MgSO40.2 0.4g/L， K2HPO4 3H2O 0.5 1.5g/L， KH2PO40.6 1.5g/L， 用 NaOH 或 HCl 溶液调整液体培养基的 pH 值为7.0， 溶剂为水 ； (4)生物转化 ： 在pH 5.08.0的磷酸盐缓冲液中， 加入110mmol/L 的 3- 酮基四氢呋喃， 添加 10 150g/L 的葡萄糖作为辅助底物， 以及细胞干重质量为 3- 酮 基四氢呋喃 1 50 倍的含酶菌体细胞， 于 25 45下转化反应 8 40 小时， 反应结束制 得转化液 ； (5) 分离纯化 ： 将转化液 400。
22、0r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等 体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠 除去少量水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 0015 酿酒酵母 CGMCC No.2266， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保 藏中心， 位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内， 保藏号 CGMCC No.2266， 保 藏日期 2007 年 11 月 26 日， 已在先前授权专利 200810059686 中作为新菌株予以保护。 0016 菌株来源 ： 本发明中所述。
23、的微生物菌株酿酒酵母 CGMCC No.2266 是从杭州西湖啤 酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化 3- 酮基四氢呋喃， 得到酿 酒酵母 CGMCC No.2266 具有良好的转化 3- 酮基四氢呋喃生产 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的 说 明 书 CN 102071231 B 5 3/8 页 6 能力。 0017 所述酿酒酵母 CGMCC No.2266 的菌落特征 ： 在琼脂培养基上呈现出乳白色、 有光 泽、 平坦、 边缘整齐、 湿润、 表面光滑， 质地均匀的菌落形态。 0018 具体的， 本发明用微生物转化制备 S-(+)-3- 羟基四氢呋喃的方法， 按照以。
24、下步骤 进行 ： 0019 (1)斜面培养 ： 将酿酒酵母CGMCC No.2266接种到斜面培养基， 2635培养4 6 天得菌体斜面 ； 所述的斜面培养基按如下组成配制 ： 麦芽汁 5 15g/L， 酵母粉 2 4g/ L， 蛋白胨 4 6g/L， 葡萄糖 7 12g/L， 琼脂 15 25g/L， 自然 pH 值， 溶剂为水 ； 121灭菌 20min， 灭菌后冷却制成斜面 ； 0020 (2) 种子培养 ： 从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基， 26 35， 摇床转 速为150200r/min， 培养1826h得种子液 ； 所述的种子培养基按如下组成配制 ： 葡萄糖 2632g/。
25、L， 酵母粉24g/L， 硫酸铵36g/L， 无水MgSO40.20.4g/L， K2HPO4 3H200.5 1.5g/L， KH2PO40.61.5g/L， 用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0， 溶剂为水 ； 0021 (3)发酵培养 ： 取种子液， 以体积比1020的接种量接种于发酵培养基中， 培养 温度为 26 35， 摇床转速为 150 200r/min， 培养 18 30h 得到含有含酶菌体细胞的 发酵液， 离心分离得到所述含酶菌体细胞 ； 所述发酵培养基按如下组成配制 ： 葡萄糖 26 32g/L， 酵母粉 2 4g/L， 硫酸铵 3 6g/L， 无水 MgSO。
26、40.2 0.4g/L， K2HPO43H200.5 1.5g/L， KH2PO40.61.5g/L， 用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0， 溶剂为水 ； 0022 (4) 生物转化 ： 在 pH 5.0 8.0 的磷酸盐缓冲液中， 加入 1 10mmol/L 的 3- 酮 基四氢呋喃， 添加10150g/L的葡萄糖作为辅助底物有利于提高底物的摩尔转化率， 以及 细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃150倍的含酶菌体细胞， 于2545下进行转化反应 8 40 小时 ； 0023 (5) 分离纯化 ： 反应结束后将转化液 4000r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将 上。
27、清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入 无水硫酸钠除去少量水分， 抽滤后， 得到的乙酸乙酯溶液减压蒸馏除去乙酸乙酯即得所述 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃。 0024 本发明 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃纯品可用气相色谱 - 质谱联用仪检测确定产物 的纯度和分子量。 0025 本发明摩尔转化率和产物(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的对映体过剩值(ee)的确 定 ： 0026 采用气相色谱分析检测。色谱柱为 Varian CP Chirasil-DEX 手性柱。该手性柱 可以检测到 (R)-(-)-3- 羟基四氢呋喃和 (S)-(+)-3-。
28、 羟基四氢呋喃两种对映体的含量， 进 一步计算出反应的摩尔转化率和 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的对映体过剩值 (ee )。 0027 本发明中采用微生物细胞不对称还原3-酮基四氢呋喃制备(S)-(+)-3-羟基四氢 呋喃， 可以获得高对映体过剩值的产品， 添加终浓度为 10 150g/L 的葡萄糖作为辅助底 物， 有利于提高底物的摩尔转化率。 0028 与现有技术相比， 本发明有益效果主要体现在 ： 0029 本发明采用的微生物转化法制备 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃与化学合成法、 酶催 化法相比具有以下优点 ： (1) 生产菌株安全无毒， 微生物菌体易于大规模培养， 可以获得大。
29、 说 明 书 CN 102071231 B 6 4/8 页 7 量的生物催化剂， 比化学催化剂成本低廉 ； (2) 操作简便， 反应过程中不需要添加价格昂贵 的辅酶， 通过添加辅助底物葡萄糖可以大幅度提高底物的转化效率， 收率高 ； (3) 易于实现 大规模工业化生产 ； (4) 常温常压下就能实现生物转化反应， 反应条件温和， 环境友好， 是 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的清洁合成工艺。 ( 四 ) 具体实施方式 0030 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0031 斜面培养基的配制 ： 麦芽汁 10g/L， 酵母粉 3g/L， 蛋白胨 。
30、5g/L， 葡萄糖 10g/L， 琼脂 20g/L， 自然 pH 值， 溶剂为水 ； 121灭菌 20min， 冷却后制成斜面。 0032 种子培养和发酵培养基的配制 ： 种子和发酵培养基均采用液体培养基， 按如下组 成配制 ： 葡萄糖 30g/L， 酵母粉 3g/L， 硫酸铵 5g/L， 无水 MgSO40.25g/L， K2HPO43H2O 1g/L， KH2PO41g/L， 溶剂为水， 用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0， 121灭菌20min。 0033 实施例 1 0034 将CGMCC No.2266菌种接种至斜面培养基， 30培养46天得菌体斜面。 用接种 针从。
31、菌体斜面上取一接种环菌体接种在含有100mL液体培养基的250mL三角瓶中， 于30、 180r/min 的条件下培养 24h 获得种子液。将 10mL 种子液 ( 接种量以培养基体积分数 10 计)接种于含有100mL液体培养基的250mL三角瓶中， 于30、 180r/min的条件下培养24h 获得发酵液， 将发酵液离心， 得含酶菌体细胞。 0035 菌体干重的测定是将发酵液离心后从含酶菌体细胞的湿菌体中取小部份在 120 烘干 48 小时至恒重， 测定干细胞的重量， 计算出发酵液中单位含酶菌体细胞中干细胞比 率， 再以这个比率计算定量细胞干重所需含有含酶菌体细胞发酵液用量。本实施例的每升。
32、 发酵液中含有含酶菌体细胞的干重为 50 克。 0036 在 10 份含有 100mL pH7.0 磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述所得 200 毫升 发酵液离心后获得的湿细胞， 其中含有含酶菌体细胞的干重为 10g， 各自加入 3- 酮基四氢 呋喃， 使 3- 酮基四氢呋喃的终浓度分别为 1mmol/L、 2mmol/L、 3mmol/L、 4mmol/L、 5mmol/L、 6mmol/L、 7mmol/L、 8mmol/L、 9mmol/L 和 10mmol/L， 置于 30， 180r/min 的摇床中反应 24h。 反应结束后， 将转化液于4000r/min离心20分钟， 弃去菌体。
33、沉淀， 将上清液用等体积乙酸乙 酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水 分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃， 底物初始浓度 对 S-(+)-3- 羟基丁酸甲酯的摩尔转化率及对映体过剩值 (ee ) 的影响见表 1。 0037 表 1 ： 底物初始浓度对转化率及 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的影响 说 明 书 CN 102071231 B 7 5/8 页 8 0038 0039 表 1 可以看出 ： 随着底物浓度的逐渐增加， 转化率逐渐降低。底物浓度分别为 1 和 2mmol/L 时产物为 。
34、R 构型， 当底物浓度大于等于 3mmol/L 时产物为 S 构型， 说明产物 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的对映体过剩值随着底物浓度的不同有较大变化， 底物浓度加大 有利于提高 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的对映体过剩值。 0040 实施例 2 ： 0041 将CGMCC No.2266菌种接种至斜面培养基， 30培养46天得菌体斜面。 用接种 针从菌体斜面上取一接种环菌体接种在含有100mL液体培养基的250mL三角瓶中， 于30、 180r/min 的条件下培养 24h 获得种子液。将 10mL 种子液 ( 接种量以培养基体积用量 10 计)接种于含有100mL液体培养基的2。
35、50mL三角瓶中， 于30、 180r/min的条件下培养24h 获得发酵液， 发酵液离心， 得含酶菌体细胞， 每升发酵液中含有含酶菌体细胞的干重为 50 克。 0042 在十份各自含有100mL pH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述200毫升发 酵液离心后获得的湿细胞， 其中含有含酶菌体细胞的干重为 10g， 加入终浓度为 5mmol/L 的 3- 酮基四氢呋喃， 加入辅助底物葡萄糖， 使葡萄糖终浓度分别为 10g/L、 30g/L、 50g/L、 70g/ L、 100g/L、 150g/L， 置于30， 180r/min的摇床中反应24h。 反应结束后， 将转化液于4000r/ 。
36、min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯 萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸 乙酯， 即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃， 底物葡萄糖浓度对S-(+)-3-羟基丁酸甲酯的摩 尔转化率及对映体过剩值 (ee ) 的影响见表 2。 0043 表 2 ： 葡萄糖浓度对转化率及 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃对映体过剩值的影响 说 明 书 CN 102071231 B 8 6/8 页 9 0044 0045 表 2 可以看出 ： 葡萄糖的添加有利于提高反应的转化率。葡萄糖的最佳添加。
37、量为 50g/L。葡萄糖的加入有利于实现辅酶的原位再生， 从而提高转化率。产物 (S)-(+)-3- 羟 基四氢呋喃的对映体过剩值随葡萄糖的添加量基本没有变化， 均保持 100。 0046 实施例 3 ： 0047 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 菌种接种至斜面培养基， 30培养 4 6 天得菌体斜 面。用接种针从菌体斜面上取一接种环菌体接种在含有 100mL 液体培养基的 250mL 三角瓶 中， 于 30、 180r/min 的条件下培养 24h 获得种子液。将 10mL 种子液 ( 接种量以培养基体 积用量 10计 ) 接种于含有 100mL 液体培养基的 250mL 三角瓶中，。
38、 于 30、 180r/min 的条 件下培养 24h 获得发酵液， 发酵液离心， 得含酶菌体细胞， 每升发酵液中含有含酶菌体细胞 的干重为 50 克。 0048 在五份各自含有 100mL pH7.0 磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述 200 毫 升发酵液离心后获得的湿细胞， 其中含有含酶菌体细胞的干重为 10g， 各自加入终浓度为 5mmol/L 的 3- 酮基四氢呋喃， 加入终浓度为 50g/L 辅助底物葡萄糖， 均在 180r/min 的摇床 中分别于25、 30、 35、 40、 45下反应24h。 反应结束后， 将转化液于4000r/min离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上。
39、清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯， 即 得所述 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃， 反应温度对 S-(+)-3- 羟基丁酸甲酯的摩尔转化率及对 映体过剩值 (ee ) 的影响见表 3。 0049 表 3 ： 反应温度对转化率及 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃对映体过剩值的影响 0050 0051 表 3 可以看出 ： 反应转化率受到转化温度的影响， 最佳的反应温度为 30。转化 温度过高可以促使酶部分失活， 不利于转化反应获得较高的转化效率。产物 (S)-(+)-3- 羟 基四氢。
40、呋喃的对映体过剩值基本不随转化温度的变化而变化， 均保持 100。 说 明 书 CN 102071231 B 9 7/8 页 10 0052 实施例 4 ： 0053 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 菌种接种至斜面培养基， 30培养 4 6 天得菌体斜 面。 用接种针从菌体斜面取一接种环菌体接种在含有100mL液体培养基的250mL三角瓶中， 于 30、 180r/min 的条件下培养 24h 获得种子液。将 10mL 种子液 ( 接种量以培养基体积 用量 10计 ) 接种于含有 100mL 液体培养基的 250mL 三角瓶中， 于 30、 180r/min 的条件 下培养 24h 获。
41、得发酵液， 发酵液离心， 得含酶菌体细胞， 每升发酵液中含有含酶菌体细胞的 干重为 50 克。 0054 在各五份自含有 100mLpH7.0 磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述 200 毫升 发酵液离心后获得的湿细胞， 其中含有含酶菌体细胞的干重为 10g， 各自加入终浓度为 5mmol/L 的 3- 酮基四氢呋喃， 再各自加入终浓度为 50g/L 辅助底物葡萄糖， 均置于 30， 180r/min 的摇床中分别反应 8h、 16h、 24h、 32h、 40h。反应结束后， 将转化液于 4000r/min 离心 20 分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 合并。
42、乙酸乙酯萃 取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去少量水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙 酯， 即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃， 反应时间对S-(+)-3-羟基丁酸甲酯的摩尔转化率 及对映体过剩值 (ee ) 的影响见表 4。 0055 表 4 ： 反应时间对转化率及 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃对映体过剩值的影响 0056 0057 表 4 可以看出 ： 反应转化率随着反应时间的延长而增高， 最佳的转化时间为 24 小 时， 反应周期较短有利于工业化生产提高生产效率。产物 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃的对映 体过剩值不随反应时间的改变而变化， 对映体过剩值均为。
43、 100。 0058 实施例 5 ： 0059 将酿酒酵母 CGMCC No.2266 菌种接种至斜面培养基， 30培养 4 6 天制得菌体 斜面。用接种针从菌体斜面取一环菌体接种在含有 100mL 液体培养基的 250mL 三角瓶中， 于 30、 180r/min 的条件下培养 24h 获得种子液。将 10mL 种子液 ( 接种量以培养基体积 用量 10计 ) 接种于含有 100mL 液体培养基的 250mL 三角瓶中， 于 30、 180r/min 的条件 下培养 24h 获得发酵液， 发酵液离心， 得含酶菌体细胞， 每升发酵液中含有含酶菌体细胞的 干重为 50 克。 0060 在五份各自。
44、含有 100mL pH7.0 磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述所得 40 毫 升、 100 毫升、 200 毫升、 300 毫升和 400 毫升的发酵液离心后获得的湿细胞， 其中含有含酶 菌体细胞的干重分别为 2g、 5g、 10g、 15g 和 20g。在上述五只三角瓶中分别加入终浓度为 5mmol/L 3-酮基四氢呋喃， 终浓度为50g/L辅助底物葡萄糖， 置于30， 180r/min的摇床中 反应24h。 反应结束后将转化液于4000r/min离心20分钟， 弃去菌体沉淀， 将上清液用等体 说 明 书 CN 102071231 B 10 8/8 页 11 积乙酸乙酯连续萃取 3 次， 。
45、合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除 去少量水分， 抽滤， 滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯， 即得所述 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃， 菌体 量对 S-(+)-3- 羟基丁酸甲酯的摩尔转化率及对映体过剩值 (ee ) 的影响见表 5。 0061 表 5 ： 菌体量对转化率及 (S)-(+)-3- 羟基四氢呋喃对映体过剩值的影响 0062 0063 表 5 可以看出 ： 反应转化率随着菌体量的增多而提高， 菌体量的加大不仅提高了 酶的用量， 同时提高了参与反应的辅酶的用量， 因而有利于提高转化率。 菌体量的加大对产 物的对映体过剩值没有影响， 均保持 100。 说 明 书 CN 102071231 B 11 。