本申请要求于2016年4月4日提交的美国临时申请第62/318,042号的优先权的权益。此类相关临时申请的公开内容在此通过引用以其整体并入本文。
领域
本公开内容涉及对神经肽S受体特异性的化合物，并且该化合物可以用于治疗多种疾病、综合征和状况。本公开内容还涉及用于选择性地调节神经肽S受体的功能以提供能够影响受神经肽受体影响的状况或紊乱的药物疗法的方法、化合物和组合物。
相关领域的描述
神经肽S(NPS)是用于先前的孤儿G蛋白偶联受体GPR154的内源性配体，该孤儿G蛋白偶联受体GPR154现在被称为神经肽S受体(NPSR)。神经肽S是20-氨基酸肽，其通过激活其同源的Gq或Gs偶联的GPCR受体系统而起激动剂的作用。
通过选择性神经肽S受体激活的方式，神经肽S调节若干种生物学功能，包括觉醒、应激和焦虑、运动活动(locomotor activity)、食物摄入、记忆过程和药物滥用。
鉴于据信受NPS影响的生物学活性，本领域正在寻找提供激活NPS的合意效果的化合物和组合物。
概述
本公开内容涉及神经肽S(NPS)受体激动剂。在另一个方面中，本公开内容涉及包含式I或式II的NPSR激动剂和药学上可接受的载体的药物组合物。
神经肽S受体激动剂可以选自根据式I或式II中的一种的神经肽S(NPS)受体激动剂：
其中R1选自H、苯基、苄基、苄氧基、C2-C4芳基烷基、C1-C4烷基环烷基、苯甲酰氨基、多环杂环、或支链的或非支链的C1-C6烷基；
R2选自H、苄基或C2-C4芳基烯基；或者R1和R2组合以形成苯基；条件是R1和R2两者不都是H；
R3是H或赖氨酸侧链；
R4是被一个-C(O)NH2基团取代的五元饱和环或被一个-C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环、被一个-C(O)NH2基团取代的杂环烷基、C1-C3-酰氨基烷基、被一个-C(O)NH2基团取代的桥接的双环状环体系、环状酰亚胺或-CH(Ph)-CH-C(O)NH2，条件是如果R1是苯甲酰氨基，则R4既不是被一个-C(O)NH2基团取代的五元饱和环，也不是被一个-C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环，或R5是C1-C3烷基；
R5是H、C1-C3烷基或苄基；
R1’是苯基；
R2’是苄基；
A、A’和A”独立地选自–NH-或–O-，条件是A、A’和A”中的至少一个是-O-；
R4’是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环，或被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环；
或其药学上可接受的盐。
在另外的方面中，本公开内容涉及用于治疗具有状况或紊乱的受试者的方法，在所述状况或紊乱中，神经肽S受体活性的调节具有治疗益处，所述方法包括向具有或易患所述状况或紊乱的所述受试者施用治疗有效量的根据式I或式II的化合物。
根据随后的描述和所附的权利要求，本公开内容的其他方面、特征和实施方案将是更完全地明显的。
本公开内容的详述以及其优选的实施方案
本公开内容涉及神经肽S受体激动剂。本公开内容的激动剂包括对神经肽S受体呈现出亲和力和在神经肽S受体处呈现出活性的类似物。因此，根据本公开内容的分子可以在治疗通过调节神经肽S受体介导的紊乱、综合征和状况中是有用的。
人类神经肽S(hNPS)是具有一级序列SFRNGVGTGMKKTSFQRAKS(SEQ ID NO:1)的20个残基的肽。对神经肽S受体的结构-功能关系的研究已经示出了，NPS的NH2末端三分之一，特别是残基Phe-2、Arg-3、Asn-4和Val-6对于NPSR的活化是必要的和足够的。Bernier等人，J.Biol.Chem.,281(34):24704-24712(2006)。根据此研究，去除C末端14个残基(肽1-6)对肽的效力具有有限的效果，而去除Ser-1(肽2-20)对功能有害，并且去除前两个(肽3-20)或前三个(肽4-20)NH2末端残基导致基本上无活性的肽。该研究进一步陈述，该结果指示了前六个残基，特别是残基Phe-2、Arg-3、Asn-4和Val-6，是受体活化所必需的，而残基Gly-7被精确地定位，并且可以调节肽的固有活性。
根据另一项研究，hNPS的效果通过片段hNPS-(1-10)模拟，Phe-2、Arg-3和Asn-4对于生物学活性至关重要，并且序列Thr8-Gly9-Met10对于受体活化很重要。Roth等人，J.Biol.Chem.,281(30):20809-20816(2006)。这项研究得出结论，序列1-10是能够活化hNPSR的最小片段，其具有与全长hNPS相似的效力和功效。
鉴于这些研究，其他研究人员已经研究了对较长肽hNPS中各种氨基酸进行改变的效果，包括对人类神经肽S的3位和4位的结构活性研究(Camarda等人，Biog.&Med.Chem.16:8841-8845(2008))，2位(Camarda等人，J.Med Chem.51:655-658(2008))以及5位(Guerrini等人，J.Med.Chem.52:524-529,4068-4071(2009))。
肽作为药物的用途可以受到以下因素的限制，诸如，在胃肠道中和在血清中对蛋白水解的低代谢稳定性、从胃肠道到血液的差的转运以及对中枢神经系统的差的渗透以及其他问题。鉴于使用完整的神经肽S配体作为药物的问题，本公开内容提供了在神经肽S受体处提供活性的小分子化合物。已经出人意料地发现，所公开的NPSR的激动剂对于NPS受体具有有效的效力和选择性，尽管早期的研究表明截短的肽结构将不能激活hNPSR。此外，据信所公开的激动剂以能够实现更有选择性的治疗选项的方式激活信号传导通路，所述治疗选项证实了减少的运动刺激。
根据本公开内容的一个方面，提供了根据式I或式II中的一种的神经肽S(NPS)受体激动剂
其中R1选自H、苯基、苄基、苄氧基、C2-C4芳基烷基、C1-C4烷基环烷基、苯甲酰氨基、多环杂环、或支链的或非支链的C1-C6烷基；
R2选自H、苄基或C2-C4芳基烯基；或者R1和R2组合以形成苯基；条件是R1和R2两者不都是H；
R3是H或赖氨酸侧链；
R4是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环或被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环、被一个C(O)NH2基团取代的杂环烷基、C1-C3-酰氨基烷基、被一个C(O)NH2基团取代的桥接双环状环体系、环状酰亚胺或-CH(Ph)CH-C(O)NH2，条件是如果R1是苯甲酰氨基，则R4既不是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环，也不是被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环，或R5是C1-C3烷基；
R5是H、C1-C3烷基或苄基；
R1’是苯基；
R2’是苄基；
A、A’和A”独立地选自–NH-或–O-，条件是A、A’和A”中的至少一个是-O-；
R4’是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环，或被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环；
或其药学上可接受的盐。
术语在它们被接受的含义内使用。以下定义意图澄清但不限制所定义的术语。
如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一”、和“所述(the)”包括复数指示物。
如本文所使用的，碳数范围的识别，例如在C1-C12烷基中，意图包括这样的范围内的组分碳数部分中的每个，使得涵盖该陈述范围内的每个中间碳数和任何其他陈述的碳数值或中间碳数值，还应当理解，在本发明的范围内，在指定的碳数范围内的碳数的子范围可以被独立地包括在较小的碳数范围内，并且具体地排除一个或更多个碳数的碳数范围被包括在本发明中，并且排除指定范围的碳数极限中的任一个或两者的子范围也被包括在本公开内容中。
因此，C1-C12烷基意图包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基，包括这些类型的直链以及支链基团，诸如异丙基和叔丁基。因此，应当理解，对如广泛适用于取代基部分的碳数范围，例如C1-C12或C1-C6的识别，使得在本公开内容的具体实施方案中，碳数范围能够被进一步限制，作为具有在取代基部分的更宽的规定(specification)内的碳数范围的部分的亚组。举例来说，在本公开的特定实施例中，碳数范围，例如C1-C12烷基，可以被更限制性地指定为涵盖子范围，诸如C1-C4烷基、C2-C8烷基、C2-C4烷基、C3-C5烷基，或者在宽碳数范围内的任何其他子范围。因此，例如，范围C1-C6将包括并且可以由诸如C1-C3、C1-C4、C2-C6、C4-C6等的在更宽的范围内的子范围的规定进一步限制。
“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和的支链、直链或环状烷基基团。
当术语“烷基”或“烯基”与第二基团联合被用作后缀时，如在“芳基烷基”、“羟基烷基”、“环烷基烷基”、“杂环烷基”或“芳基烯基”中，则第二基团经由烷基基团被连接至分子的其余部分。
“环烷基”是指任选地被取代的非芳香族环状烃环。除非另有说明，否则环烷基包括三至八个碳原子。示例性的“环烷基”基团包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。环烷基基团可以被取代或未被取代，例如被卤素或C1-C3烷基取代。
“杂环”是指含有一个或更多个杂原子(例如O、N、S)作为环结构的一部分并且在环中具有二至七个碳原子的饱和的或不饱和的环状基团。在实施方案中，杂环可以与芳基基团诸如苯基稠合。在这样的实施方案中，杂环可以与多于一个芳基基团稠合。多环杂环是指具有多于两个环状环(例如三个环状环)的环状基团。杂环或多环杂环可以被取代或未被取代，例如被卤素、羰基或C1-C3烷基取代。
“杂芳基”是指含有一个或更多个杂原子(例如O、N、S)作为环结构的一部分并且在环中具有二至七个碳原子的不饱和芳香族环状基团。杂芳基基团可以包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基(pyrrolyl)、吡咯并(pyrrolo)、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基以及类似基团。杂芳基基团可以被取代或未被取代，例如被卤素或C1-C3烷基取代。
如本文所使用的“芳基”包括衍生自苯或苯衍生物的烃，其是从6个至10个碳原子的不饱和芳香族碳环基团。芳基可以具有单个或多个环。一个实例是苯基基团。芳基基团可以被取代或未被取代，例如被卤素或C1-C3烷基取代。
“芳基烷基”是指芳基取代的烷基基团。芳基烷基基团包括苄基和苯乙基。
“烷基环烷基”是指环烷基取代的烷基基团。
关于本文阐述的各种说明和其示例，在具体实施方案中，本公开内容的化合物可以通过排除具体的取代基、基团、部分或结构的条件或限制来进一步说明。因此，本公开内容预期限制性地定义的组合物，例如其中R是C1-C12烷基的组合物，条件是当R1是指定的分子组分，并且i是特定的碳数时，R≠Ci烷基。取代基可以以任何方式选择并彼此组合，产生根据式I或式II的化合物。
当存在手性中心时，除非另有说明，否则结构的立体化学包括R构型和S构型两者。
如本文中关于各种所描述的特征、方面和实施方案不同地阐述的本公开内容可以在特定实施方式中被构造为包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：这样的特征、方面和实施方案中的一些或全部，并且其要素和组分被聚集以构成本公开内容的各种另外的实施方式。本公开内容预期以各种排列(permutation)和组合的这样的特征、方面和实施方案是在本公开内容的范围内。因此，本公开内容可以被指定为包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：这些具体的特征、方面和实施方案的任何这样的组合和排列，或其选择的一个或更多个。
在本公开内容的一个方面中，神经肽S受体选自由式I表示的化合物：
其中R1选自H、苯基、苄基、苄氧基、C2-C4芳基烷基、C1-C4烷基环烷基、苯甲酰氨基、多环杂环、或支链的或非支链的C1-C6烷基；R2选自H、苄基或C2-C4芳基烯基；或者R1和R2组合以形成苯基；条件是R1和R2两者不都是H；R3是H、苄基或赖氨酸侧链；R4是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环或被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环、被一个C(O)NH2基团取代的杂环烷基、C1-C3酰氨基烷基、被一个C(O)NH2基团取代的桥接双环状环体系、环状酰亚胺、或-CH(Ph)-CH-C(O)NH2，条件是如果R1是苯甲酰氨基，则R4既不是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环，也不是被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环，或R5是C1-C3烷基；并且R5是H、C1-C3烷基、或苄基；或其药学上可接受的盐。
在非限制性实施方案中，芳基和杂环未被取代，或者，如果已经被取代，则未被进一步取代。在其他非限制性实施方案中，杂环是包括氮的五元环或六元环。举例来说，杂环可以经由杂环基团中的氮被连接至烷基链。进一步举例来说，杂环烷基基团中的烷基是C1-C3烷基。
在其他非限制性实施方案中，R1是苯基、苄基、苄氧基或苯乙基；R2是苄基；并且R4是被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环。在这样的实施方案中，R3和R5可以是H。
在其他非限制性实施方案中，R1是苯基或苄基并且R2是苄基。
在其他非限制性实施方案中，R1是苯甲酰氨基，R2是苄基，R4是C1-C3酰氨基烷基，更优选地甲酰胺基团，诸如-CH(CH2)CH2C(O)NH2，或-CH(Ph)-CH-C(O)NH2；并且R5是H或苄基。
在其他非限制性实施方案中，R1是苯甲酰氨基，R2是苄基，R4是被一个C(O)NH2取代的六元饱和环(即环己烷)，并且R5是甲基。在这样的实施方案中，R3可以是H。
在其他非限制性实施方案中，R1是H或苯乙基，R2是C1-C3芳基烯基，并且R4是被一个C(O)NH2取代的六元饱和环。
在其他非限制性实施方案中，R1是C1-C4烷基环烷基，更优选地CH2CH2-环己基，或支链的或非支链的C1-C6烷基，更优选地异戊基，R2是苄基并且R4是被一个C(O)NH2取代的六元饱和环。在这样的实施方案中，R3和R5可以是H。
在其他非限制性实施方案中，R1是苯乙基，R2是苄基，R3是H或赖氨酸侧链，并且R4是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环(即环戊烷)或被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环、被一个C(O)NH2基团取代的杂环烷基或被一个C(O)NH2基团取代的桥接双环状环体系。举例来说，双环状环体系可以是双环[2.2.2]辛烷或双环[2.2.1]庚烷。
在非限制性实施方案中，环状酰亚胺是琥珀酰亚氨基。
在其它非限制性实施方案中，多环杂环是与芳基基团稠合的杂环。在某些实施方案中，多环杂环由下式表示：
式I的代表性神经肽S受体激动剂包括以下：
在本公开内容的另一个方面中，神经肽S受体选自由式II表示的化合物：
其中R1’是苯基；
R2’是苄基；
A、A’和A”独立地选自-NH-或-O-，条件是A、A’和A”中的至少一个是-O-；
R3是H、苄基或赖氨酸侧链；
R4’是被一个C(O)NH2基团取代的五元饱和环或者被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环或芳香族环；
或其药学上可接受的盐。
在非限制性实施方案中，式II的R4’是被一个C(O)NH2基团取代的六元饱和环(即环己烷)。
式II的代表性神经肽S受体激动剂包括以下：
本公开内容的化合物对NPS受体具有完全和部分激动剂活性。EC50值在从14nM-3544nM的范围内。
神经肽S受体具有至少有三种已知的同工型(isoform)，包括野生型NPS Asn107、NPS Asn107Ile以及NPS C-Alt。由于每种变体可以潜在地具有功能性差异，因此评估了每种同工型的激动剂敏感性。[125I]Tyr10-NPS的放射性配体结合在受体变体中没有改变；然而，与Asn107相比，对于Ile107变体，观察到使用钙通量的5-10倍的功能性敏感性的增强。在功能性测定中，hNPS在NPSR-C-Alt处效力最低(相对于107I变体低30倍)。
原位杂交已经示出NPS受体mRNA在整个CNS中被广泛地表达。特别是，在丘脑、下丘脑、皮质、海马体和杏仁体中识别出高水平的NPS受体mRNA。然而，人类NPS前体mRNA主要在脑干的蓝斑(LC)中表达，并且在与氨基酸Arg Lys相邻的特定裂解位点从89AA信号肽被裂解。由于在LC中的mRNA定位(localization)，NPS被假设在唤醒、焦虑或两者中起作用。NPS的唤醒和抗焦虑促进性质后来已经使用应激诱导的体温过低被确认。鉴于这些性质，NPS受体系统可以用作用于非镇静抗焦虑药的靶标。
其他研究已经发现了关于NPS在睡眠-觉醒周期中发挥的作用的证据，并且发现了正常就寝时间和NPS N107I SNP之间的特定关联。因此，NPS药物疗法可以有益于患有失眠或嗜睡症的患者。
NPSR mRNA在已知用于调节学习和记忆的海马区域(诸如梨状内皮质/梨状内核(endopiriform cortex/nucleus)和下托(subiculum))中以非常高的水平表达。因此，NPS可以涉及记忆和记忆的巩固。NPS施用剂量依赖性地改进了新识别测定中的表现，证实了在记忆中的生化作用。
除了厌恶性记忆的巩固的同时减少，NPS还涉及急性抗焦虑样效果的诱导。与抑制恐惧学习相反，NPS被发现参与缓解恐惧表达。因此，已经发现NPS受体的激活在减轻焦虑方面具有双重作用。除了NPS对焦虑具有的急性效果之外，已经识别了更重要的促进厌恶性记忆的消失的作用。因此，本公开内容的NPS激动剂化合物和组合物可以用于有效地治疗焦虑和焦虑相关紊乱，诸如创伤后应激障碍(PTSD)。
在本公开内容的一个方面中，提供了治疗由神经肽S受体调节的各种紊乱和状况的方法。本公开内容的NPS受体激动剂可以对于物质滥用(substance abuse)、嗜睡症、失眠、肥胖、认知减退、痴呆症、阿尔茨海默病、惊恐障碍(panic disorder)、广泛性焦虑症、PTSD、恐惧症、精神分裂症是有用的，并且作为在认知行为疗法中任何类型的停止方案期间的支持药物可以是有用的，举例来说，诸如药物成瘾、进食紊乱和赌博。
术语“有效量”意指将引发组织、系统、动物或人类的例如由研究者或临床医生正在寻求的生物学或医学应答的药物或药剂的量。术语“治疗有效量”意指与未接受这样的量的相应受试者相比，导致疾病、紊乱或副作用的改进的治疗、愈合、预防或改善，或者疾病或紊乱的进展速率的降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
在本公开内容的一个方面中，本公开内容的化合物和组合物可以与其他药物或剂组合使用，或者与多种心理疗法联合使用，所述心理疗法可用于治疗由NPS受体调节的状况和紊乱类型。可以与本公开内容的化合物和组合物一起使用的药物或剂可以包括典型的和/或非典型的抗精神病药物，诸如氟哌啶醇和阿立哌唑或单胺再摄取抑制剂，诸如氟西汀和舍曲林。
在本公开内容的另一个方面中，提供了用于治疗具有状况或紊乱的受试者的方法，在所述状况或紊乱中，神经肽S受体活性的调节具有治疗益处，所述方法包括向具有或易患所述状况或紊乱的所述受试者施用有效量的化合物，所述化合物证实了对于神经肽S受体的选择性结合并呈现出对神经肽S受体的功能性激动剂活性。
在本公开内容的一个方面中，提供了用于治疗具有状况或紊乱的受试者的方法，在所述状况或紊乱中，神经肽S受体活性的调节具有治疗益处，所述方法包括向具有或易患所述状况或紊乱的所述受试者施用有效量的根据式I或式II中的一种的化合物，所述化合物证实了在神经肽S受体处的选择性结合和功能性激动剂活性。NPS受体选择性可以基于在所指示的受体处的结合亲和力或其在NPS功能性测定中的选择性来确定。
在实施方案中，施用的化合物是前述式的任何化合物的药学上可接受的盐。在这方面，式I或式II的任何化合物可以与药学上可接受的载体组合。
本公开内容的化合物的盐可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。酸可以是无机酸或有机酸。合适的酸包括例如盐酸、氢碘酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乙酸和甲酸。
可以使用多种施用技术，其中包括口服、透皮或肠胃外技术，诸如皮下、静脉内、腹膜内、脑内和侧脑室注射、导管插入以及类似技术。这样的施用方法对本领域技术人员是熟知的。关于药物递送系统和施用模式的一般性讨论，参见Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第四版，第8卷，第445-475页。
化合物的平均量可以根据化合物的结合性质(即结合的亲和力、开始和持续时间)而变化，并且特别地应该基于有资质的医师的建议和处方。
在实践本公开内容的治疗方法中有用的治疗组合物可以包括掺合的药学上可接受的赋形剂(载体)和作为活性成分的如本文所述的一种或更多种本公开内容的化合物。
本公开内容的NPS受体激动剂可以通过多种方法施用。因此，通过口服途径具有活性的本发明的那些产品可以以溶液、悬浮液、乳剂、片剂(包括舌下片剂和颊内片剂)、软明胶胶囊(包括在软明胶胶囊中使用的溶液)、含水悬浮液或油悬浮液、乳剂、丸剂、锭剂(lozenge)、锭剂(troche)、片剂、糖浆或酏剂以及类似形式施用。在肠胃外施用时有活性的本发明的产品可以通过储库注射、包括SilasticTM和可生物降解植入物的植入物、皮肤贴剂、皮肤霜剂或肌肉内和静脉内注射施用。
组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且这样的组合物可以包含选自由甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂组成的组的一种或更多种剂。包含与适合于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂掺合的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可以为，例如，惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，诸如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，诸如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术被包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸附，并且从而在较长的时间段内提供持续作用。例如，可以使用延时材料诸如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊或作为软明胶胶囊来呈现，在硬明胶胶囊中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，在软明胶胶囊中活性成分与水或油介质，诸如花生油(peanut oil)、液体石蜡或橄榄油混合。
本公开内容的含水悬浮液包含与适合于制造含水悬浮液的赋形剂掺合的活性材料。这样的赋形剂包括悬浮剂，诸如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；以及分散剂或润湿剂诸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如十七亚乙基氧基鲸蜡醇)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。含水悬液还可以包含一种或更多种防腐剂诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或更多种着色剂、一种或更多种调味剂、和一种或更多种甜味剂诸如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。如本领域已知的，眼用制剂将关于渗透压进行调节。
油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油，诸如，花生油(arachis oil)、橄榄油、芝麻油或椰子油中或者悬浮在矿物油诸如液体石蜡中来配制。油悬浮液可以包含增稠剂，诸如，蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。
本公开内容的适合于通过添加水来制备含水悬浮液的可分散粉末和颗粒可以由与分散剂、悬浮剂和/或润湿剂以及一种或更多种防腐剂掺合的活性成分来配制。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上文公开的那些例示。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开内容的药物组合物还可以呈水包油乳剂的形式。油性相可以为植物油，诸如橄榄油或花生油，矿物油，诸如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶诸如阿拉伯树胶和黄蓍胶、天然存在的磷脂诸如大豆卵磷酯、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯诸如脱水山梨糖醇单油酸酯、以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂诸如甘油、山梨糖醇或蔗糖来配制。这样的制剂还可以包含缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂或着色剂。
本公开内容的药物组合物可以呈无菌可注射制剂的形式，诸如无菌可注射含水悬浮液或含油悬浮液。该悬浮液可以使用上文已经提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知技术来配制。无菌可注射制剂也可以是在非毒性的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，诸如1,3-丁二醇的溶液。可以被采用的可接受的媒介物(vehicle)和溶剂是水和Ringer’s溶液、等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常可以被用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可以类似地用于制备注射剂。灭菌可以通过本领域普通技术人员已知的常规方法来进行，诸如例如通过无菌过滤或辐照。
含水制剂(即水包油乳剂、糖浆、酏剂和可注射制剂)可以被配制成达到最佳稳定性的pH。最佳pH的确定可以通过本领域普通技术人员已知的常规方法来进行。合适的缓冲液也可以用于保持制剂的pH。
本公开内容的化合物还可以以用于直肠施用药物的栓剂的形式施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述非刺激性赋形剂在常温为固体但在直肠温度为液体，并且因此将在直肠中熔化以释放药物。这样的材料的非限制性实例是可可脂和聚乙二醇。
它们也可以通过鼻内、眼内、阴道内和直肠内途径施用，包括栓剂、吹入剂、粉末和气雾剂制剂。
优选地通过局部途径施用的本公开内容的产品可以作为涂抹棒(applicator stick)、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、霜剂、软膏剂、糊剂、胶冻、涂料、粉末和气雾剂施用。
参考以下实施例来进一步例证本公开内容的优点和特征，所述实施例不被解释为以任何方式限制本公开内容的范围，而是被解释为在其特定的应用中例证本公开内容的一个实施方案。
实施例：
方案1：反式2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-644)的合成
方案1：试剂和条件：(a)丙烯酸甲酯、DABCO、MeOH、0℃、48小时、87％；(b)乙酰氯、吡啶、0℃、1.5h；92％(c)苄基氯化镁(1M醚溶液)、二乙醚、-40℃至-5℃、3h；77％(d)10％Pd/C、MeOH、45psi、4小时、94％；(e)LiOH、MeOH、THF、H2O、rt、3h；(f)甘氨酸叔丁酯盐酸盐、BOP、Et3N、rt、3h、76％；(g)TFA、CH2Cl2、rt、4h；76％；(h)乙基反式-2-氨基-1-环己烷、EDC.HCl、CH2Cl2、rt、16h、60％；(i)LiOH、THF、MeOH、H2O、rt、3h；28％；(j)在THF中的0.5M NH3、BOP、Et3N、rt、3h、76％。
方案2.R06039-641中间体的合成。
方案2：试剂和条件：(a)苄基溴、Ag2O、CH3CN、60℃、16h、65％；(b)6N HCl、1,4-二噁烷、60℃、24h；58％
实验部分：
用于氨基酸和肽名称的缩写遵循在J.Biol.Chem.1972,247,977-983中的IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature的规则。除非另有说明，否则氨基酸符号表示L-构型。使用以下另外的缩写：aq，含水；Boc，叔丁氧基羰基；tBu，叔丁基；DCM，二氯甲烷；DIEA，N,N-二异丙基乙胺；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；Fmoc，9-芴甲氧基羰基；ESI MS，电子喷雾电离质谱法；equiv，当量；Fmoc-反式-ACHC，Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸；ELSD，电子光散射ESI-MS电子喷雾质谱法；h，小时；HOBt，N-羟基苯并三唑；HBTU，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；meq，摩尔当量；Mtt，单甲氧基三苯基甲基；NMR，核磁共振光谱法；RP-HPLC，反相高效液相色谱法；rt，室温；TFA，三氟乙酸；TFE，三氟乙醇；TIPS，三异丙基硅烷；Trt，三苯基甲基(三苯甲基(trityl))；tR，保留时间。
一般：所有标准试剂都是可商购的。化合物在Agilent-Varian HPLC系统上通过HPLC纯化，所述系统配备有Prostar 210双泵、Prostar 335二极管UV检测器和SEDEX75(SEDERE，Olivet，France)ELSD检测器。HPLC溶剂体系是二元的，含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水和溶剂B(含有5％水和0.1％TFA的乙腈)。半制备型Synergy RP 80A C18柱(4μm 250x21.2mm柱；Phenomenex)被用于以15mL/min纯化最终化合物，在20分钟内使用从5％到50％B的线性梯度。在220nm处监测吸收度。在20分钟内，在5％-95％溶剂B的线性梯度的情况下，以1mL/min的流速，使用分析型Synergy RP80A C18(4μm 250x 4.60mm柱；Phenomenex)来确定最终化合物的纯度。在220nm处监测吸收度。使用来自Perkin Elmer(San Jose,California)的PE Sciex API 150EX LC/MS系统来确定最终化合物的分子离子。1H NMR谱在Bruker Avance 300Spectrospin仪器上以300MHz记录，并报告如下：以ppm计的化学位移d(多重性、偶合常数(Hz)和积分)。下列缩写被用来解释多重性：s＝单峰，d＝双峰；m＝多重峰，br＝宽峰，dd＝双峰的双峰。
合成.材料.Nα-Fmoc保护的氨基酸、HBTU和HOBt购自AAPPTEC(Louisville，KY)和Chem-Impex International Inc.(Wooddale，IL)。三苯甲基树脂购自AnaSpec(Fremont，CA)。Rink树脂购自Chem-Impex(Wood Dale，IL)。肽合成溶剂、试剂以及用于HPLC的CH3CN从商业来源获得，并且被使用而无需进一步纯化。经由肽合成器(AAPPTEC Focus XC，AAPPTEC)，部分地或完全地在固相树脂法上以分步的方式进行NPS类似物的合成。在DIEA(在NMP中的2M)的存在下，经由肽偶联将Nα-Fmoc-AA1-OH(AA1：Fmoc-反式-ACHC、Nα-Fmoc-(S)-氰基丙氨酸、Nα-Fmoc-(S)-β-四唑丙氨酸、Nα-Fmoc-Nε-Boc-(S)-赖氨酸或Nβ-Fmoc-(S)-3-氨基-3-苯基丙酸)偶联至Rink树脂(0.52meq/g)或偶联至三苯甲基树脂(0.1g，0.9meq/g)持续90分钟。然后逐步添加下列保护的氨基酸Nα-Fmoc-AA2-OH(AA2：Fmoc-Gly-OH、Nα-Fmoc-Nε-Boc-(S)-赖氨酸、Nα-Fmoc-Nε-Mtt-(S)-赖氨酸或Nα-Fmoc-Phe-OH)。在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下，使用3倍过量的氨基酸与HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)完成每个偶联反应。通过用在DMF中的20％的哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。
肽树脂用DMF洗涤三次，并且以分步方式开始下一个偶联步骤。所有反应在N2气氛下进行。用DMF(3x)洗涤肽树脂，并且在每个偶联步骤后重复脱保护方案。如上所述去除N-末端Fmoc基团，用DMF(3x)和DCM(3x)洗涤树脂，并且用乙酸/TFE/DCM(1:1:8，10mL)在20分钟内、或用TFA/TIPS/H2O(95:2.5:2.5)在1.5h内、或用TFA/DCM(1:1，5ml)在0.5h内从树脂中释放肽。通过过滤去除树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀来回收粗制肽，以给出白色粉末，所述白色粉末被粗制地使用或通过半制备型RP-HPLC使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(除非另有说明，否则在30分钟内从5％到90％)以15.0mL/min的流速来纯化所述白色粉末。通过冻干适当的HPLC级分来获得产物。分析型RP-HPLC指示>90％的纯度，并且通过ESI-MS确认分子量。
R06039-584的合成
N-((S)-1-((S)-6-氨基-1-((R)-3-甲基哌嗪-1-基)-1-氧代己-2-基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)苯甲酰胺TFA盐(R06039-584)
在DIEA(在NMP中的2M)的情况下，使用AAPPTEC Focus肽合成器将Nα-Fmoc-Nε-Boc-(S)-赖氨酸偶联至三苯甲基树脂(200mg，0.9meq/g)持续90分钟。树脂上的氨基酸用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％的哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下，在氮气气氛下，使用3倍过量的氨基酸与HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内添加Nα-Fmoc-Phe-OH。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次并且然后在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内与苯甲酸(3倍当量)偶联。肽树脂用DMF(3x)和DCM(3x)洗涤，并且用乙酸/TFE/DCM(1:1:8，10mL)在1h内从树脂中释放肽。通过过滤去除树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀来回收粗制肽，以提供作为白色粉末的(3S,6S)-3-苄基-14,14-二甲基-1,4,12-三氧代-1-苯基-13-氧杂-2,5,11-三氮杂十五烷-6-羧酸(苯甲酰基-(S)-苯丙氨酸(phenylalanine)-Nε-Boc-(S)-赖氨酸)TFA盐(苯甲酰基-(S)-苯丙氨酸-Nε-Boc-(S)-赖氨酸，89mg,93％)。该材料在没有进一步纯化的情况下被用于随后的溶液相偶联中。
向(3S,6S)-3-苄基-14,14-二甲基-1,4,12-三氧代-1-苯基-13-氧杂-2,5,11-三氮杂十五烷-6-羧酸TFA盐(苯甲酰基-(S)-苯丙氨酸-Nε-Boc-(S)-赖氨酸)，50mg，0.1mmol)、HBTU(57mg，0.15mmol)、HOBt(23mg，0.15mmol)和(R)-Boc-2-甲基哌嗪(40mg，0.2mmol)的溶液中添加DIPEA(70mL，0.4mmol)，并且反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物浓缩，再溶解在甲醇(2ml)中，并且冷却至0℃。添加在二乙醚中的HCl的1N溶液(1.5mL，1.5mmol)，反应混合物在室温搅拌过夜并浓缩至干。使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(在20分钟内从5％到90％)，以15.0mL/min的流速，通过半制备型RP-HPLC来纯化残余物。期望的产物作为TFA盐获得(R06039-584：13.3mg，28％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 1.12-1.42(m,5H)1.43-1.77(m,6H)2.76(d,J＝7.54Hz,1H)2.89-3.15(m,3H)3.18-3.39(m,2H)3.91(d,J＝16.20Hz,1H)4.15(d,J＝12.81Hz,2H)4.40(d,J＝12.06Hz,1H)4.69(d,J＝10.55Hz,2H)7.11-7.57(m,8H)7.69(br.s.,2H)7.73-7.84(m,2H)8.47(br.s.,1H)8.59(dd,J＝13.37,8.10Hz,1H)8.88(br.s.,1H)9.11(br.s.,1H)；ESI MS m/z：对C27H37N5O3计算为479.61实测480.4(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝11.89min(>99.9％)。
R06039-636(1S,2S)-2-羟基环己烷甲酰胺的合成
将(1R,2S)-2-羟基环己烷甲腈(250mg，2mmol)放置在浓盐酸(4mL)中，并且在55℃搅拌持续2.5小时。允许混合物冷却至室温，并且然后冷却至0℃。添加氢氧化钠溶液(10N，3.5mL)，随后添加饱和碳酸氢钠溶液以将溶液的pH调节至8-9。然后用二氯甲烷/THF(70:30)的混合物提取溶液若干次。合并有机层，并且在减压下除去溶剂。将残余物吸收到二氯甲烷/THF(70:30)的混合物中，搅拌持续30分钟并过滤。滤液经硫酸钠干燥并且在减压下除去溶剂。将残余物真空干燥，以给出作为白色固体的(1S,2S)-2-羟基环己烷甲酰胺，其被使用而无需进一步纯化(166mg，58.0％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.11-1.57(m,4H)1.64-1.82(m,2H)1.87(d,J＝13.00Hz,1H)1.93-2.06(m,1H)2.07-2.22(m,1H)3.54-3.78(m,1H)4.46-4.79(m,1H)。
(1S,2S)-2-氨基甲酰基环己基-2-[(2S)-3-苯基-2-(苯基甲酰氨基)丙酰氨基]乙酸酯(R06039-636)
将N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酰甘氨酸(95mg；0.291mmol)、(1S,2S)-2-羟基环己烷甲酰胺(34mg，0.237mmol)和DCC(60mg，0.291mmol)溶解在二氯甲烷(5ml)中，并且将混合物在冰浴中冷却至0℃。添加DMAP(30mg，0.246mmol)，并且混合物在0℃搅拌持续1小时。允许溶液加温至室温并搅拌过夜。过滤溶液，并且随后用醚/二氯甲烷(50/50)充分洗涤沉淀物，并且真空干燥以给出白色固体(16mg)。从滤液中除去溶剂，并且将残余物溶解在二氯甲烷中。然后用0.1N HCl洗涤溶液，并且经硫酸钠干燥有机层。在减压下除去溶剂，并且通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，THF)来纯化残余物。然后将纯化的材料溶解在二氯甲烷中并用己烷沉淀。将产生的固体真空干燥，以给出R06039-636(33mg；总共49mg；45.7％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 0.99-1.49(m,4H)1.53-1.73(m,2H)1.80(d,J＝11.11Hz,1H)1.95(d,J＝9.04Hz,1H)2.21-2.39(m,1H)2.92-3.07(m,1H)3.08-3.22(m,1H)3.64-3.96(m,2H)4.65-4.89(m,2H)6.78(s,1H)7.09-7.20(m,1H)7.21-7.30(m,2H)7.31-7.55(m,6H)7.72-7.84(m,2H)8.51(t,J＝5.84Hz,1H)8.62(d,J＝8.48Hz,1H)。ESI MS m/z：对C25H29N5O3计算为451.51，实测452.5(M+H)+。
(S)-1-(2-((1R/S,2S/R)-2-氨基甲酰基环己基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基苯甲酸酯(R06039-637)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，经由肽偶联将Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。Rink树脂(130mg)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。然后逐步添加下列保护的氨基酸Nα-Fmoc-AA2-OH(AA2：Nα-Fmoc-Gly-OH,Nα-Fmoc-Phe-OH)。在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下在45分钟内用3倍过量的氨基酸与HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)完成每个偶联反应。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次，并且通过在氮气气氛下用CH2Cl2摇动(3×10min)进行调节。将苯甲酰氯(178mL，1.53mmol)和NEt3(428mL，3.07mmol)依次添加到在CH2Cl2(10mL)中的上述氨基酸树脂的悬浮液中。将混合物在氮气气氛下摇动持续2h。肽树脂用DCM(3x)洗涤，并且用TFA/DCM(1:1，10mL)在0.5h内从树脂中释放肽。通过过滤除去树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀来回收粗制肽，并且使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(在30分钟内从5％到95％)以15.0mL/min的流速，通过半制备型RP-HPLC来纯化所述粗制肽。期望的产物(R06039-637)作为TFA盐作为白色固体获得(6.7mg，19％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 0.95-1.51(m,6H)1.64(d,J＝9.80Hz,2H)1.77(d,J＝11.30Hz,2H)2.03-2.22(m,1H)3.02-3.31(m,2H)3.53-3.88(m,3H)5.31-5.46(m,1H)6.71(br.s.,1H)7.01(d,J＝7.91Hz,1H)7.16-7.45(m,4H)7.46-7.71(m,4H)7.89-7.99(m,1H)8.46(dt,J＝14.03,5.42Hz,1H)；ESI MS m/z：对C25H29N3O5计算为451.52，实测452.4(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝16.64min(>90％)。
R06039-639的合成
2-叔丁氧基-2-氧代乙基N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酸酯.将N-苯甲酰基-L-苯丙氨酸(500mg，1.86mmol)放置在乙酸乙酯(20mL)中，添加三乙胺(197mg，1.95mmol)，并且将混合物搅拌持续10分钟。添加溴乙酸叔丁酯(234mg，1.20mmol)，并且搅拌混合物持续42小时。在该时间结束时，通过过滤除去固体并用醚(50mL)洗涤。合并滤液，用饱和氯化钠洗涤，并且在减压下除去溶剂。将残余物真空干燥，以给出作为白色固体的2-叔丁氧基-2-氧代乙基N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酸酯(386mg，83.9％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.49(s,9H)3.28(d,J＝6.22Hz,1H)3.39(d,J＝5.65Hz,1H)4.46-4.73(m,2H)5.17(d,J＝7.72Hz,1H)6.43-6.60(m,1H)7.16-7.35(m,5H)7.35-7.56(m,3H)7.63-7.74(m,2H)。
{[N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酰基]氧基}乙酸.将2-叔丁氧基-2-氧代乙基N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酸酯(330mg，0.861mmol)放置在干燥的二氯甲烷(16mL)中，添加TFA(4mL)，并且混合物在室温搅拌持续2.5小时。在该时间结束时，蒸发溶剂，并且将残余物用二氯甲烷追赶(chase)3次。将产生的固体真空干燥，以给出作为无色树脂的{[N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酰基]氧基}乙酸(245mg，86.9％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 3.13-3.48(m,2H)4.59-4.87(m,2H)5.17(q,J＝6.72Hz,1H)6.90(d,J＝7.72Hz,1H)7.13-7.32(m,4H)7.32-7.42(m,2H)7.43-7.54(m,1H)7.62(d,J＝7.35Hz,2H)10.58(br.s.,2H)。
[(2-氨基甲酰基环己基)氨基甲酰基]甲基-(2S)-3-苯基-2-(苯基甲酰氨基)丙酸酯(R06039-639)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，最初经由肽偶联将Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。产生的Rink树脂(130mg，0.0767mmol)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％的哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。然后，在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内将树脂与{[N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酰基]氧基}乙酸(200mg，0.611mmol)偶联。然后用二氯甲烷(3x)和甲醇(3x)洗涤肽树脂，并且通过与TFA/二氯甲烷(1:2，18mL)的混合物一起搅拌持续1.5小时从树脂中释放肽。过滤树脂混合物，并且在真空下从滤液中除去溶剂。滤液残余物用二氯甲烷追赶若干次，并且然后通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，98％ETOAC/2％甲醇)纯化，以给出作为TFA盐的R06039-639(12.3mg；28.3％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.11-1.45(m,5H)1.55(d,J＝12.62Hz,1H)1.76(d,J＝10.55Hz,2H)1.90(br.s.,2H)2.41(d,J＝10.93Hz,1H)3.12-3.43(m,2H)3.96(br.s.,1H)4.31-4.48(m,1H)4.54-4.83(m,2H)7.11-7.36(m,5H)7.38-7.61(m,3H)7.66-7.88(m,2H)。ESI MS m/z：对C25H29N5O3计算为451.51，实测452.5(M+H)+。
R06039-641的合成
将(S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酸苄酯(15)将L-(-)-3-苯基乙酸(14)(1g，6.02mmol)溶解在20mL的干乙腈中。向其中添加Ag2O(5.6g,24.07mmol)、分子筛(0.5g)，随后在室温缓慢添加苄基溴(2.8mL，24.07mmol)。将该混合物在60℃搅拌持续16h。过滤固体，并且浓缩滤液以给出粗混合物。粗产物通过二氧化硅快速色谱法(EtOAc:己烷)纯化，以提供作为无色液体的(S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酸苄酯(1.3g，65％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ3.05-3.08(m,2H),4.17(t,J＝6.00Hz,1H),4.36(d,J＝12.00Hz,1H),4.63(d,J＝12.00Hz,1H),5.14(s,2H),7.12-7.44(m,15H)。MS m/z：对C23H22O3计算为346.42[M]+,实测369.4[M+Na]+。
(S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酸(16)将(S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酸苄酯(15)(0.400g，1.15mmol)与6N HCl和1,4-二噁烷(3mL)混合。将该混合物在60℃搅拌持续24小时。用水稀释反应混合物，并且产物在CH2Cl2中提取。随后，分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤并且在真空中浓缩。粗产物通过二氧化硅快速色谱法(EtOAc:己烷)纯化，以提供作为无色泡沫状物的(S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酸(0.17g，87％)。1H NMR(CDCl3,500MHz)δ3.02-3.23(m,2H),4.22(t,J＝6.00Hz,1H),4.44(d,J＝12.00Hz,1H),4.63(d,J＝12.00Hz,1H),7.15-7.65(m,8H),8.12(d,J＝9.00Hz,2H)。MS m/z：对C16H16O3计算为256.30[M]+,实测255.6[M-1]+。
反式-2-(2-((S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-641)
标题化合物R06039-641使用(S)-2-(苄氧基)-3-苯基丙酸(16)并遵循如在方案1中描述的程序获得。(8mg，69％)；白色固体。1H NMR(MeOH-d4,300MHz)δ1.21-1.62(m,5H),1.78(d,J＝10.93Hz,2H),1.89-1.99(m,2H),2.27(t,J＝11.11Hz,1H),2.93(ddd,J＝14.03,8.57,3.01Hz,1H),3.07-3.13(m,2H),3.65-3.85(m,1H),3.86-4.01(m,2H),4.07(dd,J＝8.29,3.77Hz,1H),4.39(dd,J＝11.87,3.96Hz,1H),4.63(dd,J＝11.68,7.16Hz,1H),7.07-7.38(m,10H),7.77(bs,1H),8.09(br.s.,1H)。MS m/z：对C25H31N3O4计算为437.53[M]+,实测438.4[M+H]+。
R06039-642的合成
{3-[(2S)-2-氨基甲酰基哌啶-1-基]丙基}氨基甲酸叔丁酯.将哌啶-2-甲酰胺(108mg，0.843mmol)和N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.840mmol)溶解在DMF中。添加碳酸钾(350mg，2.53mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜，随后在50℃搅拌持续1.5小时。将混合物冷却至室温并且在减压下除去溶剂。将残余物通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，50％CMA 80/50％二氯甲烷)纯化，以给出作为白色膜状物的{3-[(2S)-2-氨基甲酰基哌啶-1-基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(75mg，31.3％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.27(d,J＝12.06Hz,1H)1.38-1.82(m,14H)1.82-2.05(m,3H)2.17(s,1H)2.66(dd,J＝10.64,3.49Hz,2H)3.01-3.32(m,3H)4.54-5.11(m,1H)5.33-5.79(m,1H)6.37-6.94(m,1H)。ESI MS m/z：对C14H27N3O3计算为285.38，实测286.6(M+H)+。
(2S)-1-(3-氨基丙基)哌啶-2-甲酰胺.将{3-[(2S)-2-氨基甲酰基哌啶-1-基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(150mg，0.526mmol)溶解在6M HCl中，并且搅拌持续1.25小时。在该时间结束时，用缓慢的氮气流去除溶剂。将THF(5mL)添加到残余物中，并且在室温在真空下蒸发过夜。产生的产物(2S)-1-(3-氨基丙基)哌啶-2-甲酰胺(0.526mmol)在下文使用而无需进一步纯化。ESI MS m/z：对C9H19N3O计算为185.27，实测186.1(M+H)+。
(2S)-1-{3-[(2S)-3-苯基-2-(苯基甲酰氨基)丙酰氨基]丙基}哌啶-2-甲酰胺(R06039-642)
将N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酸(177mg，0.657mmol)、HBTU(249mg，0.657mmol)、HOBT(89mg，0.659mmol)和DIEA(750mg，5.80mmol)溶解在DMF(2mL)中，并且在室温搅拌持续30分钟。添加在DMF(4mL)中的(2S)-1-(3-氨基丙基)哌啶-2-甲酰胺(0.526mmol)的溶液，并且混合物在室温在氮气下搅拌过夜。添加乙酸乙酯，并且用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤溶液。有机层经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。残余物最初通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，40％CMA 80/60％二氯甲烷)纯化。通过半制备型RP-HPLC的随后纯化(在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度，在30min内5％至50％在10min内至95％，其中保持在50％持续5分钟，流速15mL/min)提供作为白色固体的R06039-642(19.7mg；8.6％)1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 1.43(d,J＝9.61Hz,1H)1.53-1.92(m,6H)2.06(d,J＝13.19Hz,1H)2.77-3.29(m,7H)3.43(d,J＝11.49Hz,1H)3.63-3.82(m,1H)4.53-4.69(m,1H)7.08-7.21(m,1H)7.22-7.58(m,7H)7.70-7.87(m,3H)8.05-8.37(m,2H)8.63(d,J＝8.29Hz,1H)。ESI MS m/z：对C25H32N4O3计算为436.55，实测437.5(M+H)+。
R06039-644的合成，方案1.
2-(羟基(苯基)甲基)丙烯酸甲酯(2)将苯甲醛(1)(3.0g，28.27mmol)、丙烯酸甲酯(14.15g，141.35mmol)和DABCO(3.17g，28.27mmol)与MeOH(15mL)混合。混合物在0℃搅拌持续48小时。在真空中蒸发甲醇。残余物用EtOAc稀释，并且用0.1N HCl(2x 100mL)以及饱和NaHCO3水溶液洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。粗产物通过二氧化硅快速色谱法(EtOAc:己烷)纯化，以提供作为无色液体的2-(羟基(苯基)甲基)丙烯酸甲酯(4.7g，87％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ3.05(dd,J＝5.65,1.32Hz,1H),3.72(s,3H),5.56(d,J＝5.46Hz,1H),5.83(t,J＝1.22Hz,1H),6.31-6.37(m,1H),7.12-7.50(m,5H)。MS m/z：对C11H12O3计算为192.21[M]+,实测215.1[M+Na]+。
2-(乙酰氧基(苯基)甲基)丙烯酸甲酯(3)向在干燥CH2Cl2中的2-(羟基(苯基)甲基)丙烯酸甲酯(2)(0.5g，2.60mmol)的混合物中添加吡啶(0.27mL，3.38mmol)，随后在0℃逐滴添加乙酰氯(0.24mL，3.38mmol)。混合物在0℃搅拌持续1.5h。反应混合物用CH2Cl2稀释并用1N HCl(50mL)洗涤。分离有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。粗产物通过二氧化硅快速色谱法(EtOAc:己烷)纯化，以提供作为无色液体的标题产物(0.56g，92％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ2.11(s,3H),3.72(s,3H),5.87(s,1H),6.40(s,1H),6.68(s,1H),7.25-7.30(m,1H),7.21-7.52(m,5H)。对C13H14O4计算为234.25[M]+,实测235.3[M+H]+。
(E)-2-亚苄基-4-苯基丁酸甲酯(4)在冷却至-40℃的情况下向在无水二乙醚(25mL)中的2-(乙酰氧基(苯基)甲基)丙烯酸甲酯(3)(1.6g，6.78mol)的搅拌的溶液中缓慢地添加苄基溴化镁(在醚中的1M)(8.14mL，8.16mmol)。将产生的溶液在-40℃搅拌持续1小时。将溶液缓慢地加温至-5℃并在此温度搅拌持续2小时。溶液随后用饱和的含水NH4Cl(25mL)淬灭，并添加水(100mL)。水层在EtOAc(3x100mL)中提取。合并的有机层然后用盐水(50mL)洗涤，用Na2SO4干燥，并且在真空中去除溶剂。粗产物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷)纯化，以提供作为无色油状物的(E)-2-亚苄基-4-苯基丁酸甲酯(1.4g，77％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ2.81-2.88(m,4H),3.83(s,3H),7.13-7.24(m,3H),7.26-7.42(m,7H),7.72(s,1H)。对C18H18O2计算为266.33[M]+,实测267.2[M+H]+。
2-苄基-4-苯基丁酸甲酯(5)将在MeOH(40mL)中的(E)-2-亚苄基-4-苯基丁酸甲酯(4)(0.800g，3.00mol)和10％Pd/C(260g)的混合物在45psi下氢化持续4小时。混合物通过硅藻土垫过滤并浓缩，以获得作为无色油状物的粗制的2-苄基-4-苯基丁酸甲酯(0.76g，94％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.75-1.86(m,1H),1.92-2.08(m,1H),2.49-2.84(m,4H),2.89-3.06(m,1H),3.61(s,3H),7.10-7.16(m,4H),7.17-7.23(m,2H),7.23-7.31(m,4H)。对C18H20O2计算为268.35[M]+,实测269.2[M+H]+。
2-苄基-4-苯基丁酸(6)将在3.0mL的水中的氢氧化锂一水合物(0.260g，6.15mmol)添加到在MeOH(8mL)和THF(2mL)中的2-苄基-4-苯基丁酸甲酯(5)(0.550g，2.05mmol)的溶液中。反应混合物在室温搅拌持续4小时，并且然后浓缩至体积的约一半。将残余物用水(pH 9)稀释，并且然后用醚(2x30mL)提取。水层使用1N HCl酸化至pH 2，并且用CH2Cl2(3x50mL)提取。合并的有机层用水、盐水洗涤，并且然后用Na2SO4干燥。在真空中蒸发溶剂，以提供作为油状物的2-苄基-4-苯基丁酸(0.380g，73％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.74-1.91(m,1H),1.92-2.10(m,1H),2.53-2.88(m,4H),2.94-3.11(m,1H),6.98-7.38(m,10H)。对C17H18O2计算为254.32[M]+,实测253.3[M-H]+。
(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸叔丁酯(7)将2-苄基-4-苯基丁酸(6)(100mg，0.39mmol)溶解在THF(6mL)中。向溶液中添加BOP(191mg，0.43mmol)和三乙胺(0.16mL，1.18mmol)。将产生的混合物在室温搅拌持续15分钟。添加甘氨酸叔丁酯盐酸盐(72mg，0.43mmol)，并且在室温搅拌持续3小时。在真空中蒸发THF，向残余物中添加水，并且水层用CH2Cl2(3x25mL)提取。合并的有机层用水、盐水洗涤，并且然后用Na2SO4干燥。在真空中蒸发溶剂，以给出粗制的残余物。将残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc:Hex)纯化，以提供作为白色固体的(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸叔丁酯(0.11mg，76％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.45(s,9H),1.72-1.87(m,1H),1.99-2.13(m,1H),2.31-2.41(m,1H),2.50-2.62(m,1H),2.66-2.78(m,2H),2.91-2.99(m,1H),3.71(dd,J＝18.46,4.52Hz,1H),3.96(dd,J＝18.37,5.37Hz,1H),5.65(br.s.,1H),7.08-7.26(m,9H),7.29(s,1H)。对C23H29NO3计算为367.48[M]+,实测368.4[M+H]+。
反式-2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷-1-羧酸乙酯(8)
将三氟乙酸(0.8mL)逐滴添加到在CH2Cl2(2.0mL)中的(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸叔丁酯(7)(100mg，0.27mmol)的溶液中。反应混合物在室温搅拌持续4小时，并且然后在真空中蒸发溶剂并干燥，以给出作为无色泡沫状物的(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸，其被使用而无需进一步纯化(90mg，85％)。
将(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸(50mg，0.16mmol)溶解在DCM(8mL)中。向溶液中添加EDC.HCl(40mg，0.20mmol)、三乙胺(0.22mL，1.60mmol)和乙基反式-2-氨基-1-环己烷(33mg,0.16mmol)。产生的混合物在室温搅拌持续16h。反应混合物用CH2Cl2稀释并用水和盐水洗涤。分离有机层，用Na2SO4干燥并过滤。在真空中蒸发滤液，以给出粗制的残余物，所述粗制的残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc:Hex)纯化，以给出作为无色泡沫状物的反式-2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷-1-羧酸乙酯(45mg，60％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.20(t,J＝6.0Hz,3H)1.09-1.28(m,3H),1.67-1.83(d,J＝11.49Hz,3H),1.88-2.11(m,3H),2.32-2.45(m,1H),2.49-2.82(m,3H),2.87-2.99(m,1H),3.58-3.87(m,3H),3.95(d,J＝7.72Hz,1H),4.00-4.17(m,2H),5.76(br.s.,1H),5.90(br.s.,1H),7.05-7.22(m,6H),7.22-7.32(m,4H)。对C28H36N2O4计算为464.60[M]+,实测365.5[M+H]+。
反式-2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-644)
将在1.5mL的水中的氢氧化锂一水合物(8.1mg，0.19mmol)添加到在MeOH(6mL)和THF(1mL)中的反式-2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷-1-羧酸乙酯(8)(30mg，0.06mmol)的溶液中。反应混合物在室温搅拌持续16h，并且然后浓缩至体积的约一半。将残余物用水(pH 9)稀释，并且然后用醚(2x25mL)提取。水层使用1N HCl酸化至pH 2，并且用CH2Cl2(3x50mL)提取。合并的有机层用水、盐水洗涤，并且然后用Na2SO4干燥并且过滤。在真空中蒸发溶剂，以给出作为白色固体的反式2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷羧酸，其被使用而无需进一步纯化(23mg，28％)。将反式2-(2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷羧酸(20mg，0.04mmol)溶解在THF(5mL)中。向溶液中添加BOP(18mg，0.04mmol)和三乙胺(0.040mL，0.14mmol)。将产生的混合物在室温搅拌持续15分钟。向反应混合物中缓慢地添加在THF(0.2mL，0.14mmol)中的0.5M NH3，并且在室温搅拌持续3h。在真空中蒸发THF，向残余物中添加水，并且水层用CH2Cl2(3x25mL)提取。合并的有机层用水、盐水洗涤，并且然后用Na2SO4干燥。在真空中蒸发溶剂，以给出粗制的残余物。将残余物通过硅胶快速色谱法(MeOH:CH2Cl2)纯化，以给出作为白色固体的R06039-644(15mg，76％)。1H NMR(MeOH-d4,500MHz)δ1.18-1.38(m,3H),1.47-156(m,1H),1.70-1.76(m,3H),1.90-1.98(m,3H),2.18-2.26(m,1H),2.52-2.69(m,1H),2.73(dd,J＝6.50Hz,J＝6.00Hz,1H),2.87-2.93(m,1H),3.44-3.54(m,2H),3.65-3.74(m,2H),3.81-3.91(m,1H),7.12-7.18(m,6H),7.21-7.26(m,4H)。MS m/z：对C26H33N3O3 435.56计算为[M]+,实测436.8[M+H]+。
(1R/S,2S/R)-2-(2-肉桂酰氨基乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-655)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，经由肽偶联将Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。Rink树脂(130mg)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％哌啶溶液除去(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。以3倍过量添加Nα-Fmoc-Gly-OH并且在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内偶联。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次，并且通过在氮气气氛下用CH2Cl2摇动(3×10min)进行调节。肽树脂用DMF洗涤三次，并且然后在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内与反式肉桂酸(3倍当量)偶联。肽树脂用DMF(3x)以及DCM(3x)洗涤，并且用TFA/DCM(1:1，10mL)在0.5h内从树脂中释放肽。通过过滤来去除树脂，并且粗制肽用冷的无水乙醚通过沉淀来回收，并且通过半制备型RP-HPLC使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(在30分钟内从5％到95％)以15.0mL/min的流速来纯化所述粗制肽。期望的产物R06039-655作为白色固体获得(14.4mg，56％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 1.03-1.48(m,4H)1.58-1.87(m,4H)2.14(td,J＝11.40,3.58Hz,1H)3.64-3.87(m,3H)6.05-6.05(m,0H)6.66-6.76(m,2H)6.79(s,1H)6.99(s,1H)7.33-7.47(m,4H)7.57(dd,J＝7.91,1.51Hz,2H)7.70(d,J＝8.67Hz,1H)8.26(t,J＝5.65Hz,1H)；ESI MS m/z：对C18H23N3O3计算为329.40，实测352.2(M+Na)+，330.3(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝13.33min(>99.9％)。
(1R/S,2S/R)-2-(2-(2-苄基-3-苯基丙酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-656)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，经由肽偶联将Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。Rink树脂(130mg)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。以3倍过量添加Nα-Fmoc-Gly-OH，并且在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内偶联。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次，并且通过在氮气气氛下用CH2Cl2摇动(3×10min)进行调节。肽树脂用DMF洗涤三次，并且然后在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内与二苄基乙酸(3倍当量)偶联。肽树脂用DMF(3x)和DCM(3x)洗涤，并且用TFA/DCM(1:1，10mL)在0.5h内从树脂释放肽。通过过滤去除树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀回收粗制肽，并且通过半制备型RP-HPLC使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(在30分钟内从5％到95％)以15.0mL/min的流速来纯化所述粗制肽。期望的产物R06039-656作为白色固体获得(12.5mg，39％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 0.93-1.46(m,6H)1.55-1.81(m,3H)2.07(dd,J＝11.02,7.82Hz,1H)2.78-2.98(m,3H)3.43(dd,J＝16.11,5.37Hz,2H)3.51-3.76(m,3H)6.69(br.s.,1H)6.97(br.s.,1H)7.10-7.30(m,10H)7.40(d,J＝8.29Hz,1H)8.02(t,J＝5.46Hz,1H)；ESI MS m/z：对C25H31N3O3计算为421.45，实测422.3(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝15.59min(>99.9％)。
(1R/S,2S/R)-2-(2-(2,3-二苯基丙酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-657)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，经由肽偶联将Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。Rink树脂(130mg)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。以3倍过量添加Nα-Fmoc-Gly-OH，并且在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下在45分钟内用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)偶联。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次，并且通过在氮气气氛下用CH2Cl2摇动(3×10min)进行调节。肽树脂用DMF洗涤三次，并且然后在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内与苄基苯乙酸(3倍当量)偶联。肽树脂用DMF(3x)和DCM(3x)洗涤，并且用TFA/DCM(1:1，10mL)在0.5h内从树脂中释放肽。通过过滤去除树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀回收粗制肽，并且通过半制备型RP-HPLC使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(在30分钟内从5％到95％)以15.0mL/min的流速来纯化所述粗制肽。期望的产物R06039-657作为白色固体获得(10mg，32％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 1.24(br.s.,6H)1.51-1.82(m,3H)2.04(br.s.,1H)2.93(d,J＝7.35Hz,2H)3.40-3.75(m,3H)3.94(s,1H)6.68(br.s.,1H)6.96(br.s.,1H)7.06-7.47(m,10H)8.19(d,J＝5.09Hz,1H)；ESI MS m/z：对C24H29N3O3计算为407.51，实测408.6(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝15.96min(>90％)。
3-{N-苄基-2-[(2S)-3-苯基-2-(苯基甲酰氨基)丙酰氨基]乙酰氨基}丁酰胺(R06039-658)
将N-(苯基羰基)-L-苯丙氨酰甘氨酸1(56mg；0.478mmol)溶解在THF(5mL)中。添加BOP(317mg,0.717mmol)和三乙胺(242mg,2.39mmol)，并且将混合物搅拌持续10分钟。随后添加3-(苄基氨基)丁酰胺2(110mg，0.572mmol)，并且溶液在氮气下在室温搅拌过夜。添加水并且用二氯甲烷提取混合物。有机层经硫酸钠干燥并且在减压下除去溶剂。将残余物通过制备型薄层色谱法纯化两次(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，第一板30％CMA 80/70％二氯甲烷，第二板35％CMA 80/65％二氯甲烷)，以给出作为白色固体的R06039-658(36mg；15.1％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 1.06(d,J＝6.40Hz,3H)2.16-2.47(m,2H)2.89-3.08(m,1H)3.10-3.26(m,1H)3.89(br.s.,1H)4.17-4.68(m,4H)4.78(d,J＝8.10Hz,1H)6.71-6.98(m,1H)7.07-7.57(m,14H)7.78(d,J＝7.16Hz,2H)8.06-8.25(m,1H)8.51-8.77(m,1H)。ESI MS m/z：对C29H32N4O4计算为500.59，实测501.7(M+H)+。(1-Sandhu,S.S.；Singh,J.；Sharma,S.J.Indian Chem.Soc.1989,66(2),104；2-Zilkha,A；Rivlin,J.J.Org.Chem.1958,23,95.)
N-((S)-1-(2-(((1R/S,2S/R)-2-氨基甲酰基环己基)(甲基)氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)苯甲酰胺(R06039-662)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，经由肽偶联将Fmoc-反式-(1R/S,2R/S)-2-氨基环己烷羧酸偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。Rink树脂(130mg)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)以及THF洗涤(3x 10min)。将树脂上的氨基酸悬浮在THF(5mL)中，并且添加甲醛(37％aq，5mL)。将悬浮液摇动持续2小时，沥干，重新填充有甲醛(37％aq，5mL)，摇动持续1小时，沥干并且用THF(1mL)填充。添加乙酸/水的混合物(1:1，1mL)并且摇动持续5分钟。添加NaCNBH3(1N，1mL)的溶液，并且将悬浮液摇动持续3小时。沥干反应混合物，并且用水(3x)洗涤，然后用DMF(3x)洗涤。然后逐步添加下列保护的氨基酸Nα-Fmoc-AA2-OH(AA2：Nα-Fmoc-Gly-OH,Nα-Fmoc-Phe-OH)。在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下在45分钟内使用3倍过量的氨基酸与HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)完成每个偶联反应。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次，并且通过在氮气气氛下用CH2Cl2摇动(3×10min)进行调节。肽树脂用DMF洗涤三次，并且然后在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内与苯甲酸(3倍当量)偶联。肽树脂用DCM(3x)洗涤，并且用TFA/DCM(1:1，10mL)在0.5h内从树脂中释放肽。通过过滤去除树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀回收粗制肽，并且通过半制备型RP-HPLC使用在0.5％含水TFA中的CH3CN的梯度(在30分钟内从5％到95％)以15.0mL/min的流速纯化所述粗制肽。期望的产物R06039-662作为白色固体获得(2.1mg，6％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 1.32-1.86(m,8H)2.66-2.77(m,3H)2.90-3.04(m,1H)3.09-3.23(m,1H)3.67(br.s.,2H)4.11(t,J＝4.90Hz,1H)4.76(tt,J＝7.68,4.10Hz,1H)6.81(br.s.,1H)7.07-7.29(m,3H)7.32-7.55(m,6H)7.77(d,J＝7.72Hz,2H)7.94-8.09(m,1H)8.66(d,J＝8.85Hz,1H)；ESI MS m/z：对C24H29N3O3计算为464.57，实测465.4(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝15.16min(>99.9％)。
N-((S)-1-(2-((S)-3-氨基-3-氧代-1-苯基丙基氨基)-2-氧代乙基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)苯甲酰胺(R06039-663)
使用AAPPTEC Focus肽合成器，经由肽偶联将Nβ-Fmoc-(R)-3-氨基-3-苯基丙酸(250mg)偶联至Rink树脂(0.52meq/g)。Rink树脂(130mg)用DMF(5x10mL)洗涤，并且Nα-Fmoc保护基团用在DMF中的20％哌啶溶液去除(1x5min，1x10min)，随后用DMF洗涤(3x)。然后逐步添加下列保护的氨基酸Nα-Fmoc-AA2-OH(AA2：Nα-Fmoc-Gly-OH,Nα-Fmoc-Phe-OH)。在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下使用3倍过量的氨基酸与HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内完成每个偶联反应。通过用在DMF中的20％哌啶溶液处理(1x5min，1x10min)保护的肽树脂来去除Nα-Fmoc保护基团。肽树脂用DMF洗涤三次，并且通过在氮气气氛下用CH2Cl2摇动(3×10min)进行调节。肽树脂用DMF洗涤三次，并且然后在DIEA(0.8mL，在NMP中的2M)的存在下在氮气气氛下用HBTU和HOBt(1.5mL，在DMF中各自0.5M)在45分钟内与苯甲酸(3倍当量)偶联。肽树脂用DCM(3x)洗涤，并且用TFA/DCM(1:1，10mL)在0.5h内从树脂中释放肽。通过过滤去除树脂，并且用冷的无水乙醚通过沉淀回收粗制肽，并且在真空中干燥。期望的产物R06039-663作为白色固体获得(20mg，89％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 3.04(d,J＝10.55Hz,3H)3.16(br.s.,1H)3.75(d,J＝5.65Hz,2H)4.67(br.s.,1H)5.22(d,J＝8.29Hz,1H)6.81(br.s.,1H)7.09-7.56(m,14H)7.79(d,J＝6.97Hz,2H)8.29-8.45(m,2H)8.67(d,J＝8.10Hz,1H)ESI MS m/z：对C27H28N4O4计算为472.54，实测473.3(M+H)+；HPLC(Synergy Hydro,20min)tR＝15.63min(>98％)。
R06039-675的合成
(E)-2-亚苄基-4-苯基丁酸.将在1.5mL的水中的氢氧化锂一水合物(0.118g，2.81mmol)添加到在MeOH(10mL)和THF(1mL)中的(E)-2-亚苄基-4-苯基丁酸甲酯(4)(0.300g，1.12mmol)的溶液中。反应混合物在室温搅拌持续16h，并且然后浓缩至体积的约一半。将残余物用水(pH 9)稀释，并且然后用醚(2x25mL)提取。水层使用1N HCl酸化至pH 2，并且用CH2Cl2(3x50mL)提取。合并的有机层用水、盐水洗涤，并且然后用Na2SO4干燥。在真空中蒸发溶剂，以给出作为白色固体的(E)-2-亚苄基-4-苯基丁酸(0.27g，96％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ2.81-2.96(m,4H),7.16-7.25(m,3H),7.26-7.43(m,7H),7.83-7.93(m,1H),11.51(br.s.,1H)。对C17H16O2计算为252.31[M]+,实测251.4[M-H]+。
反式-2-(2-((E)-2-亚苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-675)
以类似于R06039-644的方式制备标题化合物，以得到作为白色固体的R06039-675(8mg，79％)。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ1.07-1.54(m,5H),1.70-1.85(m,3H),1.94-2.08(m,2H),2.20-2.36(m,1H),2.77-2.90(m,3H),3.35-4.10(m,3H),5.76(br.s.,1H),6.21(br.s.,1H),6.80(d,J＝8.29Hz,1H),6.97(br.s.,1H),7.09-7.42(m,10H)。MS m/z：对C26H31N3O3计算为433.54[M]+,实测434.4[M+H]+。
反式-2-(2-(2-苄基-4-环己基丁酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-682)
使用如方案1中描述的程序来合成标题化合物(R06039-682)，以提供白色固体(7mg，82％)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ0.68-0.91(m,2H),0.99-1.84(m,10H),1.35-1.53(m,2H),1.54-170(m,8H),1.70-1.84(m,2H),1.94-2.15(m,2H),2.75-2.90(br.s.,1H),3.54-3.75(m,2H),6.70(br.s.,1H),7.00(br.s.,1H),7.11-7.29(m,4H),7.42(d,J＝5.65Hz,1H),7.99(d,J＝6.22Hz,1H)。MS m/z：对C26H39N3O3计算为441.61[M]+,实测442.7[M+H]+。
反式-2-(2-(2-苄基-5-甲基己酰氨基)乙酰氨基)环己烷甲酰胺(R06039-686)
使用如方案1中描述的程序来合成标题化合物(R06039-686)，以提供白色固体(11mg，70％)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ0.78(t,J＝6.69Hz,6H),1.00-1.15(m,4H),1.18-1.31(m,3H),1.34-1.54(m,3H),1.56-1.69(m,2H),1.70-.84(m,2H),2.09(br.s.,1H),2.75-2.87(br.s.,1H),3.56(br.s.,1H),3.62-3.79(m,2H),6.70(br.s.,1H),7.01(br.s.,1H),7.11-7.30(m,5H),7.45(br.s.,1H),7.98(br.s.,1H)。MS m/z：对C23H35N3O3计算为401.54[M]+,实测402.4[M+H]+。
R06039-691的合成
3-(甲氧基羰基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸。
将双环[2.2.2]辛烷-2,3-二羧酸酐(1.0g，6.09mmol)溶解在无水四氢呋喃(3mL)中并冷却至0℃。然后在10分钟内逐滴添加甲醇钠溶液(0.5M，16.8mL，8.42mmol)。然后将溶液在室温搅拌持续20小时。添加第二部分的甲醇钠(8.4mL；4.21mmol)，并且将混合物回流持续7小时。允许溶液冷却至室温并搅拌持续另外的13小时。将反应体积减少约一半，并且将混合物倒入冷的2N HCl(50mL)中。产生的溶液用氯仿提取若干次，并且合并有机层并经硫酸钠干燥。在减压下除去溶剂，并且真空干燥残余物，以给出作为灰白色固体的3-(甲氧基羰基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸(1.04g，88.2％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.03-1.22(m,1H)1.31(s,1H)1.41-1.58(m,1H)1.59-1.72(m,1H)2.77-3.12(m,3H)3.21(d,J＝2.26Hz,1H)3.73(s,3H)6.22(s,1H)6.33-6.43(m,1H)。
3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸甲酯。
将3-(甲氧基羰基)双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸(1.03g，4.9mmol)溶解在甲苯(15mL)中。添加二苯基磷酰基叠氮化物(1.48g，5.38mmol)和三乙胺(544mg，5.38mmol)并且将混合物在90℃加热持续2.5小时。然后添加苯甲醇(530mg，4.9mmol)，并且将混合物在90℃加热持续2.5天。将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯(100mL)稀释，并且用饱和碳酸氢钠溶液提取若干次。有机层经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。混合物通过硅胶色谱法纯化(40％乙酸乙酯/60％己烷)，以给出作为无色液体的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸甲酯(840mg，54.4％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 0.97-1.15(m,1H)1.19-1.36(m,1H)1.63(s,2H)2.07-2.19(m,1H)2.63-2.78(m,1H)2.79-2.94(m,1H)3.73(s,3H)4.23-4.38(m,1H)4.51-4.65(m,1H)4.98-5.16(m,2H)6.10-6.23(m,1H)6.39-6.52(m,1H)7.27-7.43(m,5H)。
3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸。
将3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸甲酯(790mg，2.51mol)溶解在THF/MeOH/H2O(1:1:1，30mL)的混合物中。添加氢氧化锂(525mg，12.51mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续18小时，随后在50℃搅拌持续2.5小时。去除溶剂，并且将残余物再溶解在水中。用氯仿提取溶液若干次，并且弃去有机层。然后用6N HCl将水层酸化至pH 1。然后用THF/DCM(7:3)的混合物提取水层若干次。合并有机层，用盐水洗涤且经硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂，并且真空干燥持续两小时，以给出作为粘性白色泡沫状物的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸，其被使用而无需进一步纯化(710mg，94.0％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm0.96-1.19(m,1H)1.20-1.40(m,1H)1.46-1.81(m,2H)2.10-2.26(m,1H)2.58-2.79(m,1H)2.85-3.03(m,1H)4.05-4.29(m,1H)4.73-4.93(m,1H)5.08(d,J＝5.65Hz,2H)6.09-6.33(m,1H)6.40-6.60(m,1H)7.34(s,5H)。
(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-5-烯-2-基)氨基甲酸苄酯。
将3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.2]辛-5-烯-2-羧酸(1.17g，3.88mmol)溶解在乙腈(60mL)中。添加在乙腈(20mL)中的碳酸氢铵(460mg，5.82mmol)、BOC2O(1.27g，5.82mmol)和吡啶(154mg，1.95mmol)的混合物，并将合并的混合物在室温搅拌持续18小时。在减压下除去溶剂，并且将残余物悬浮在水中。将悬浮液声处理持续若干分钟，并且然后搅拌持续若干分钟。通过过滤去除残余物，用水充分洗涤，并且真空干燥，以给出作为白色固体的(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-5-烯-2-基)氨基甲酸苄酯，其被使用而无需进一步纯化(803mg，68.9％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm0.94-1.16(m,1H)1.19-1.40(m,1H)1.71(s,2H)1.96-2.17(m,1H)2.54-2.76(m,1H)2.94-3.19(m,1H)3.90-4.14(m,1H)4.78-4.98(m,1H)5.10(s,2H)5.32-5.64(m,1H)6.06-6.26(m,1H)6.38-6.63(m,1H)7.35(s,5H)7.50-7.77(m,1H)。
3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-甲酰胺。
将(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-5-烯-2-基)氨基甲酸苄酯(205mg，0.683mmol)放置在甲醇(50mL)中并用氮气吹扫。然后添加碳载钯(10％，70mg)和三乙胺(10滴)，并且将混合物在氢气下在45psi摇动持续19小时。通过过滤去除催化剂，并且在减压下蒸发滤液。将残余物通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，CMA 80)纯化，以给出作为白色固体的3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-甲酰胺(96mg，83.5％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.14-1.81(m,12H)2.01(d,J＝6.59Hz,1H)3.16-3.22(m,1H)。ESI MS m/z：对C9H16N2O计算为168.24，实测169.3(M+H)+。
3-[2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基]双环[2.2.2]辛烷-2-甲酰胺(R06039-691)
将3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-甲酰胺(96mg，0.571mmol)、N-(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸(99mg，0.318mmol)和三乙胺(257mg，2.54mmol)放置在二氯甲烷(20mL)中。添加EDC.HCl(109mg，0.569mmol)和HOBt(77mg，0.570mmol)，并且混合物在氮气下在室温搅拌持续18小时。在该时间结束时，用饱和氯化钠水溶液洗涤溶液。然后用二氯甲烷反提取水层，并且合并有机层。产生的溶液经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。将残余物通过制备型薄层色谱法纯化两次(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，50％CMA 80/50％二氯甲烷)，以给出作为白色固体的R06039-691(44.0mg；30％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.28-1.92(m,10H)1.95-2.25(m,3H)2.37-3.03(m,5H)3.55-3.94(m,2H)4.07-4.32(m,1H)5.39-5.65(m,1H)6.45-6.73(m,1H)6.94-7.43(m,12H)。ESI MS m/z：对C28H35N3O3计算为461.60，实测462.6(M+H)+。
R06039-692的合成
3-(甲氧基羰基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸。
将双环[2.2.1]庚烷-2,3-二羧酸酐(1.0g，6.09mmol)溶解在无水四氢呋喃(3mL)中并冷却至0℃。然后在15分钟内逐滴添加甲醇钠溶液(0.5M，18.27mL，9.14mmol)。然后允许溶液加温至室温并搅拌持续2小时。添加第二部分的甲醇钠(9.14mL，4.57mmol)，并且将混合物回流持续6.5小时。允许溶液冷却至室温并搅拌持续另外的14小时。将反应体积减少约一半，并且将混合物倒入冷的2N HCl(50mL)中。产生的溶液用氯仿提取若干次，并且合并有机层并经硫酸钠干燥。在减压下除去溶剂，并且真空干燥残余物，以给出作为白色固体的3-(甲氧基羰基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸(926mg，77.5％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.48(dd,J＝8.76,1.41Hz,1H)1.63(d,J＝8.85Hz,1H)2.66(d,J＝3.20Hz,1H)3.14(br.s.,1H)3.30(br.s.,1H)3.43(t,J＝4.14Hz,1H)3.67-3.84(m,3H)6.14(dd,J＝5.46,2.64Hz,1H)6.29(dd,J＝5.37,3.11Hz,1H)。
3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸甲酯。
将3-(甲氧基羰基)双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸(880mg，4.49mmol)溶解在甲苯(15mL)中。添加二苯基磷酰基叠氮化物(1.36g，4.94mmol)和三乙胺(500mg，4.94mmol)并且将混合物在90℃加热持续2小时。然后添加苯甲醇(485mg，4.49mmol)，并且将混合物在90℃加热持续2天，随后在室温搅拌持续18小时。混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，并且用饱和碳酸氢钠溶液提取若干次。有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。混合物通过硅胶色谱法纯化(35％乙酸乙酯/55％己烷)，以给出作为无色液体的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸甲酯(930mg，68.8％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.42-1.57(m,1H)1.77-1.86(m,1H)1.92(br.s.,1H)2.87-3.14(m,2H)3.73(s,3H)4.41-4.65(m,2H)5.08(br.s.,2H)6.09-6.24(m,1H)6.33-6.49(m,1H)7.27-7.43(m,5H)。
3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸。
将3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸甲酯(910mg，3.02mmol)溶解在THF/MeOH/H2O(1:1:1，30mL)的混合物中。添加氢氧化锂(600mg，14.3mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续18小时，随后在50℃搅拌持续2.5小时。去除溶剂，并且将残余物再溶解在水中。用氯仿提取溶液若干次，并且弃去有机层。然后用6N HCl将水层酸化至pH 1。然后用THF/DCM(7:3)的混合物提取水层若干次。合并有机层，用盐水洗涤并且经硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂，并且真空干燥持续2.5小时，以给出作为白色固体的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸，其被使用而无需进一步纯化(855mg，98.5％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm1.55-1.70(m,1H),1.75-1.90(m,1H),2.05-2.15(m,1H),3.03(br.s.,1H)3.90-4.00(m,1H)4.12-4.32(m,1H)4.73-5.01(m,1H)5.05-5.20(m,2H)6.01-6.28(m,1H)6.44(d,J＝3.20Hz,1H)7.18-7.45(m,5H)。
(3-氨基甲酰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)氨基甲酸苄酯。
将3-{[(苄氧基)羰基]氨基}双环[2.2.1]庚-5-烯-2-羧酸(850mg，2.96mmol)溶解在乙腈(60mL)中。添加在乙腈(20mL)中的碳酸氢铵(351mg，4.44mol)、BOC2O(968mg，4.44mmol)和吡啶(117mg，1.48mmol)的混合物，并且将合并的混合物在室温搅拌持续17小时。在减压下去除溶剂并且将残余物悬浮在水中。将悬浮液声处理持续若干分钟，并且然后搅拌持续若干分钟。通过过滤去除残余物，用水充分洗涤，并且真空干燥，以给出作为白色固体的(3-氨基甲酰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)氨基甲酸苄酯，其被使用而无需进一步纯化(600mg，70.8％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.58(s,2H)2.00(br.s.,1H)2.97(br.s.,1H)3.38(br.s.,1H)4.16-4.40(m,1H)4.77(d,J＝6.78Hz,1H)5.09(q,J＝12.06Hz,2H)5.36-5.69(m,1H)6.15(dd,J＝5.56,2.54Hz,1H)6.46(dd,J＝5.37,3.11Hz,1H)7.36(s,5H)7.75-8.15(m,1H)。
3-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺。
将(3-氨基甲酰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)氨基甲酸苄酯(225mg，0.786mmol)放置在甲醇(75mL)中并用氮气吹扫。添加碳载钯(10％，100mg)和三乙胺(10滴)，并且将混合物在氢气下在45psi摇动持续5小时。通过过滤去除催化剂，并且在减压下蒸发滤液。将残余物通过制备型薄层色谱法纯化(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，CMA 80)，以给出作为白色固体的3-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(95mg，78.5％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.16-1.52(m,3H)1.53-1.82(m,4H)2.20(br.s.,1H)2.25-2.41(m,1H)3.25-3.49(m,1H)。
3-[2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)乙酰氨基]双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(R06039-692)
将3-氨基双环[2.2.1]庚烷-2-甲酰胺(91mg；0.590mmol)、N-(2-苄基-4-苯基丁酰基)甘氨酸(106mg，0.340mmol)和三乙胺(276mg，2.73mmol)放置在二氯甲烷(25mL)中。添加EDC.HCl(113mg，0.590mmol)和HOBt(80mg，0.592mmol)，并且混合物在氮气下在室温搅拌持续18小时。在该时间结束时，用饱和氯化钠水溶液提取溶液。用二氯甲烷反提取水层，并且合并有机层。溶液经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。将残余物通过制备型薄层色谱法纯化两次(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，50％CMA80/50％二氯甲烷)，以给出作为白色固体的R06039-692(44.4mg；29.1％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.14-1.95(m,9H)1.95-2.18(m,1H)2.26-3.04(m,6H)3.54-3.97(m,2H)4.01-4.22(m,1H)5.24-5.53(m,1H)6.21-6.48(m,1H)6.94-7.39(m,10H)7.64-7.93(m,1H)。ESI MS m/z:对C27H33N3O3计算为447.57，实测448.8(M+H)+。
R06039-693、694、695的合成
N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺。
将(2S)-2-[(苄氧基)羰基]氨基}-6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸(321mg，0.844mmol)和HATU(400mg，1.05mmol)溶解在DMF(10mL)中并且搅拌持续10分钟。然后添加在DMF(2mL)中的2-氨基环己烷甲酰胺(150mg，1.06mmol)，并且在添加DIEA(273mg，2.11mmol)之前将混合物搅拌持续另外的10分钟。将该溶液在室温搅拌过夜。添加饱和氯化钠水溶液(50mL)，并且将混合物搅拌持续30分钟。混合物用乙酸乙酯提取若干次，并且合并有机层。过滤掉在合并的有机层中形成的沉淀物，并用乙酸乙酯充分洗涤。将该固体真空干燥过夜，以给出N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺(280mg，65.7％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.17-2.00(m,24H)2.28(d,J＝11.87Hz,1H)2.92-3.16(m,2H)4.00(d,J＝7.35Hz,2H)5.09(br.s.,2H)6.47-6.70(m,1H)7.20-7.47(m,5H)。ESI MS m/z：对C26H40N4O6计算为504.62，实测505.5(M+H)+。
N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺。
将N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺(270mg，0.535mmol)放置在甲醇(100mL)中并用氮气吹扫。添加碳载钯(10％，100mg)和三乙胺(10滴)，并且将混合物在氢气下在45psi摇动持续17小时。通过过滤去除催化剂，并且将滤液在减压下蒸发，以给出作为白色固体的N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺，其被使用而无需进一步纯化(175mg，88.4％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.18-1.67(m,24H)1.78(d,J＝10.17Hz,3H)1.94(d,J＝9.80Hz,2H)2.30(d,J＝7.35Hz,1H)2.93-3.20(m,3H)3.81-4.13(m,1H)。
2-[(2S)-6-氨基-2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)己酰氨基]环己烷-1-甲酰胺(R06039-693、694、695)
将2-苄基-4-苯基丁酸(96mg，0.378mmol)和HATU(180mg，0.474mmol)溶解在DMF(5mL)中并且搅拌持续10分钟。添加在DMF(5mL)中的N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺(175mg，0.472mmol)，并且将混合物搅拌持续10分钟。随后添加DIEA(122mg，0.944mmol)并且将混合物在室温搅拌过夜。添加饱和氯化钠水溶液(25mL)，并且将混合物搅拌持续10分钟。通过过滤去除产生的沉淀，用水充分洗涤并真空干燥，以给出黄色固体。然后固体通过制备型薄层色谱法纯化(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，50％CMA 80/50％二氯甲烷)，以给出作为白色固体的N2-(2-苄基-4-苯基丁酰基)-N6-(叔丁氧基羰基)-N-(2-氨基甲酰基环己基)-L-赖氨酰胺(55mg；24.0％)。ESI MS m/z：对C35H50N4O5计算为606.80，实测629.9(M+Na)+。将上述材料(50mg；0.082mmol)溶解在二氯甲烷(5mL)中。添加TFA(1.5mL)，并且将混合物在室温搅拌持续3小时。在减压下去除溶剂并且将残余物用二氯甲烷追赶若干次。将此残余物溶解到少量二氯甲烷中并用己烷沉淀。过滤固体并真空干燥，以给出作为TFA盐的标题化合物(40.5mg，4种异构体的混合物，79.19％)。R06039-693：1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 0.64-0.97(m,2H)0.99-1.98(m,18H)2.02-2.28(m,1H)2.32-2.94(m,7H)3.58-3.90(m,1H)3.95-4.27(m,1H)6.80-7.34(m,10H)。ESI MS m/z：对C30H42N4O3计算为506.68，实测507.4(M+H)+。
通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，CMA 80)进一步纯化上述固体(20mg)，以给出两个主要级分。级分1(较小极性，5mg，两种异构体的混合物)，R06039-694：1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm0.51-0.95(m,2H)0.98-1.96(m,18H)2.00-2.29(m,1H)2.67(s,7H)3.58-3.86(m,1H)3.94-4.28(m,1H)6.89-7.26(m,10H)。ESI MS m/z：对C30H42N4O3计算为506.68，实测507.4(M+H)+。级分2(较大极性，7mg，两种异构体的混合物)，R06039-695：1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm0.61-0.97(m,2H)0.98-1.93(m,18H)1.99-2.25(m,1H)2.67(s,7H)3.63-3.93(m,1H)3.94-4.23(m,1H)6.89-7.25(m,10H)。ESI MS m/z：对C30H42N4O3计算为506.68，实测507.4(M+H)+。
R06039-696、697、698的合成
{(1S)-5-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基甲酰基]戊基}氨基甲酸苄酯。
将(2S)-2-[(苄氧基)羰基]氨基}-6-[(叔丁氧基羰基)氨基]己酸(215mg，0.565mmol)和HATU(269mg，0.707mmol)溶解在DMF(10mL)中并且搅拌持续10分钟。然后添加在DMF(2mL)中的3-氨基双环[2.2.2]辛烷-2-甲酰胺(119mg，0.707mmol)，并且在添加DIEA(182mg，1.41mmol)之前将混合物搅拌持续另外的10分钟。将该溶液在室温搅拌过夜。添加饱和氯化钠水溶液(50mL)，并且将混合物搅拌持续10分钟。然后过滤反应混合物，以留下粘性浅粉红色残余物。将此材料溶解在二氯甲烷中，并且用饱和氯化钠水溶液洗涤。有机层经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。将残余物真空干燥，以给出作为浅粉红色泡沫状物的{(1S)-5-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基甲酰基]戊基}氨基甲酸苄酯，其被使用而无需进一步纯化(240mg，80.0％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm 1.09-1.92(m,24H)1.93-2.40(m,2H)2.97-3.21(m,2H)3.99-4.33(m,2H)4.71-4.94(m,1H)5.07(d,J＝5.46Hz,2H)5.61-5.82(m,1H)5.85-6.10(m,1H)7.00-7.54(m,7H)。ESI MS m/z：对C28H42N4O6计算为530.66，实测531.6(M+H)+。
{(5S)-5-氨基-6-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸叔丁酯。
将{(1S)-5-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基甲酰基]戊基}氨基甲酸苄酯(240mg，0.452mmol)放置在甲醇(100mL)中并用氮气吹扫。添加碳载钯(10％，100mg)和三乙胺(15滴)，并且将混合物在氢气下在45psi摇动持续5小时。通过过滤去除催化剂，并且在真空下从滤液中去除溶剂。将残余物吸收到少量二氯甲烷中并用己烷沉淀。然后作为整体蒸发此混合物并真空干燥，以给出作为白色固体的{(5S)-5-氨基-6-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸叔丁酯(175mg，97.6％)。1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 1.25-1.84(m,26H)1.85-2.03(m,1H)2.31-2.48(m,1H)3.04(t,J＝6.88Hz,2H)3.48-3.66(m,1H)4.32-4.52(m,1H)。ESI MS m/z：对C20H36N4O4计算为396.52，实测397.6(M+H)+。
3-[(2S)-6-氨基-2-(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)己酰氨基]双环[2.2.2]辛烷-2-甲酰胺(R06039-696、697、698)
将2-苄基-4-苯基丁酸(90mg，0.354mmol)和HATU(168mg，0.442mmol)溶解在DMF(6mL)中并且搅拌持续15分钟。添加在DMF(4mL)中的{(5S)-5-氨基-6-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸叔丁酯(175mg；0.441mmol)，并且将混合物搅拌持续10分钟。随后添加DIEA(114mg，0.88mmol)并且将混合物在室温搅拌过夜。添加饱和氯化钠水溶液(25mL)，并且将混合物搅拌持续30分钟。通过过滤去除产生的粘性沉淀，并且用水充分洗涤。将此残余物溶解在二氯甲烷-THF(70/30，30mL)中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，并且经硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解在少量二氯甲烷中。添加己烷并通过过滤去除产生的固体。固体然后通过制备型薄层色谱法纯化(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，50％CMA 80/50％二氯甲烷)，以给出作为白色固体的{(5S)-5-[(2-苄基-4-苯基丁酰氨基)氨基]-6-[(3-氨基甲酰基双环[2.2.2]辛-2-基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸叔丁酯(109mg，48.7％)。ESI MS m/z：对C37H52N4O5计算为632.83，实测634.0(M+H)+。将上述材料(103mg；0.163mmol)溶解在二氯甲烷(6mL)中。添加TFA(2mL)，并且将混合物在室温搅拌持续3.5小时。在减压下去除溶剂并且将残余物用二氯甲烷追赶若干次。将此残余物溶解在二氯甲烷-THF(70/30，30mL)中，用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，并且经硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂，并且将固体用二氯甲烷研磨，以给出作为白色固体的标题化合物(35.1mg，4种异构体的混合物，40.5％)。R06039-696：1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 0.83-1.13(m,1H)1.25-2.05(m,18H)2.30-2.47(m,1H)2.80(s,8H)4.14-4.43(m,2H)7.04-7.36(m,10H)。ESI MS m/z:对C32H44N4O3计算为532.72，实测533.3(M+H)+。蒸发来自上述研磨的滤液并且通过制备型薄层色谱法(二氧化硅，20×20cm板，1000微米，CMA 80)纯化，以给出两个主要级分。级分1(较小极性，15.2mg，两种异构体的混合物，17.5％)，R06039-697：1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 0.80(s,2H)1.07-1.72(m,18H)1.74-1.94(m,2H)2.13-2.30(m,1H)2.32-2.90(m,7H)4.01-4.32(m,2H)6.82-7.27(m,10H)。ESI MS m/z：对C32H44N4O3计算为532.72，实测533.1(M+H)+。级分2(较大极性，17.1mg，两种异构体的混合物，19.7％)，R06039-698：1H NMR(300MHz,甲醇-d4)d ppm 0.79(d,J＝7.16Hz,2H)1.08-1.70(m,18H)1.79(br.s.,2H)2.12-2.29(m,1H)2.33-2.89(m,7H)4.21(d,J＝6.97Hz,2H)6.92-7.22(m,10H)。ESI MS m/z：对C32H44N4O3计算为532.72，实测533.5(M+H)+。
R06039-715的合成
(6-氧代-6,11-二氢-5H-二苯并[b,e]氮杂-5-基)乙酸甲酯。
将5,11-二氢-6H-二苯并[b,e]氮杂-6-酮(300mg，1.43mmol)溶解在DMF(10mL)中，并且在冰浴中冷却。添加氢化钠(60％，75mg，1.88mmol)，并且将混合物在0℃搅拌持续10分钟，并且然后在室温搅拌持续30分钟。混合物再次冷却至0℃并在若干分钟内添加溴乙酸甲酯(548mg，3.58mmol)。在0℃搅拌持续30分钟后，允许混合物加温至室温并搅拌过夜。然后将混合物倾倒入冰水中并且用二氯甲烷提取若干次。合并有机层，经硫酸钠干燥并且在减压下去除溶剂。将残余物通过硅胶色谱法纯化(60％乙酸乙酯/40％己烷)，以给出作为无色固体的(6-氧代-6,11-二氢-5H-二苯并[b,e]氮杂-5-基)乙酸甲酯(401mg，99.5％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)d ppm3.44-3.67(m,1H)3.81(s,3H)4.31-4.54(m,1H)4.60-4.91(m,2H)7.01-7.46(m,7H)7.80(dd,J＝7.63,1.22Hz,1H)。ESI MS m/z：对C17H15NO3计算为281.31，实测282.3(M+H)+。
(6-氧代-6,11-二氢-5H-二苯并[b,e]氮杂-5-基)乙酸。将(6-氧代-6,11-二氢-5H-二苯并[b,e]氮杂-5-基)乙酸甲酯(391mg，1.39mmol)溶解在THF/MeOH/H2O(1:1:1，24mL)的混合物中。添加氢氧化锂(292mg，6.96mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续2.5小时。去除溶剂，并且将残余物再溶解在水中。然后用6N HCl将溶液酸化至pH 1。然后，混合物用氯仿提取若干次。合并有机层，用盐水洗涤且经硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂。将残余物吸收到少量二氯甲烷中并用己烷沉淀。然后作为整体蒸发此混合物并真空干燥，以给出作为白色固体的(6-氧代-6,11-二氢-5H-二苯并[b,e]氮杂-5-基)乙酸(305mg，82.2％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 3.75(d,J＝13.00Hz,1H)4.27(d,J＝12.81Hz,1H)4.45-4.87(m,2H)7.04-7.51(m,7H)7.60(d,J＝7.35Hz,1H)12.87(br.s.,1H)。ESI MS m/z：对C16H13NO3计算为267.28，实测268.3(M+H)+。
2-[2-(2-{10-氧代-9-氮杂三环[9.4.0.0^{3,8}]十五碳-1(11),3(8),4,6,12,14-六烯-9-基}乙酰氨基)乙酰氨基]环己烷-1-甲酰胺(R06039-715)
将(6-氧代-6,11-二氢-5H-二苯并[b,e]氮杂-5-基)乙酸(55mg，0.206mmol)和HATU(98mg，0.258mmol)溶解在DMF(3mL)中并搅拌持续10分钟。然后添加DIEA(66mg，0.514mmol)，并且在添加在DMF(3mL)中的2-(甘氨酰氨基)环己烷甲酰胺(51mg，0.256mmol)之前，将混合物搅拌持续另外的10分钟。将该溶液在室温搅拌过夜。添加饱和氯化钠水溶液(25mL)，并且将混合物搅拌持续30分钟。通过过滤去除产生的沉淀，并且用水充分洗涤。将此固体用二氯甲烷-甲醇混合物研磨，并真空干燥，以给出作为灰白色固体的R06039-715(49.0mg，51.3％)。研磨滤液的蒸发提供了第二批材料(14.5mg)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)d ppm 0.92-1.50(m,4H)1.51-1.89(m,4H)2.04-2.24(m,1H)3.56-3.83(m,4H)4.18-4.41(m,1H)4.63(br.s.,1H)6.70(br.s.,1H)6.87-7.03(m,1H)7.05-7.47(m,6H)7.60(d,J＝7.16Hz,2H)8.45(br.s.,1H)。ESI MS m/z：对C25H28N4O4计算为448.51，实测449.6(M+H)+。
EC50的功能性确定：在NPS受体处的功能性激动剂的识别是利用RD-HGA16细胞(Molecular Devices)完成的，这是一种稳定地表达混杂Gq蛋白Gα16的中国仓鼠卵巢细胞系。RD-HGA16细胞被工程化以稳定地过表达NPS受体。创建了稳定地表达两种人类NPS受体变体(NPS Ile107和Asn107)中的一种的两种单独的细胞系。在37℃，将细胞用钙敏感性染料(Molecular Devices)加载持续1小时，并且在单独的实验中测定化合物的固有活性，如使用FlexStation荧光板读数器由作为内部钙库(calcium store)的动员的标志的增加的荧光强度所测量的。化合物以8点全对数或半对数浓度曲线一式两份运行，以便确定测试化合物的EC50。每种化合物在至少三个独立的实验中被测试。用Prism软件(用于Windows的v5，GraphPad Software；San Diego，CA)将三参数逻辑斯谛方程拟合至浓度应答数据以计算EC50值。数据表示来自至少三个独立实验的平均值±SEM。表1列出了用于式I或式II的某些化合物的EC50。
表1
化合物 EC50(nM) R06039-636 94 R06039-641 169 R06039-655 2107 R06039-656 1020 R06039-657 901 R06039-675 213 R06039-682 894 R06039-691 93 R06039-693 77 R06039-696 91
_____________
虽然在本文中已经参考本发明的特定方面、特征和例证性的实施方案描述了本发明，但将理解的是，本发明的实用性没有因此被限制，而是扩展至并且涵盖许多其他变型、修改和可选择的实施方案，基于本文的描述，本公开内容的领域中的普通技术人员将会想到这些变型、修改和可选择的实施方案。相应地，如在下文中所要求保护的主题意图被广泛地解释和理解为包括在其精神和范围内的所有这样的变型、修改和可选择的实施方案。
序列表
<110> 研究三角协会
<120> 神经肽S受体(NPSR)激动剂
<130> 4424-113-PCT
<150> 62/318,042
<151> 2016-04-04
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人类(Human)
<400> 1
Ser Phe Arg Asn Gly Val Gly Thr Gly Met Lys Lys Thr Ser Phe Gln
1 5 10 15
Arg Ala Lys Ser
20