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1、(10)申请公布号 CN 102618643 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618643 A *CN102618643A* (21)申请号 201210077647.5 (22)申请日 2012.03.13 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (71)申请人 山东出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 地址 266002 山东省青岛市市南区瞿塘峡路 70 号 (72)发明人 李正义 祝素珍 贾俊涛 唐静 房保海 赵丽青 马维兴 (54) 发明名称 哈维氏弧菌的荧光定量 PCR 快速检测方法 (。
2、57) 摘要 本发明公开了一种哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 的 荧 光 定 量 PCR 快 速 检 测 方 法， 采 用 哈 维 氏 弧 菌 特 异 性 引 物 和 TaqMan 探 针，即 可 对 水 产 品 中 哈 维 氏 弧 菌 进 行 检 测 与 监 控。 其 中 上 游 引 物 Vharveyi-1 ： 5 -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3 ，下 游 引 物 Vharveyi-2 ： 5 -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3， 特异性 TaqMan 探针为 ： Vharveyi-3 ： 5 -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3。检。
3、测哈维氏 弧菌的方法包括细菌基因组 DNA 的提取、 哈维氏 弧菌的荧光定量 PCR 检测。其优点是快速、 特异 性强、 灵敏度高。另外， 本发明与普通 PCR 技术相 比， 不需要凝胶电泳拍照观察， 实现了检测流程一 体化封闭检测， 避免了 PCR 产物对实验室的污染。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1.一种快速检测哈维氏弧菌的荧光定量PCR方法， 其特征在于首先提取TCBS平板上的 可疑菌落的基因组 DNA 并稀释备用 ； 再利用哈维氏弧菌保守性强的。
4、基因组 DNA 序列设计特 异性引物和探针 ； 最后使用该引物和探针对待测水产品 TCBS 平板上可疑菌落的基因组 DNA 进行荧光定量 PCR 扩增和荧光信号的检测。其中所述的哈维氏弧菌特异性引物为 ： 上游引物 Vharveyi-1 ： 5 -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3， 下游引物 Vharveyi-2 ： 5 -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3 特异性 TaqMan 探针为 ： Vharveyi-3 ： 5 -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3 2. 根据权利要求 1 所述的快速检测哈维氏弧菌的荧光定量 PCR 方法， 其反应总体积 为25L，。
5、 包括提取的基因组DNA， 1L ； 10PCR buffer， 2.5L ； Mg2+， 2mmol/L ； Taq酶2U ； UNG酶1U ； dNTP 0.2mmol/L ； 哈维氏弧菌特异性引物200nmol ； TaqMan探针200nmol， 最后加 灭菌去离子水至 25L。 3. 根据权利要求 1 所述的快速检测哈维氏弧菌的荧光定量 PCR 方法， 其荧光定量 PCR 仪器的程序参数为 ： 94预变性 10min ； 94变性 15s， 60退火 1min， 同时收集 FAM 荧光， 40 个循环， 40 1min， 4保存。 权 利 要 求 书 CN 102618643 A 2。
6、 1/3 页 3 哈维氏弧菌的荧光定量 PCR 快速检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 的荧光定量 PCR 快速检测方法。 背景技术 0002 哈维氏弧菌 (Vibrio harveyi) 是革兰氏阴性菌， 菌体杆状， 极生单鞭毛运动， TCBS(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium) 平板上生长， 菌 落呈黄色或绿色， 嗜盐菌。哈维氏弧菌广泛存在于海洋环境中， 是条件致病菌。在适宜的条 件下， 它们大量繁殖成为优势菌， 通过消化道或者伤口感染， 致使伤口肌肉溃。
7、烂化脓以及内 脏器官的严重病变而导致海水动物发病死亡， 是水产养殖动物鱼、 虾的重要致病菌。 0003 现有哈维氏弧菌的检测方法主要有常规分离鉴定法、 普通 PCR 检测法、 胶体金免 疫层析试验法等。荧光定量 PCR 技术通过 TaqMan 探针与模板的特异性杂交来鉴别模板， 具 有很高的准确性， 假阳性低， 特异性好。目前尚未见用荧光定量 PCR 方法快速检测哈维氏弧 菌的报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种检测速度快、 灵敏度高的快速检测哈维氏弧菌的荧光定 量 PCR 方法。 0005 研究表明 ： 哈维氏弧菌携带的toxR基因是其毒力基因的表达调控基因。 本发明根 据 N。
8、CBI( 美国国立生物技术信息中心 ) 网站上公布的哈维氏弧菌 toxR 基因全序列， 以该特 异基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针， 并且采用荧光定量PCR快速技术检测哈 维氏弧菌， 具有快速、 特异性强、 灵敏度高等优点。 可以作为水产品中哈维氏弧菌的快速、 简 便、 准确的检测方法。 0006 本发明的技术解决方案是 ： 一种快速检测哈维氏弧菌的方法， 其特征在于有如下 步骤 ： 0007 (1) 首先提取待检样品 TCBS 平板上可疑菌落的基因组 DNA。 0008 (2) 荧光定量 PCR 反应液 (25L 体系 ) ： 0009 其中包括提取的基因组DNA， 1L ； 。
9、10PCR buffer， 2.5L ； Mg2+， 2mmol/L ； Taq酶 2U ； UNG 酶 1U ； dNTP 0.2mmol/L ； 哈维氏弧菌特异性引物 200nmol ； TaqMan 探针 200nmol， 最 后加灭菌去离子水至 25L。 0010 (3) 荧光定量 PCR 仪程序参数 ： 94预变性 10min ； 94变性 15s， 60退火 1min， 同时收集 FAM 荧光， 40 个循环， 40 1min， 4保存。 0011 其中哈维氏弧菌特异性引物为 ： 0012 上游引物 Vharveyi-1 ： 5 -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3， 00。
10、13 下游引物 Vharveyi-2 ： 5 -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3 0014 特异性 TaqMan 探针为 ： 0015 Vharveyi-3 ： 5 -TCCACTCTACGTAAAATGTTGA-3 说 明 书 CN 102618643 A 3 2/3 页 4 0016 荧光定量 PCR 反应结束后， 哈维氏弧菌能形成典型的 S 型扩增曲线， 而且 Ct 值 35。 0017 本发明提供了扩增哈维氏弧菌的特异性引物 Vharveyi-1、 Vharveyi-2 和 TaqMan 探针 Vharveyi-3， 从而提供了一种快速检测哈维氏弧菌的方法， 同现有检测技。
11、术相比具有 如下优势 ： 0018 快速性 ： 没有后处理， 不用电泳、 拍照， 实时缩短了反应时间。 0019 灵敏度高 ： 光谱技术和计算机技术的联合使用， 极大提高了检测的灵敏度。 0020 特异性强 ： 荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交， 而且同时强烈 依赖于靶模板的扩增， 二者缺一不可， 故不存在非特异性扩增现象。 0021 有效解决 PCR 污染 ： 整个过程均在单管中进行， 且勿需打开管盖， 避免了 PCR 产物 对实验室的污染。 具体实施方式 0022 首先无菌操作取25g待测水产品， 充分剪碎， 放入盛有225mL灭菌海水的灭菌容器 中， 进行 10 倍梯度稀释。
12、后， 选择 2 3 个适当稀释度， 各以 0.1mL 涂布到 TCBS 平板上， 在 36 1培养箱中， 倒置培养 24h3h。挑取 5 个可疑菌落提取基因组 DNA 并稀释备用。 如果平板上的可疑菌落少于 5 个， 则应该全部挑取进行基因组 DNA 提取并稀释备用。 0023 最后进行荧光定量 PCR 反应， 每个荧光定量 PCR 反应总体积为 25L， 其中包括提 取的基因组 DNA， 1L ； 10PCR buffer， 2.5L ； Mg2+， 2mmol/L ； Taq 酶 2U ； UNG 酶 1U ； dNTP 0.2mmol/L ； 哈维氏弧菌特异性引物200nmol ； Ta。
13、qMan探针200nmol， 最后加灭菌去离子水至 25L。设置荧光定量 PCR 仪器的程序参数为 ： 94预变性 10min ； 94变性 15s， 60退火 1min， 同时收集 FAM 荧光， 40 个循环， 40 1min， 4保存。 0024 其中哈维氏弧菌特异性引物为 ： 0025 上游引物 Vharveyi-1 ： 5 -GAGTTCGTATGGCGGGAGC-3， 0026 下游引物 Vharveyi-2 ： 5 -GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG-3 0027 特异性 TaqMan 探针为 ： 0028 Vharveyi-3 ： 5 -TCCACTCTACGTAAA。
14、ATGTTGA-3 0029 荧光定量 PCR 反应结束后， 哈维氏弧菌能形成典型的 S 型扩增曲线， 而且 Ct 值 35。 0030 核苷酸序列表 0031 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 0032 哈维氏弧菌的荧光定量 PCR 快速检测方法 0033 3 0034 1 0035 19 0036 DNA 0037 人工序列 0038 prim_bind 0039 (1).(19) 说 明 书 CN 102618643 A 4 3/3 页 5 0040 1 0041 GAGTTCGTATGGCGGGAGC 19 0042 2 0043 21 0044 DNA 0045 人工序列 0046 prim_bind 0047 (1).(21) 0048 2 0049 GTGCTGCTTCAGAAGATAGTG 21 0050 3 0051 21 0052 DNA 0053 人工序列 0054 prim_bind 0055 (1).(22) 0056 3 0057 TCCACTCTACGTAAAATGTTGA 22 说 明 书 CN 102618643 A 5 。