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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310031703.6 (22)申请日 2013.01.28 CGMCC No.6789 2012.11.07 CGMCC No.6790 2012.11.07 CGMCC No.6791 2012.11.07 CGMCC No.6792 2012.11.07 C12N 11/08(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C02F 101/32(2006.01) C02F 103/08(2006.01) (73)专利权人 厦门大学 地址 36。
2、1005 福建省厦门市思明南路 422 号 (72)发明人 田蕴 郭倩 范雪怡 于杨阳 郑天凌 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 ( 普通合伙 ) 35200 代理人 马应森 CN 101988053 A,2011.03.23, 摘要， 权利要 求 1-6， 说明书第 12-21 段， 实施例 . CN 102527712 A,2012.07.04, 全文 . US 2005/0244944 A1,2005.11.03, 全文 . Jirapat Chanthamalee and Ekawan Luepromchai.Isolation and application of Gor。
3、donia sp. JC11 for removal of boat lubricants.J.Gen.Appl.Microbiol .2012, 第 58 卷 ( 第 1 期 ),19-31. Eugene Quek et al.Rhodococcus sp.F92 immobilized on polyurethane foam shows ability to degrade various petroleum products.Bioresource Technology .2005, 第 97 卷 ( 第 1 期 ),32-38. (54) 发明名称 聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法。
4、 (57) 摘要 聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法， 涉及 一组石油降解菌群的固定化。提供一种可提高石 油降解率的聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方 法。将聚氨酯泡沫制粒， 经过沸水煮沸， 除去聚 氨酯泡沫中含有可能对细胞有害的聚醚类物质， 烘干， 再与 2216E 培养基共同灭菌， 接入石油降解 菌群进行摇瓶培养， 石油降解菌群进入或依附于 聚氨酯泡沫内壁生长， 形成含高密度石油降解菌 群的聚氨酯泡沫。采用一定密度及大小的具有强 吸附能力、 无毒副污染、 传质传能效果良好且方便 廉价的聚氨酯泡沫吸附固定化石油降解菌群， 使 其在实际海洋石油污染治理中的应用性能显著提 高， 且使用过后的聚氨酯泡沫。
5、通过特定处理可实 现回收利用， 具有良好的经济效益。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马俊凯 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103114084 B (45)授权公告日 2015.04.01 CN 103114084 B 1/1 页 2 1.聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1) 将聚氨酯泡沫制粒， 经过沸水煮沸， 除去聚氨酯泡沫中含有可能对细胞有害的聚醚 类物质， 烘干 ； 所述聚氨酯泡沫的密度为 65kg m-3； 所述将聚氨酯泡沫制。
6、粒的粒径为 4 6mm ； 所述沸水煮沸的时间在 30min 以上 ； 所述烘干的温度为 50 70 ； 2) 将经过制粒、 煮沸、 烘干的聚氨酯泡沫与 2216E 培养基共同灭菌， 接入石油降解菌 群进行摇瓶培养， 石油降解菌群进入或依附于聚氨酯泡沫内壁生长， 形成含高密度石油降 解菌群的聚氨酯泡沫 ； 所述 2216E 培养基为 ： 蛋白胨 5g， 酵母提取物 1g， 磷酸高铁 0.1g， pH 7.6 7.8， 陈海水定容到 1L ； 所述接入石油降解菌群的接种量为菌液 OD600 0.1 0.3 的量接入 ； 所述摇瓶的条件为 150r/min， 28下摇瓶培养 16 24h ； 所 。
7、述 石 油 降 解 菌 群 由 交 替 单 胞 菌 (Alteromonas sp.)12C1、潮 汐 杆 菌 (Aestrariibacter sp.)12C24、新 鞘 氨 醇 菌 (Novosphingobium sp.)F2 和 芽 孢 杆 菌 (Bacillus sp.)KB组成， 交替单胞菌(Alteromonas sp.)12C1、 潮汐杆菌(Aestrariibacter sp.)12C24、 新鞘氨醇菌 (Novosphingobium sp.)F2 和芽孢杆菌 (Bacillus sp.)KB 均于 2012 年 11 月 07 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生。
8、物中心， 保藏中心登记 入册编号分别为 ： CGMCC No.6789、 CGMCC No.6790、 CGMCC No.6791、 CGMCC No.6792。 权 利 要 求 书 CN 103114084 B 2 1/5 页 3 聚氨酯泡沫固定石油降解菌群的方法 技术领域 0001 本发明涉及一组石油降解菌群的固定化， 尤其涉及一种采用聚氨酯泡沫为载体固 定化石油降解菌群的方法， 用以抵抗海水的冲刷与稀释的干扰、 提高对石油的降解能力。 背景技术 0002 在全球经济迅速发展和人口激增的情况下， 海洋对人类实现可持续发展起到了重 要的作用。 但随着海洋资源的开发和使用， 海洋也受到了严重的。
9、污染， 其中石油污染表现得 尤为突出。海上石油及其产品污染是最重要的生态学灾难性污染之一， 沿海海洋石油开采 和管道化以及商船运输都是潜在的流动污染源。石油在海面会形成一层油膜， 隔绝大气与 海水的气流交换， 并减弱太阳光透入海水的能量。 这种耗氧和隔绝会导致海水严重缺氧， 并 影响海洋绿色植物的光合作用。 海洋石油污染会导致鱼贝藻类死亡， 海滨生物结构破坏， 海 鸟饲饵消失。 而海洋生物多样性减少和海洋生物体内致癌物浓缩蓄积给环境和人类带来的 损害则更是无法估算。 海洋石油污染， 特别是一些突发的溢油事件一旦发生， 如能及时采取 有效措施， 损失就会小得多。 在各种油污染的清理技术中， 生物。
10、修复技术以其高效安全而受 推崇。 这种技术的创新之处是利用微生物和其他生物将存在于海洋中的石油污染物降解为 二氧化碳和水， 或转化为无害物质， 可以对大面积的污染区域进行治理。 0003 海洋环境中存在着丰富的降解石油的微生物， 在溢油后微生物数量迅速 增加 （9Yakimov， M.M.,Timmis,K.N.,Golyshin,P.N.Obligate oil-degrading marine bacteriaJ.Current Opinion in Biotechnology， 2007,18(3):257-266.） ， 许多石油烃化合物能被单一微生物或一个微生物群体部分或全部降解 （。
11、10McKew， B.A.,Coulon,F.,Osborn,A.M.,Timmis,K.N.,McGenity， T.J.Determining the identity and roles of oil-metabolizing marine bacteria from the Thames estuary， UKJ. Environmental Microbiology， 2007,9(1):165-176.） 。但是与实验室条件下的纯培养 相比， 石油烃在自然环境中的降解要缓慢得多， 受低水温、 寡营养、 海水的冲刷以及石油 组分非常复杂等不利因素的影响， 实际上土著微生物对石油的降解。
12、效率非常低下。已 有的研究多集中在投加外源石油降解菌或改变环境因子来加速石油的微生物降解， 如 添 加 营 养 盐 （11Oh, Y.S.,Sim,D.O.,Kim,S.K.Effects of nutrients on crude oil biodegradation in the upper intertidal zoneJ.Marine Pollution Bullet in,2001,42(12):1367-1372.） 、 接种各种可降解污染物的微生物 （12T,H.,H,T.,M,K. Bioremediation on the shore after an oil spillfr。
13、om the Nakhodka in the sea of Japan.Chemistry and characteristics of heavy oil loaded on the Nakhodka and biodegradation tests by a bioremediation agent with microbiological cultures in the laboratoryJ.Marine Pollution Bulletin,2000,40(4):308-314.）等。由于 石油成分复杂， 包括不同碳链长度的链烷烃、 环烷烃、 芳香烃、 沥青质等， 接种单一的微生 物。
14、无法将残余的石油完全降解， 不同的微生物对不同的石油成分有不同的降解能力， 或 者在降解中起到不同的作用。因此接种混合的微生物对石油污染的控制更有效， 原因是 说 明 书 CN 103114084 B 3 2/5 页 4 微生物间存在一定的协同作用且菌群对石油的降解谱较广。目前， 国内外对这方面的研 究尚处于起步阶段 （13 崔志松 , 郑立 , 杨佰娟 , 刘倩 , 高伟 . 两种海洋专性解烃菌降 解石油的协同效应 J. 微生物学报 ,2010,50(3):350-359 ； 14Wang,H.,Xu,R.,Li,F. Efficient degradation of lube oil by。
15、 a mixed bacterial consortiumJ.Journal ofEnvironmental Sciences-China,2010,22(3):381-388.） ， 对石油降解菌群的构建仅仅 局限于简单的混合， 缺乏一定的理论基础。另外， 在开放的海面上由于风浪、 潮流等作用很 难将营养和微生物与油污紧密接触， 接种的微生物或添加的营养盐很快就被稀释或冲刷 掉。 如何解决这一难题， 使微生物降解保持在一个最佳的环境中， 是目前国内外海洋石油污 染生物修复技术面临的主要挑战。解决这一问题的关键就是接种 “固定化微生物” 。 0004 微生物细胞固定化技术由于其稳定性高、 操作。
16、简便， 可固定的微生物细胞密度大 并且可在放大规模下使用等优点。微生物细胞被固定化后细胞密度高、 反应速度快、 耐 毒害能力强、 产物分离容易、 能实现连续操作， 可以大大提高生产能力等优势， 因此在近 几十年来固定化细胞技术得到了迅速的发展和广泛的应用。聚氨酯 （polyurethane） 是 主链含 -NHCOO- 重复结构单元的一类聚合物， 由异氰酸酯 （单体）与羟基化合物聚合而 成。由于含强极性的氨基甲酸酯基， 不溶于非极性基团， 具有良好的耐油性、 韧性、 耐磨 性、 耐老化性和粘合性。通过不同原料可制得适应较宽温度范围 （-50 150） 的材料， 包括弹性体、 热塑性树脂和热固性。
17、树脂 ； 高温下不耐水解， 亦不耐碱性介质。用聚氨酯泡 沫 （Polyurethane Foam， PUF）作为固定化载体时， 其孔径远大于细胞尺寸， 内外表面都 能作为固定化吸附界面 ； 空隙率高， 便于传质 ； 吸油性能良好， 能够增大石油与微生物的 接触面积 ； 载体为化学惰性， 对细胞不具毒害作用 （15Oh,Y.-S.,Maeng,J.,Kim,S.-J. Use of microorganism-immobilized polyurethane foams to absorb and degrade oil on water surfaceJ.Appl microbiol Biot。
18、echnol,2000,54:418-423 ； 16 Quek,E.,Ting,Y.-P.,Tan,H.M.Rhodococcus sp.F92immobilized on polyurethane FOam shows ability to degrade various petroleum productsJ.Bioresource Technology， 2006,97:32-38.） ； 聚氨酯泡沫的预处理方便， 价格也较为低廉， 而且其密度比水小， 能够浮 在海面上方， 对石油烃和微生物有较好的吸附作用。上述特点使聚氨酯泡沫成为海洋石油 污染生物修复的首选固定化材料。 发明内容 0。
19、005 本发明的目的在于提供一种可提高石油降解率的聚氨酯泡沫固定石油降解菌群 的方法。 0006 本发明包括以下步骤 ： 0007 1） 将聚氨酯泡沫制粒， 经过沸水煮沸， 除去聚氨酯泡沫中含有可能对细胞有害的 聚醚类物质， 烘干 ； 0008 在步骤 1） 中， 所述聚氨酯泡沫的密度可为 65kg m-3； 所述将聚氨酯泡沫制粒的粒 径可为 46mm ； 所述沸水煮沸的时间可在 30min 以上， 所述烘干的温度可为 50 70。 0009 2） 将经过制粒、 煮沸、 烘干的聚氨酯泡沫与 2216E 培养基共同灭菌， 接入石油降解 菌群进行摇瓶培养， 石油降解菌群进入或依附于聚氨酯泡沫内壁生。
20、长， 形成含高密度石油 降解菌群的聚氨酯泡沫。 说 明 书 CN 103114084 B 4 3/5 页 5 0010 在步骤 2） 中， 所述 2216E 培养基可为 ： 蛋白胨 （Peptone） 5g， 酵母提取物 （Yeast Extract） 1g， 磷酸高铁 0.1g， pH7.6 7.8， 陈海水定容到 1L， 121灭菌 20min ； 所述接入石 油降解菌群的接种量为菌液 OD600=0.1 0.3 的量接入 ； 所述摇瓶的条件可为 150r/min， 28下摇瓶培养1624h。 本发明将聚氨酯泡沫制粒后， 再经过沸水煮沸， 以除去泡沫中含 有可能对细胞有害的聚醚类物质， 之。
21、后烘干。经过处理的聚氨酯泡沫， 凭借它孔隙大、 吸附 能力强、 无毒副污染、 传质传能效果良好等特点， 可以作为安全有效的吸附载体， 它能在约 2h 内吸附已生长的石油降解菌群 2.41010cells g-1， 并且在实验室摇瓶条件下， 固定化石 油降解菌群对柴油经过 2 周的降解率最高为 63%。 0011 聚氨酯泡沫在震荡中吸附游离石油降解菌群的同时， 其表面也被磨成近似球状， 间接地增加其比表面积， 也提高了其吸附能力。 使用过的聚氨酯泡沫可通过反复挤压清洗、 超声波清洗、 去离子水清洗及煮沸后烘干的方法进行回收再利用， 这也降低了使用成本， 提 高了该固定方法的经济效益， 为解决实际。
22、石油降解菌群投入海洋中效率低下的难题提供思 路。聚氨酯泡沫以石油降解菌群作为吸附用细菌， 将其吸附在聚氨酯泡沫内壁或孔隙中生 长， 防止其流失， 同时为其提供了一个相对稳定的生长环境， 使其发挥其最佳的生物功效。 0012 石油降解菌群的构建， 将分离得到的具有柴油降解能力的单菌进行系统发育分 析， 并采 用气相色谱质谱联用技术测定单菌对柴油的降解率， 根据各单菌对柴油降解率的 高低和降解谱及其亲缘关系， 构建了具有高效降解柴油能力的菌群。构建后的菌群对柴油 的降解率较之单菌对柴油的降解率有显著提高。 0013 本发明的有益效果是， 采用一定密度及大小的具有强吸附能力、 无毒副污染、 传质 传。
23、能效果良好且方便廉价的聚氨酯泡沫吸附固定化石油降解菌群， 使其在实际海洋石油污 染治理中的应用性能显著提高， 而且使用过后的聚氨酯泡沫通过特定处理可实现回收利 用， 具有良好的经济效益。 0014 以聚氨酯泡沫作为石油降解微生物细胞的固定化载体， 这种材料通过吸附残余在 海水表面的石油为石油降解菌提供碳源， 通过对降解石油的混合微生物细胞的固定可以同 时降解多种石油组分。 相当于建立一个流动、 漂浮的生物反应器， 同时又能克服或抵消海水 的稀释与冲刷的影响， 维持营养物和石油降解微生物在油水界面， 使微生物降解保持在一 个最佳的环境中， 进而快速有效地消除油污染。 附图说明 0015 图 1 。
24、为聚氨酯泡沫固定的石油降解菌群的荧光显微图片 （400） 。 0016 图 2 为未吸附石油降解菌群的空载体内部的扫描电镜照片 (70)。 0017 图 3 为吸附石油降解菌群的载体内部的扫描电镜照片 (650)。 0018 图 4 为聚氨酯泡沫固定菌群种类的分子指纹图谱。在图 4 中， a 为游离石油降解 菌群 ； b 为聚氨酯泡沫固定的石油降解菌群。 0019 图 5 为新的和重复使用的聚氨酯泡沫对石油降解菌群吸附性能的比较。在图 5 中， 横坐标为新的和重复使用的聚氨酯泡沫， 纵坐标为聚氨酯泡沫固定化石油降解菌群数 量 (cells/g) ； a 为 immobilized bacter。
25、ia， b 为 free bacteria。 0020 图 6 为不同添加量的聚氨酯泡沫固定石油降解混合菌群的比较。在图 6 中， 横坐 标为聚氨酯泡沫添加的质量 （g） ， 纵坐标为聚氨酯泡沫吸附的石油降解菌群数量 （cells） 。 说 明 书 CN 103114084 B 5 4/5 页 6 0021 图 7 为不同质量聚氨酯泡沫固定化石油降解菌群与游离菌群对柴油降解率的比 较。在图 7 中， 横坐标为聚氨酯泡沫添加量 （g） ， 纵坐标为对柴油的降解率 （%） 。 具体实施方式 0022 以下的实施例是对本发明的进一步说明， 但本发明不限于下述实施例。 0023 1、 石油降解菌液的制。
26、备 0024 将 活 化 后 的 菌 液 交 替 单 胞 菌 （Alteromonassp.） 12C1、潮 汐 杆 菌 （Aestuariibactersp.） 12C24、新 鞘 氨 醇 菌 （Novosphingobium sp.） F2 和 芽 孢 杆 菌 （Bacillus sp.） KB， 按终浓度为 OD600=0.3 的接种量接入含 100mL2216E 培养基的 250mL 锥形瓶中， 150r/min， 28摇瓶培养 1624h。交替单胞菌 （Alteromonassp.） 12C1、 潮汐 杆菌 （Aestrariibactersp.） 12C24、 新鞘氨醇菌 （Nov。
27、osphingobium sp.） F2 和芽孢杆菌 （Bacillus sp.） KB 均于 2012 年 11 月 07 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心， 地址为北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101， 保藏中心 登记入册编号分别为 ： CGMCCNo.6789、 CGMCC No.6790、 CGMCC No.6791、 CGMCC No.6792。 0025 2、 聚氨酯泡沫的制备 0026 将聚氨酯泡沫剪成不同大小的立方体， 使用前用去离子水清洗去除杂质， 沸水煮 30min 以上， 60烘干至恒重， 灭菌备用。 0027 聚氨酯泡沫。
28、载体使用后回收处理， 将聚氨酯泡沫反复挤压清洗数次后， 超声波清 洗 1h， 经去离子水清洗， 煮沸 30min 后烘干， 回收备用。 0028 3、 聚氨酯泡沫对石油降解菌群的固定 0029 取一定质量预处理过的聚氨酯泡沫加入到含有50mL2216E培养基的250mL三角瓶 中， 共同灭菌， 接入对数生长期的菌群， 使接种量在 109cells/mL 左右， 150rpm， 28摇床中 振荡培养， 获得固定化菌体备用。 2216E培养基为 ： 蛋白胨 （Peptone） 5g， 酵母提取物 （Yeast Extract） 1g， 磷酸高铁 0.1g， pH7.6 7.8， 陈海水定容到 1L。
29、， 121灭菌 20min。 0030 4、 固定化石油降解菌群对柴油的降解能力检测 0031 将石油降解菌群吸附于聚氨酯泡沫上， 固定 2h 后， 将吸附有石油降解菌群的聚氨 酯泡沫转移至含有 1%（V/V） 0 号柴油的 MM2 培养基中， 28， 150rpm 摇床中避光培养两个 周， 二氯甲烷萃取， 气相色谱质谱联用技术测定其对柴油的降解率。所述 MM2 培养基为 ： 硫 酸亚铁 0.278mg， 1 摩尔磷酸二氢钾溶液 0.1mL， 硫酸铵 2.3g， 环糊精 10g， 陈海水 750mL， 蒸 馏水 250mL， pH7.2， 121灭菌 20min。 0032 图 1 显示的是固。
30、定的石油降解菌群的荧光显微图片， 菌体大小不一， 形态各异， 说 明菌群多样性丰富， 且能够被吸附于聚氨酯载体表面的菌株种类较多。 0033 图 2 表示空的聚氨酯泡沫载体具有疏松多孔的特性， 孔径大小和粗糙程度各异， 孔径与细胞尺寸相比较大， 内外表面都能够作为固定化吸附的界面， 能够作为理想的固定 化载体材料。 0034 图 3 表示聚氨酯泡沫对石油降解混合菌群有很好的吸附能力， 能够吸附大量的菌 群于其 内外表面。 0035 图 4 对于石油降解菌群， 聚氨酯泡沫固定的菌群与游离菌群在群落结构上完全一 致， 说明聚氨酯泡沫对上述 4 种石油降解菌都有良好的固定化能力 ； 且条带亮度也基本。
31、一 说 明 书 CN 103114084 B 6 5/5 页 7 致， 可以初步判定 4 种石油降解菌在降解石油过程中长势良好且一致。 0036 图 5 为新的和重复使用的聚氨酯泡沫对石油降解菌群吸附性能的比较。由图可 知新的聚氨酯泡沫的吸附菌量 （1.71010个） 略高于重复使用的聚氨酯泡沫的吸附菌量 （1.51010个） 。新的聚氨酯泡沫的固定化率为 49.71%， 与重复使用的聚氨酯泡沫的固定化 率 49.01% 相差无几。 0037 图 6 为不同添加量的聚氨酯泡沫固定石油降解混合菌群的比较， 结果显示聚氨酯 泡沫的添加量对固定的总菌数有较大影响， 添加量越大则固定的菌数越多， 反之亦然。 0038 图 7 是不同质量聚氨酯泡沫固定石油降解菌群与游离菌群对柴油降解率的比较， 结果表明游离菌群对柴油的降解率为 54%， 与 0.7g PUF 固定的菌群降解率相近 （56%） ， 而经 0.5gPUF 固定的菌群降解率仅为 38%， 1.0g PUF 固定的菌群降解率升高至 63%。 说 明 书 CN 103114084 B 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103114084 B 8 2/2 页 9 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103114084 B 9 。