技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的 重组毕赤酵母菌株及其构建方法，以及一种由该重组毕赤酵母菌株制备的混 合酶制剂。
技术背景
淀粉作为植物的重要贮藏物质，是世界上含量最丰富的物质之一。淀粉 酶是指能够水解淀粉生成低分子量多聚糖或者单糖的一类糖苷酶。淀粉酶广 泛应用于淀粉水解或者其发酵工业，比如乙醇生产、淀粉糖生产、啤酒酿造 等。当前工业应用中最重要的淀粉酶有葡萄糖淀粉酶、α-淀粉酶、普鲁兰酶等。
葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3)，又称糖化酶，是一种外切酶，作用于麦芽寡 糖的非还原末端，切割α-1,4糖苷键生成葡萄糖；同时也可以作用于α-1,6糖 苷键，但水解速率远远低于水解α-1,4糖苷键的速率。α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)， 又称液化酶，作用于淀粉、糖原以及其他多糖类物质，以随机的方式水解分 子内的α-1,4糖苷键，产生麦芽寡糖和少量葡萄糖。由于α-淀粉酶水解淀粉形 成更多的非还原末端，为葡萄糖淀粉酶作用提供更多底物，因此两者在水解 淀粉过程中存在协同作用，可以促进葡萄糖的生成。
淀粉水解工业中的许多步骤，比如淀粉糖化、麦芽糖的生产，在温度稍 高的条件下操作显然更具有优势，比如更高的反应速率，较低的染菌风险等。 但是当前广泛应用的糖化酶和液化酶普遍存在高温条件不稳定易失活的缺 陷，因此使得生产成本大大增加。虽然也有很多研究报道通过菌种筛选寻找 新型耐热葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，以及采用基因克隆技术进一步获得其表 达基因，但是迄今为止都很少有新型耐热葡萄糖淀粉酶或者α-淀粉酶真正用 于产业化，主要是因为大多数新型酶都存在要么活力太低要么表达水平过低 的缺陷。随着越来越多的高效异源表达系统被开发，通过异源表达以提高新 型葡萄糖淀粉酶或者α-淀粉酶的表达水平，成为耐热新型酶制剂产业化应用 的有效方法之一。
虽然现有技术中也有报道公开将黑曲霉葡萄糖淀粉酶和大麦α-淀粉酶同 时表达在酿酒酵母中，但是这种研究却是为了赋予该菌种以直接降解淀粉产 酒精的能力，改进后的酿酒酵母菌株具有了淀粉水解酶的活力，但是却仅限 应用于酿酒工业。因此，一种能够同时高效表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的 其他种类的异源表达系统，并且可用于淀粉的液化和糖化领域，将具有更大 的应用潜力和价值。然而至今都没有人将葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶同时表达 在毕赤酵母中以进行相关研究，或者制备这两种酶的混合酶制剂。
发明内容
本发明的目的是构建一种新型的共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组 毕赤酵母菌株，及其构建方法，以及一种由该重组毕赤酵母菌株制备的混合 酶制剂。
本发明提供一种共表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株， 所述重组毕赤酵母菌株同时含有来自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉酶基因和α-淀 粉酶基因，其基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
所述重组毕赤酵母菌株能够同时分泌表达葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶。
本发明还提供一种如上所述的重组毕赤酵母菌株的构建方法，所述构建 方法的步骤如下：1）以微小毛霉菌基因组为模板，克隆得到葡萄糖淀粉酶 （Gla）基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，以pPIC9K为载体，构建重组表 达载体pPIC9KGla，转入毕赤酵母KM71，得到重组毕赤酵母KM71/9KGla； 2）以微小毛霉菌基因组为模板，克隆得到α-淀粉酶（Amy）基因，其序列如 SEQ ID NO.2所示，以pPICZα为载体，构建重组表达载体pPICZαAmy；3） 将所述重组表达载体pPICZαAmy转入重组毕赤酵母KM71/9KGla，通过抗生 素筛选，得到同时含有葡萄糖淀粉酶基因和α-淀粉酶基因的重组毕赤酵母菌 株KM71/9KGla-ZαAmy。
步骤1）中从微小毛霉菌基因组克隆所述葡萄糖淀粉酶（Gla）基因的上、 下游引物序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
步骤2）中从微小毛霉菌基因组克隆所述α-淀粉酶（Amy）基因的上、下 游引物序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供一种混合酶制剂，所述混合酶制剂由一种共表达葡萄糖淀 粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母菌株制备，包括葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶。
所述混合酶制剂的最适作用pH为4-5，优选为5。
所述混合酶制剂的最适作用温度为60-80℃，优选70℃。
本发明涉及到的葡萄淀粉酶为从微小毛霉菌中克隆得到，构建毕赤酵母 重组表达载体pPIC9KGla，转入毕赤酵母KM71，通过摇瓶培养诱导表达，最 高葡萄糖淀粉酶酶活力达到1237U/ml，蛋白表达水平达到0.762mg/ml。
本发明涉及到的α-淀粉酶基因为本实验室从微小毛霉菌中克隆获得，构 建毕赤酵母重组表达载体pPICZαAmy，转入毕赤酵母KM71，通过摇瓶培养 诱导表达，最高α-淀粉酶酶活力达到2927U/ml，蛋白表达水平达到 0.236mg/ml。
本发明涉及到的同时携带微小毛霉葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶基因的重组 毕赤酵母表达系统KM71/9KGla-ZαAmy，通过摇瓶培养诱导表达，蛋白表达 水平达到0.939mg/ml；最高葡萄糖淀粉酶活力达到2218U/ml，相比只携带葡 萄糖淀粉酶基因的重组毕赤酵母提高79%；最高α-淀粉酶酶活力达到 8285U/ml，相比携带α-淀粉酶基因的重组毕赤酵母提高183.1%。
本发明得到的共表达微小毛霉葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤酵母 菌株的应用优势在于：
（1）相比携带微小毛霉葡萄淀粉酶基因的重组毕赤酵母，虽然蛋白表达 水平提高了23.2%，但葡萄糖淀粉酶酶活力却相应提高了79%；而相比携带 微小毛霉α-淀粉酶基因的重组毕赤酵母，α-淀粉酶酶活力也相应提高了183%。
（2）本发明涉及的葡萄糖淀粉酶或α-淀粉酶均来源于微小毛霉，生化性 质，包括最适作用温度和最适作用pH均相近，因此有利于在淀粉水解过程中 在相同条件下共同作用。
（3）在淀粉水解过程中，相比葡萄糖淀粉酶单独作用，可以提高淀粉的 水解效率，并且减少逆反应的发生；相比α-淀粉酶淀粉酶单独作用，产物葡 萄糖的比例得到提高。
采用本发明提供的共表达微小毛霉葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的重组毕赤 酵母菌株制备两种酶的混合酶制剂，有利于提高淀粉的水解效率，降低成本， 因此具有较好的应用前景。
附图说明
图1示出了重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla和KM71/9KGla-ZαAmy分别 在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选的结果；
图2示出了重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla、KM71/ZαAmy、 KM71/9KGla-ZαAmy分别产淀粉酶活力的验证；
图3示出了重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla和KM71/9KGla-ZαAmy分别 经过摇瓶培养诱导表达的葡萄糖淀粉酶活力酶活曲线；
图4示出了重组毕赤酵母菌株KM71/ZαAmy和KM71/9KGla-ZαAmy分 别经过摇瓶培养诱导表达的α-淀粉酶活力酶活曲线；
图5示出了重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla、KM71/ZαAmy、 KM71/9KGla-ZαAmy分别经过摇瓶培养诱导表达的蛋白SDS-PAGE电泳图 谱；
图6示出了混合酶制剂中葡萄淀粉酶和α-淀粉酶的酶活力与作用pH的关 系曲线图；
图7示出了混合酶制剂中葡萄淀粉酶和α-淀粉酶的酶活力与作用温度的 关系曲线图；
图8示出了混合酶制剂、α-淀粉酶以及葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的产 物薄层层析图谱。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明保护的范围。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或 者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1.重组表达载体pPIC9KGla的构建及其转化
1.1引物设计
R.pGAf（SEQ ID NO.3）：ATGCGTTATGCAACCCCGC
R.pGTr（SEQ ID NO.4）：GGCGTTATTTATTACCCTCTTTTGACC
R.pGEf（SEQ ID NO.5）：GGAATTCATGCGTTATGCAACCCCGC
R.pGNr（SEQ ID NO.6）：TTGCGGCCGCTTACCCTCTTTTGACCA
1.2微小毛霉葡萄糖淀粉酶cDNA序列扩增
以微小毛霉(Rhizomucor pusillus,从北京的中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心ＣＧＭＣＣ购得,菌种编号3.204)cDNA第一链为模板，以 R.pGAf/R.pGTr引物进行PCR扩增，克隆得到葡萄糖淀粉酶（Gla）基因，其 序列如SEQ ID NO.1所示。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30 s，72℃2min，20个循环（每个循环退火温度降低0.5℃）；94℃30s，54℃ 30s，72℃2min，15个循环；72℃10min，保存在4℃。将PCR产物进行琼 脂糖凝胶电泳，回收后连接pMD19-T Simple Vector，菌落PCR验证阳性克隆 并测序。
1.3重组表达载体pPIC9KGla的构建
以连有来自微小毛霉菌的葡萄糖淀粉cDNA序列的pMD19-T Simple Vector为模板，用引物R.pGEf/R.pGNr进行PCR扩增；将PCR产物用EcoRI 和NotI（购自Fermentas）进行酶切，然后与同样经EcoR I、NotⅠ酶切的酵 母表达载体pPIC9K（来源Invitrogen）连接，转化大肠杆菌DH5α（来源天根 生化），PCR验证阳性克隆并测序；若测序结果显示未发生移码等碱基突变， 则表明构建的重组表达载体pPIC9KGla可用。
1.4毕赤酵母感受态细胞的制备
(1)将毕赤酵母KM71接种YPD液体培养基，30℃培养至OD 1～2A(600nm)，用于制备感受态细胞；
(2)将培养液6000rpm，4℃离心3min，收集菌体；
(3)用8ml缓冲液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mM pH7.5 Tris-HCl)重悬菌体，室温静置30min；
(4)6000rpm，4℃离心5min，收集菌体；
(5)用2～3ml1M山梨醇洗涤菌体，重复两次；
(6)用适量1M山梨醇重悬菌体，使细胞浓度为1010个/ml，静置冰上，待 用。
1.5重组表达载体pPIC9KGla的转化
(1)将100ul重组质粒pPIC9KGla用SacI线性化酶切，用Takara核酸共沉 剂进行浓缩，用10ul的无菌超纯水溶解质粒；同时制备两份；
(2)将10ul的上述质粒与100ul的酵母感受态细胞KM71混合，转入预冷 的电极杯中，进行电击，迅速加入1ml预冷的1M山梨醇，转移至30℃培养 箱中静置1h；涂布MD平板；30℃培养箱培养。
1.6高拷贝转化子筛选
用无菌水将MD平板上长出的转化子洗下，涂布含有不同浓度G418抗生 素的YPDS平板，筛选含有高拷贝葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母转化子 KM71/9KGla。
实施例2.重组表达载体pPICZαAmy的构建及其转化
2.1引物设计
R.pA-f（SEQ ID NO.7）：ATGAAATTCAGCATCTCTCTCTCGG
R.pA-r（SEQ ID NO.8）：TTAAGCAGAGGTGAAGATAGCGGA
R.pAEf（SEQ ID NO.9）：GAATTCAGCCCTTTGCCCCAACAGCA
R.pANr（SEQ ID NO.10）：TTGCGGCCGCTTAAGCAGAGGTGAAGATAG
2.2微小毛霉α-淀粉酶cDNA序列扩增
以微小毛霉第一链cDNA为模板，以引物R.pA-f/R.pA-r进行PCR扩增， 克隆得到α-淀粉酶（Amy）基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。PCR反应条 件：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃1min30s，30个循环（每个循 环退火温度降低0.5℃）；94℃30s，50℃30s，72℃1min30s，10个循环； 72℃10min，保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收后连接 pMD19-T Simple Vector，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证得到阳性克隆 送交华大基因完成测序。
2.3重组表达载体pPICZαAmy构建
以连有来自微小毛霉菌α-淀粉酶cDNA序列的pMD19-T Simple Vector为 模板，用引物R.pAEf/R.pANr进行PCR扩增；将PCR产物用限制性内切酶 EcoRI、NotI（购自Fermentas）进行酶切，然后与同样经EcoR I、NotⅠ酶切 的酵母表达载体pPICZα（来源Invitrogen）连接，转化大肠杆菌DH5α（来源 天根生化），验证阳性克隆得到重组质粒pPICZαAmy。
2.4毕赤酵母感受态细胞的制备
将毕赤酵母KM71和重组毕赤酵母KM71/9KGla分别接种YPD液体培养 基，30℃培养至OD1～2A（600nm），按照实施例1.3所述方法制备感受态细 胞。
2.5重组表达载体pPICZαAmy的转化
(1)将pPICZαAmy用SacⅠ线性化酶切后分别转化毕赤酵母KM71和重组 毕赤酵母KM71/9KGla，获得重组毕赤酵母菌株KM71/ZαAmy和 KM71/9KGla-ZαAmy；
(2)将上述重组菌株KM71/9KGla-ZαAmy涂布含有抗生素Zeocin的YPDS 平板，进行阳性转化子筛选。同时取没有转入重组质粒ZαAmy的感受态细胞 KM71/9KGla涂布相同的平板，作为筛选对照。
结果如图1所示：转化ZαAmy获得的重组菌株KM71/9KGla-ZαAmy转 化子在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上长出单菌落，而没有转化ZαAmy 的重组菌株KM71/9KGla在相同的平板上不能生长。该结果说明，重组毕赤 酵母菌株KM71/9KGla-ZαAmy得到了成功构建。
实施例3.重组毕赤酵母转化子产淀粉酶活性验证
(1)分别挑取重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla、KM71/ZαAmy、 KM71/9KGla-ZαAmy转化子单菌落接种含有2%的可溶性淀粉BMMY平板， 置于30℃培养箱培养，每24h在平板下层滴加200ul过滤除菌的无水乙醇；
(2)2～3d后用碘液显色，观察转化子周围水解圈的大小，以此判断转化子 是否成功表达微小毛霉淀粉酶。
结果如图2所示，上述重组毕赤酵母转化子的周围均出现水解圈，说明 上述重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla、KM71/ZαAmy、KM71/9KGla-ZαAmy 均可分泌表达淀粉酶。
实施例4.重组毕赤酵母菌株的诱导表达
4.1分别挑取重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla、KM71/ZαAmy、KM71/9KGla- ZαAmy单菌落接种含有3mlYPD培养基的50ml离心管，置于30℃，200rpm 摇床过夜培养；
4.2将3ml种子培养液全部接入装有150ml BMGY培养基的500ml摇瓶中， 30℃，225rpm培养24h；
4.3离心收集菌体，用30ml BMMY培养基重悬菌体，此处注意控制菌体量一 致，均为湿重3.5g，转入250ml摇瓶，置于30℃，230rpm摇床进行诱导发酵 培养，每24ml补加150ul过滤除菌的无水甲醇；
4.4从第48h开始，每隔24h取样，离心，测定上清液的葡萄糖淀粉酶（糖化 酶）活力或者α-淀粉酶（液化酶）活力。
本发明所述的葡萄糖淀粉酶（糖化酶）酶活测定方法为：在20ml具塞试 管中加入0.5ml1.0%(w/v)的可溶性淀粉溶液，60℃预热10min，然后加入0.5ml 适当稀释的酶液，反应10min；加入1.0ml DNS显色剂，沸水浴5min，流水 浴冷却，用10ml蒸馏水稀释，在540nm处测定吸光值；酶活力单位定义：一 个葡萄糖淀粉酶(糖化酶)酶活单位(U)定义为在给定条件下1min内水解可溶性 淀粉释放1umol葡萄糖当量的还原糖所需要的酶量。
本发明所述的重组α-淀粉酶（液化酶）酶活测定方法为：在20ml具塞试 管中加入5ml0.5%(w/v)可溶性淀粉溶液，预热10min，然后加入稀释至适当 倍数的酶液0.5ml，反应5min，加入5ml预冷的0.1M HCl终止反应。取0.5ml 反应液加入装有9.3ml蒸馏水的试管中，加入0.2ml I2-KI(I2，0.08%(w/v)；KI， 0.8%(w/v))溶液显色。摇匀，使蓝色溶液稳定10min后，在721分光光度计波 长660nm处测定吸光值。酶活力单位定义为：一个α-淀粉酶（液化酶）酶活 单位(U)定义为在给定条件下，5min内水解1mg淀粉所需的酶量。
结果如图3所示，重组毕赤酵母菌株KM71/9KGla和KM71/9KGla-ZαAmy 的葡萄糖淀粉酶酶活力均在96h达到最大值，其中，重组菌株 KM71/9KGla-ZαAmy的最高葡萄糖淀粉酶活力达到2218U/ml，而只携带葡萄 糖淀粉酶基因的重组菌株KM71/9KGla的最高酶活力为1237U/ml，因此，重 组菌株KM71/9KGla-ZαAmy的最高葡萄糖淀粉酶活力相比重组菌株 KM71/9KGla提高了79%；
结果如图4所示，重组毕赤酵母菌株KM71/ZαAmy和 KM71/9KGla-ZαAmy的α-淀粉酶酶活力均在96h达到最大值，重组菌株 KM71/9KGla-ZαAmy的最高α-淀粉酶活力达到8285U/ml，而只携带α-淀粉酶 基因的重组菌株KM71/ZαAmy的最高酶活力为2927U/ml，因此，重组菌株 KM71/9KGla-ZαAmy的最高α-淀粉酶活力相比重组菌株KM71/ZαAmy提高了 183%。
4.5分别取第96h的发酵上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如图5所 示：其中，M表示蛋白Marker，第1和第2泳道表示转化空载体Zα或者空 载体9K的毕赤酵母KM71，第3、第4和第5泳道分别表示重组菌株 KM71/ZαAmy，KM71/9KGla和KM71/9KGla-ZαAmy，通过观察可知，转化 空载体Zα或者空载体9K的毕赤酵母KM71均没有条带出现，而转化葡萄糖 淀粉酶基因或者α-淀粉酶基因的重组毕赤酵母KM71/ZαAmy，KM71/9KGla 和KM71/9KGLa-ZαAmy均在预期位置出现了清晰条带，因此说明表达成功。 实施例5.蛋白浓度测定
5.1制定牛血清白蛋白的标准曲线：在试管中依次加入200ug/ml的BSA标准 蛋白溶液0μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50ul和75ul，用双蒸水补足200ul； 各管中加入2ml Bradford工作液，震荡混匀，室温放置5min，在595nm处测 定吸光值；每个样品做三个平行，以标准蛋白含量为横坐标，A595为纵坐标， 制得标准曲线；
5.2样品蛋白含量测定：将样品稀释n和m倍，配置成浓度约为 0.025～0.075mg/ml的溶液；取稀释过的样品200ul加入试管中，加入2ml Bradford工作液，振荡均匀，室温放置5min，在595nm处测定吸光值；每个 样品做三个平行。将测得的吸光值扣去空白，从标准曲线差的相应的蛋白含 量，在按照各自的稀释倍数推算出蛋白浓度，去平均值后即为样品的蛋白浓 度。
经过测量，本发明所构建的重组菌株KM71/9KGla的葡萄糖淀粉酶的蛋 白表达水平为0.762mg/ml，重组菌株KM71/ZαAmy的α-淀粉酶的蛋白表达 水平为0.236mg/ml，而同时携带微小毛霉葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶基因的重 组毕赤酵母表达系统KM71/9KGla-ZαAmy的蛋白表达水平达到0.939mg/ml， 得到显著提高。
实施例6.酶学性质测定
6.1最适pH的测定
在50℃，分别在pH3.0(甘氨酸-盐酸)、4.0、5.0、6.0(柠檬酸-柠檬酸钠)、 7.0(磷酸二氢钾-磷酸氢二钾)、8.0(Tris-盐酸)的条件下，分别测定微小毛霉葡 萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的酶活力，以最高酶活力为100%，计算其他温度条件 下的相对酶活力。
结果如图6所示，重组葡萄糖淀粉酶的最适作用pH为4，而重组α-淀粉 酶的最适作用pH为5，二者较为接近，从而便于为同时含有这两种酶的混合 酶制剂的应用提供有利的pH条件。
6.2最适温度的测定
在pH5.0(100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)条件下，分别在30℃、40℃、 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃测定微小毛霉葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的酶 活力，以最高酶活力为100%，计算其他温度条件下的相对酶活力。
结果如图7所示，重组葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶的最适作用温度为 60-80℃，优选为70℃。
实施例7.薄层层析分析法分析葡萄糖淀粉酶水解可溶性淀粉的产物
用pH5.0的缓冲液配置1%(w/v)的可溶性淀粉底物溶液，在1ml底物溶 液中加入0.2ml适当稀释的酶液，混匀，置于50℃水浴中反应。反应48h后， 取出在沸水浴中煮沸15min，使酶失活，最大转速离心，然后用0.22μm的过 滤器过滤后，进行薄层层析。
用毛细管进行点样，每个样约2～3μl，点样时应使点样圈的直径尽可能小。 在250ml密闭玻璃瓶中进行展层(氯仿：冰乙酸：水(30:35:5))，待溶剂线跑出 硅胶板上沿后继续展层30min，取出，烘干。
将染色剂（α-萘酚-硫酸试剂：15%α-萘酚乙醇溶液21ml，加13ml浓硫 酸，再加81ml乙醇，8ml水混匀，置棕色瓶中，要新鲜配制）喷洒于硅胶板 上，烘干，置于100℃烘箱10min，取出观察。
结果如图8所示，其中，M从上至下依次表示葡萄糖、麦芽糖、麦芽三 塘和麦芽四糖，样品I表示本发明所制备的混合酶制剂，样品2表示α-淀粉 酶，样品3表示葡萄糖淀粉酶，通过观察谱图可知，本发明所制备的混合酶 制剂在水解可溶性淀粉的过程中，由于α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶发生了协同 作用而更有利于对可溶性淀粉的水解。