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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410214689.8 (22)申请日 2014.05.20 (73)专利权人 吴斌 地址 116001 辽宁省大连市中山区长江东 路60号 专利权人 肇慧君胡强王刚 (72)发明人 吴斌肇慧君胡强王刚 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 贾汉生李馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (56)对比文。
2、件 CN 103205508 A,2013.07.17,全文. 安元龙等.荧光环介导逆转录等温扩增 （RT- LAMP） 技术在病毒性出血性败血症 （VHS） 诊断中 的应用. 中国动物检疫 .2012,摘要、 第24页 1.3-1.4、 2.2-2.3、 第25页3. 审查员 罗洋 (54)发明名称 用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP 引物组合物及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测病毒性出血性 败血症病毒的LAMP引物组合物及其应用， 该LAMP 引物组合物由序列为SEQIDNo.1所示的正向内 引物FIP、 序列为SEQIDNo.2所示的反向内引物 BIP、 序列为SEQ。
3、IDNo.3所示的正向外引物F3、 序列为SEQIDNo.4所示的反向外引物B3组成。 本发明的LAMP引物组合物用于快速检测样品中 的病毒性出血性败血症病毒， 对于病毒性出血性 败血症病毒具有良好的特异性和灵敏度， 所需检 测仪器简单， 能够快速、 高效、 准确检测病毒性出 血性败血症病毒， 适合口岸检验检疫机构和基层 实验室推广。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图3页 CN 103952499 B 2016.07.20 CN 103952499 B 1.一种非疾病的诊断和治疗目的的病毒性出血性败血症病毒的检测方法， 包括以下步 骤： (1)提取样品中的RNA； (2)以步骤(1。
4、)提取的RNA为模板， 用LAMP引物组合物进行RT-LAMP的扩增反应， 扩增反 应条件为在62恒温反应60min； (3)扩增反应结束后， 扩增产物用下述、 或的方法确定待测样品中是否含有病毒 性出血性败血症病毒； 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， 在紫外灯下观察， 如果在远离点样孔出现梯状条带， 则证明待测样品中含有病毒性出血性败血症病毒； 扩增产物中加入双链DNA染料PicoGreen显色剂后观察荧光颜色变化， 如果反应后的 反应液显示绿色荧光， 则证明待测样品中含有病毒性出血性败血症病毒； 从LAMP扩增反应开始时刻通过Loopamp浊度仪检测反应液， 至扩增反应结束， 观察 LAMP浊。
5、度仪检测图， 如果浊度逐渐增加， 模块的颜色由绿色逐渐转变为红色， 则证明待测样 品中含有病毒性出血性败血症病毒； 所述LAMP引物组合物由序列为SEQIDNo.1所示的正向内引物FIP、 序列为SEQID No.2所示的反向内引物BIP、 序列为SEQIDNo.3所示的正向外引物F3、 序列为SEQIDNo.4 所示的反向外引物B3组成。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103952499 B 2 用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物及其 应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组 合物及其应用。 背景技术 0002。
6、 病毒性出血性败血症(Viralhaemorrhagicsepticaemia， VHS)是由弹状病毒引 起鲑、 鳟、 狗鱼和大菱鲆等十多种鱼类的一种烈性传染病， 能够导致很高的死亡率， 其病原 体为病毒性出血性败血症病毒(Viralhaemorrhagicsepticaemiavirus， VHSV)。 病毒性 出血性败血症病毒(Viralhaemorrhagicsepticaemiavirus， VHSV)属弹状病毒科粒外弹 状病毒属， 是一种能够感染鲑鳟鱼类的严重传染病， 致死率为90100。 本病最早发现 于欧洲大陆及北美洲， 最近几年传到了亚洲地区， 并在我国局部地区流行。 该病是世。
7、界动物 卫生组织(OIE)必须申报的疫病， 在我国进境动物传染病二类名录中被列为必须申报的疫 病。 0003 本病主要流行于欧洲及北美洲， 近年来随着水生动物进口贸易的增加， 病毒性出 血性败血症病毒已传入我国并在一些地区流行， 造成了严重的经济损失。 目前， 国内外对该 病病原VHSV的检测方法主要有病毒分离与培养方法、 反转录-聚合酶链式反应方法、 间接荧 光抗体试验方法、 酶联免疫吸附试验等， 这些检测方法虽已达到准确的诊断， 但是耗时长、 成本高、 仪器设备要求高， 检测步骤复杂， 不能满足快速、 准确检测该病毒的需求。 因此， 本 发明尝试探索更为快速、 准确、 适合现场操作的检测手。
8、段， 便于对病毒性出血性败血症病毒 疫情的监控及预防。 0004 逆转录环介导等温扩增技术(Reversetranscriptionloop-mediated isothermalamplification， RT-LAMP)是2000年报导的一种新颖核酸扩增技术， 该技术的 问世解决了核酸诊断上出现的诸多难题， 以其高效性、 高特异性和反应快速的特点被广泛 应用于各种病毒、 细菌、 寄生虫以及环境中细菌等病原体的检测研究。 该技术在目的基因的 高保守区域的6个特异性序列设计4条引物， 运用具有链置换活性的DNA聚合酶在6065 之间的恒温条件下反应几十分钟， 就可以完成核酸的扩增反应。 该方。
9、法具备便捷、 灵敏、 特 异性高， 不需要昂贵的仪器， 在短时间内便能完成检测等优点， 特别适用于中国进出口岸进 行快速检验检疫， 以便保护水生动物贸易和水产养殖业的可持续性发展。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种用于快速、 准确检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV) 的LAMP引物组合物。 0006 本发明的另一目的在于该LAMP引物组合物在检测病毒性出血性败血症病毒中的 应用。 0007 本发明的目的可通过如下技术方案来实现： 说明书 1/6 页 3 CN 103952499 B 3 0008 一种用于检测病毒性出血性败血症病毒的LAMP引物组合物， 该引物组合物由序列 为SE。
10、QIDNo.1所示的正向内引物FIP、 序列为SEQIDNo.2所示的反向内引物BIP、 序列为 SEQIDNo.3所示的正向外引物F3、 序列为SEQIDNo.4所示的反向外引物B3组成。 0009 本发明还提供上述LAMP引物组合物在检测病毒性出血性败血症病毒中的应用， 包 括以下步骤： 0010 (1)提取样品中的RNA； 0011 (2)以步骤(1)中提取的RNA为模板， 进行RT-LAMP扩增反应； 0012 (3)对步骤(3)得到的RT-LAMP扩增产物进行检测。 0013 在上述步骤(2)中， RT-LAMP扩增反应条件为： 60-65下反应30-90分钟， 停止反 应； 最为优。
11、选的反应条件为： 62下反应60分钟， 停止反应。 0014 在上述步骤(3)中RT-LAMP扩增产物可以采用如下方法判定样品中是否含有病毒 性出血性败血症病毒： 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， 在紫外灯下观察， 如果在远离点样 孔出现梯状条带， 则证明所检测的病毒为病毒性出血性败血症病毒， 样品中含有该病毒； 扩增产物中加入双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显色剂后观察荧光颜色变化， 如果反应后 的反应液显示绿色荧光， 则证明所检测的病毒为病毒性出血性败血症病毒， 样品中含有该 病毒； 从RT-LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液， 至扩增反应结束， 观察L。
12、AMP浊度仪检测图， 如果浊度逐渐增加， 模块的颜色由绿色逐渐转变为红色， 则证明所 检测的病毒为病毒性出血性败血症病毒， 样品中含有该病毒。 0015 相对于现有技术本发明的有益效果在于： 本发明的LAMP引物组合物， 可以快速检 测样品中的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)， 该LAMP引物组合物只对VHSV进行特异性的扩 增， 与其他病毒并无交叉反应， 对VHSV的特异性和灵敏度较常规PCR方法高。 利用本发明的 LAMP引物组合物检测VHSV， 检测时间短， 对VHSV的特异性和灵敏度高， 所需检测仪器简单， 能够快速、 高效、 准确检测病毒性出血性败血症病毒， 适合口岸检验检疫机构和。
13、基层实验室 推广。 本发明的方法， 为我国鱼类能够顺利出口欧盟、 美国等国家及地区奠定基础， 也为及 时发现鱼病疫情隐患， 提高疫情预警和防控能力提供理论依据。 附图说明 0016 图1为利用本发明LAMP组合物在不同温度下进行的RT-LAMP扩增反应结果的琼脂 糖电泳图， 其中泳道M为DL2000Marker， 泳道1-6依次为反应温度60、 61、 62、 63、 64 和65时的LAMP扩增结果。 0017 图2为利用本发明LAMP引物组合物在不同反应时间下进行的RT-LAMP扩增反应结 果的琼脂糖电泳图， 其中泳道M为DL2000Marker， 泳道1-5依次分别为恒温反应30min、。
14、 45min、 60min、 75min和90min时的LAMP扩增结果。 0018 图3为利用本发明LAMP引物组合物进行的RT-LAMP扩增反应结果的检测结果， 其中 图3A是通过琼脂糖凝胶电泳判读的结果： 在电泳图中泳道M为DL2000Marker， 泳道1和2分别 为VHSV样品和阴性对照； 图3B是通过检测浊度变化判读的结果： 从RT-LAMP扩增反应开始时 刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液， 至扩增反应结束， 图3B中横坐标1和2分别为VHSV样品 和阴性对照。 0019 图4为利用本发明LAMP引物组合物检测VHSV的特异性分析的琼脂糖凝胶电泳图， 说明书 2/6 页 4 。
15、CN 103952499 B 4 其中泳道M为DL2000Marker， 泳道1-5依次分别为VHSV、 IHNV、 SVCV、 IPNV和ISA的RT-LAMP的 扩增产物， 泳道6为阴性对照。 0020 图5为利用本发明LAMP引物组合物检测VHSV的灵敏度分析的琼脂糖凝胶电泳图， 其中泳道M为DL2000Marker， 泳道1-7依次分别为反应体系中VHSVRNA含量10ng、 1ng、 0.1ng、 0.01ng、 1pg、 0.1pg、 0.01pg时的扩增产物。 具体实施方式 0021 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。 。
16、下述实施例中， 如无特殊说明， 所使用的实验方法均为常规方法， 所 用试剂等均可从化学试剂公司购买。 0022 实施例1本发明LAMP引物组合物的设计和合成 0023 根据GenbankVHSV基因组中N基因的核苷酸序列(GenbankNo： AB672617.1)， 使用 PrimerExploreV3和PrimerPremier5.0软件针对其中的6个区域(3 端的F3c、 F2c、 F1c以 及5 端的B1、 B2、 B3)设计LAMP引物， 对不同引物组进行LAMP扩增实验和检测分析， 最终筛选 出扩增速率高、 特异性好的一组LAMP引物， 分别为正向内引物FIP、 反向内引物BIP、。
17、 正向外 引物F3、 反向外引物B3， 其序列如表1。 引物由大连宝生物工程有限公司合成。 0024 表1.VHSVRT-LAMP检测引物组 0025 0026 实施例2RT-LAMP反应条件的优化 0027 1.样品RNA模板的准备 0028 本发明中使用的病毒性出血性败血症病毒分离株(VHSV)由辽宁出入境检验检疫 局技术中心动检实验室分离保存。 采用TakaraMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit Ver.4.0试剂盒， 从该病毒细胞培养物中提取得到样品RNA， 具体操作步骤参照试剂盒说明 书。 0029 2.RT-LAMP反应体系 0030 RT-LAMP。
18、扩增反应采用核糖核酸扩增试剂盒(RT-LAMP)， 购自荣研生物科技(中国) 有限公司， 具体操作步骤参照试剂盒说明书。 0031 RT-LAMP采用25 L反应体系， 加入的组分剂量如下： 0032 说明书 3/6 页 5 CN 103952499 B 5 0033 0034 配制反应体系时， 以同体积的无核酸酶蒸馏水替代RNA模板作为阴性对照。 0035 3.RT-LAMP的扩增反应及结果判定 0036 按照上述步骤2准备反应体系进行RT-LAMP扩增反应后， 扩增产物用下述3种方法 判定。 0037 方法1： 通过琼脂糖凝胶电泳判读结果： 取扩增产物8 L进行凝胶电泳， 紫外投影下 观察。
19、， 靠近点样孔出现拖尾， 远离点样孔出现梯状条带的样品判为阳性， 未出现梯度条带的 样品判为阴性。 0038 方法2： 通过观察荧光颜色变化判读结果(荧光显色法)： 在反应管中加入双链DNA (dsDNA)染料PicoGreen， 反应后的反应液显示绿色荧光的判为阳性， 而反应后的反应液显 示浅橙色荧光的判为阴性。 0039 方法3： 通过检测浊度变化判读结果： 从RT-LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp 浊度仪(日本荣研化学株式会， LA-320C； 参数： 光源为ED(波长650mm)， 检出器为光电二极 管， 温度调节范围为区域(55-70)、 光罩(65-90)， 测定间隔为。
20、6秒)检测反应液， 至扩增 反应结束。 在LAMP浊度仪检测图中， 随着反应产物浊度的增加， 模块颜色转变为红色， 表明 VHSV基因被扩增， 判定为阳性； 而反应液未发生扩增时浊度无变化(近于0)， 模块的颜色仍 旧为绿色， 表明不存在VHSV基因的扩增， 判定为阴性。 0040 上述方法中， 所述 “阳性” 表示， 样品中含有病毒性出血性败血症病毒； 所述 “阴性” 表示样品中不含有病毒性出血性败血症病毒。 0041 4.RT-LAMP扩增反应最佳反应温度的优化 0042 按照步骤2准备6个相同的反应体系(相同模板、 相同的组份配置)， 反应体系分别 在60、 61、 62、 63、 64。
21、和65的温度下， 恒温反应60min， 以确定最佳反应温度； 0043 从反应完成的反应管中取8 L扩增产物进行凝胶电泳， 电泳结果如图1， 其中泳道 1-6依次为反应温度60、 61、 62、 63、 64和65时的反应管扩增产物。 泳道M为 DL2000Marker。 在紫外投影下观察， 反应管1-6的扩增产物在远离点样孔均出现梯状条带， 呈阳性， 其中反应温度为62时梯状特征条带最亮， 说明反应温度为62时扩增效果最好。 0044 另外， 向含有扩增产物6 L的反应管中加入1 L双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显 色剂， 观察反应液的颜色， 可以观察到6个反应管的反应液均显。
22、示不同强度的绿色荧光， 其 说明书 4/6 页 6 CN 103952499 B 6 中反应温度为62的反应管中产生的绿色荧光最深。 0045 综合对于上述对不同反应温度下的扩增产物的判定结果， 可以确定反应温度62 是利用本发明LAMP引物组合物扩增VHSV基因的最适RT-LAMP反应温度。 0046 5.RT-LAMP扩增反应最佳反应时间的优化 0047 按照步骤2准备5个相同的反应体系(相同模板、 相同的组份配置)， 反应体系在62 的温度下， 分别恒温反应30min、 45min、 60min、 75min和90min， 以确定最佳反应时间。 0048 从反应完成的反应管中， 取8 L。
23、扩增产物进行凝胶电泳， 电泳结果如图2所示， 其中 泳道M为DL2000Marker， 泳道1-5依次分别为恒温反应30min、 45min、 60min、 75min和90min后 的LAMP反应扩增产物。 图2中可见， 在45min-90min反应时间范围内， 均能看见梯状特征条 带， 但最亮的为反应时间60min时所产生的条带， 可以确定最佳反应时间为60min。 0049 因此在本发明中， 采用所选的LAMP引物组合物检测病毒性出血性败血症病毒的 RT-LAMP扩增反应的最佳反应条件为： 在62恒温反应60min。 0050 实施例3不同方法判定利用LAMP引物组合物进行的RT-LAM。
24、P扩增产物 0051 按照实施例2中步骤2的方法准备加入病毒性出血性败血症病毒分离株RNA模板的 样品反应体系(简称： VHSV样品)和阴性对照反应体系， 在62恒温反应60min后， 停止反应， 采用实施例2中步骤3所述的RT-LAMP反应结果判定方法判定样品中是否含有VHSV。 0052 方法1： 从反应完成的反应管中， 取8 L扩增产物进行凝胶电泳， 电泳结果如图3A， 其中泳道M为DL2000Marker， 泳道1和2分别为VHSV样品和阴性对照。 图3结果显示， VHSV样品 的泳道出现梯状特异性条带， 而阴性对照没有出现梯状特异性条带， 可知VHSV样品中VHSV 基因被扩增， 样。
25、品中含有VHSV。 0053 方法2： 向含有扩增产物6 L的反应管中加入1 L双链DNA(dsDNA)染料PicoGreen显 色剂， 观察反应管反应液的颜色， 可以观察到VHSV样品的反应液显示很强的绿色荧光， VHSV 被扩增， 样品中含有VHSV， 而阴性对照的反应液显示浅橙色荧光， 无VHSV扩增， 样品中没有 VHSV。 0054 方法3： 从RT-LAMP扩增反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(日本荣研化学株式 会， LA-320C； 参数： 光源为ED(波长650mm)， 检出器为光电二极管， 温度调节范围为区域(55- 70)、 光罩(65-90)， 测定间隔为6秒)检测。
26、反应液， 至扩增反应结束。 LAMP浊度仪检测图 如图3B所示。 图3B的横坐标1和2分别为VHSV样品和阴性对照， 可以看出VHSV样品浊度达到 0.5， 模块的颜色为红色， 说明VHSV被扩增； 而阴性对照的浊度为0， 模块的颜色仍旧为绿色， 说明反应液未发生扩增。 0055 从方法1-3的结果来看， 这3种方法均可以用于利用本发明LAMP引物组合物的VHSV 基因扩增结果的判定， 含有VHSV的阳性样品和阴性对照(无VHSV)的扩增结果之间的区别十 分明显。 可以采用上述3种方法中的一种或两种以上的方法的组合用于利用本发明LAMP引 物组合物扩增的VHSV基因RT-LAMP扩增结果的判定。
27、。 0056 实施例4利用本发明LAMP引物组合物检测VHSV的特异性分析 0057 按照实施例2步骤1-2所述的方法准备VHSV(病毒性出血性败血症病毒)、 IPNV(传 染性胰脏坏死病毒)、 IHNV(传染性造血器官坏死病毒)、 SVCV(鲤春病毒血症病毒)和ISA(传 染性鲑鱼贫血病毒)的RNA作为模板， 分别进行RT-LAMP扩增反应， 扩增反应温度为62， 扩 增反应时间为60min。 说明书 5/6 页 7 CN 103952499 B 7 0058 从反应完成的反应管中， 分别取8 L扩增产物进行凝胶电泳， 电泳结果如图4， 其中 泳道M为DL2000Marker， 泳道1-5依。
28、次分别为VHSV、 IHNV、 SVCV、 IPNV和ISA的RT-LAMP的扩增 产物， 泳道6为阴性对照。 图4的结果可见， 只有扩增VHSV的泳道1出现梯状特异性条带， 基因 被扩增， 而其余泳道均没有出现梯形条带， 基因没有被扩增， 表明本发明的LAMP引物组合物 只对VHSV进行了特异性的扩增， 与其他病毒并无交叉反应。 0059 实施例5利用本发明LAMP引物组合物检测VHSV的灵敏度分析 0060 按照实施例2步骤1所述的方法准备VHSVRNA， 并用无核酸酶蒸馏水进行稀释， 得 到不同浓度的VHSVRNA， 分别配制含有不同浓度VHSVRNA的25 lLAMP反应体系。 反应体。
29、系 中VHSV的RNA总含量分别为10ng(100倍稀释)、 1ng(10-1倍稀释)、 0.1ng(10-2倍稀释)、 0.01ng (10-3倍稀释)、 1pg(10-4倍稀释)、 0.1pg(10-5倍稀释)、 0.01pg(10-6倍稀释)。 所述反应体系， 分别进行RT-LAMP扩增反应， 扩增反应温度为62， 扩增反应时间为60min。 0061 从反应完成的反应管中， 分别取8 L扩增产物进行凝胶电泳， 电泳结果如图5， 其中 泳道M为DL2000Marker， 泳道1-7依次分别为VHSV的RNA总含量分别为10ng(100倍稀释)、 1ng (10-1倍稀释)、 0.1ng(。
30、10-2倍稀释)、 0.01ng(10-3倍稀释)、 1pg(10-4倍稀释)、 0.1pg(10-5倍稀 释)、 0.01pg(10-6倍稀释)时的扩增产物。 图5的结果可见， 泳道1-6均出现梯状特异性条带， 但随着模板RNA含量的降低， 特征性条带的亮度也减弱， 而泳道7没有出现梯形条带。 出现 VHSV基因阳性结果(出现梯状特异性条带)的最小RNA含量为0.1pgRNA。 说明书 6/6 页 8 CN 103952499 B 8 0001 序列表 1/2 页 9 CN 103952499 B 9 0002 序列表 2/2 页 10 CN 103952499 B 10 图1 图2 说明书附图 1/3 页 11 CN 103952499 B 11 图3 图4 说明书附图 2/3 页 12 CN 103952499 B 12 图5 说明书附图 3/3 页 13 CN 103952499 B 13 。