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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810473813.0 (22)申请日 2018.05.17 (71)申请人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学 府大道999号 (72)发明人 邱建丁童圆君梁汝萍 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 赵艾亮 (51)Int.Cl. C09K 11/06(2006.01) C08G 83/00(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 21/78(2006.01) (54)发明名称 稀土。
2、比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检 测应用 (57)摘要 本发明公开了一种稀土比率荧光探针的制 备方法及其Cu2+检测应用， 属于环境检测技术领 域。 以鲁米诺(luminol)和单磷酸鸟苷(GMP)为双 配体， 以稀土离子Tb3+为发光中心离子， 通过 luminol、 GMP和Tb3+之间的自聚合配位作用， 建 立luminol-Tb-GMP荧光探针制备方法。 luminol- Tb-GMP荧光探针兼具luminol和Tb3+的双荧光信 号， 在同一激发波长下同时发射luminol和Tb3+ 的双荧光信号。 当Cu2+存在时， luminol和GMP对 Cu2+有强配位作用， 阻止了电子。
3、由GMP的氨基向 Tb3+传递， 导致Tb3+的荧光猝灭， 而luminol的荧 光强度则不变， 建立基于luminol和Tb3+的荧光 信号比率的Cu2+检测方法。 此外， 随着Cu2+浓度的 增加， Tb3+的绿色荧光逐渐减弱， 而luminol的蓝 色荧光逐渐显现， 据此还可实现对Cu2+的可视化 检测。 luminol-Tb-GMP荧光探针还可应用于环境 水样和生物样品中Cu2+的灵敏检测。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 108517208 A 2018.09.11 CN 108517208 A 1.稀土比率荧光探针的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法包括以下步骤： 。
4、将鲁米诺溶液与90L 100mM单磷酸鸟苷溶液混合， 充分搅拌30分钟， 再加入100 L100mM的Tb(NO3)36H2O溶液， 继续搅拌反应30分钟， 得到乳白色絮状沉淀； 将乳白色絮状 沉淀在12000rpm转速下离心， 得到的沉淀用超纯水洗净后再次离心， 反复3次， 将得到的沉 淀溶于1mL超纯水中， 制成稀土比率荧光探针溶液。 2.如权利要求1所述的稀土比率荧光探针的制备方法， 其特征在于， 所述鲁米诺溶液的 浓度为40 L 10mM。 3.权利要求1中制备的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用， 其特征在于， 方法为： 将10 L稀土比率荧光探针溶液、 40 L 10mM Tri。
5、s-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液 混合， 用超纯水稀释至溶液总体积为200 L， 在37反应30分钟， 采用荧光分光光度计测量 在激发波长为290nm时溶液的荧光光谱， 并根据不同浓度的Cu2+与对应的鲁米诺与Tb3+的荧 光信号强度之间的比值的线性关系来实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测， 或在波长为 253.7nm的紫外灯照射下， 观察稀释后溶液颜色的变化来实现对Cu2+的快速可视化分析。 4.如权利要求3所述的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用， 其特征在于， 所述鲁米诺 与Tb3+的荧光信号强度之间的比值为激发波长为290nm时， 溶液中的鲁米诺在430nm处的荧 光强度与。
6、Tb3+在547nm处的荧光强度之间的比值。 5.如权利要求3所述的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用， 其特征在于， 所述Tris- HCl缓冲溶液的pH为9.0。 6.如权利要求3所述的稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用， 其特征在于， 所述Cu2+的浓 度范围为0.01-80 M。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108517208 A 2 稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用 技术领域 0001 本发明涉及一种稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用， 属于环境检测 技术领域。 背景技术 0002 稀土配位聚合物(Ln-CPs)具有高荧光量子产率、 长荧光寿命、 。
7、大stoke位移、 线状 发射光谱以及组成成分和纳米尺寸可调等优异的光学性能， 受到越来越多的关注。 近年来， 基于Ln-CPs的荧光探针广泛应用于小分子、 阳离子、 阴离子、 温湿度和pH等传感(Real-time Ratiometric Fluorescent Assay for Alkaline Phosphatase Activity with Stimulus Responsive Infinite Coordination Polymer Nanoparticles， Analytical Chemistry, 2015,87,3080-3086)。 研究表明， 构成Ln-CPs的。
8、桥联配体大部分是合成的有机分子， 这些有 机配体往往制备方法复杂、 水溶性和生物兼容性差， 甚至一些有机配体还具有生物毒性。 因 此， 采用具有生物兼容性的配体与稀土金属离子(Ln3+)配位制备Ln-CPs， 将有利于进一步拓 展其在生物研究领域的应用。 核苷酸分子是生物体内重要的生物物质， 具有生物兼容性好、 原料易得、 成本低廉、 制备过程简单、 结构多样化以及丰富的金属离子配位位点等生物分子 配体的诸多优点， 尤其是核苷酸分子中的磷酸基团对Ln3+具有很强的亲和性， 易与Ln3+进行 自组装。 然而， 传统的核苷酸稀土荧光探针多为单配体单荧光信号调节探针， 容易受到环境 波动等因素的干扰。
9、， 从而限制了实际应用。 尚未见室温下快速、 环保的方法掺入鲁米诺 (luminol)作为第二配体合成双配体稀土荧光探针luminol-Tb-GMP CPNPs的报道。 0003 铜是动物和植物体内重要且必须的微量元素， 同时也是很多生物体中蛋白酶的重 要辅酶因子。 然而， Cu2+浓度过高则具有高毒性并对中枢神经系统产生损伤， 进而引起威尔 逊疾病和老年痴呆症等神经性疾病， 高浓度的Cu2+还能诱导肠胃扰动以及肝脏或肾脏的损 伤。 Cu2+的检测方法很多， 如原子吸收/发射光谱法、 电感耦合等离子质谱法、 电化学法、 动态 光散射法、 拉曼散射法以及荧光法(Fluorescent gold 。
10、clusters as nanosensors for copper ions in live cells,C.V.Durgadas,C.P.Sharma,K.Sreenivasan,Analyst,2011, 136,933-940.)等。 其中， 荧光法具有高灵敏度、 简单、 仪器成本低等特点， 使得基于荧光的 Cu2+检测方法有良好的应用前景。 目前， 对Cu2+的荧光响应大多基于单荧光猝灭探针， 常常 受光源或检测器漂移或者复杂样品环境因素影响等的限制。 比率荧光探针可以避免以上问 题并在近年受到极大的关注(Two-Photon Probe for Cu2+with an Intern。
11、al Reference: Quantitative Estimation ofCu2+ in Human Tissues by Two-Photon Microscopy, Analytical Chemistry 2014,86,5353-5359.)。 两个发射峰分开的探针的荧光强度之比， 可修正环境干扰并排除激发光强度波动的影响， 因而提高定量分析的精确度。 所以， 发展 Cu2+比率荧光检测方法具有重要意义。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供了一种稀土比率荧光探针的制备方法及其Cu2+检测应用， 说明书 1/5 页 3 CN 108517208 A 3 该方法制备稀土比率荧光。
12、探针具有简单、 快速、 环境友好的特点， 且可实现对Cu2+的比率荧 光法和可视化双检测， 对Cu2+具有灵敏度高和选择性好的优点， 还可用于环境水样以及复杂 生物样品中Cu2+的检测。 0005 本发明实现步骤为： 0006 一种稀土比率荧光探针的制备方法， 其特征在于， 将40 L 10mM鲁米诺溶液与90 L100mM单磷酸鸟苷溶液混合， 充分搅拌30分钟， 再加入100 L 100mM的Tb(NO3)36H2O溶液， 继续搅拌反应30分钟， 得到乳白色絮状沉淀； 将乳白色絮状沉淀在12000rpm转速下离心， 得 到的沉淀用超纯水洗净后再次离心， 反复3次， 将得到的沉淀溶于1mL超纯。
13、水中， 制成稀土比 率荧光探针溶液。 0007 本发明还涉及稀土比率荧光探针对Cu2+的检测应用， 其方法为： 0008 将10 L稀土比率荧光探针溶液、 40 L 10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度 的Cu2+溶液混合， 用超纯水稀释至溶液总体积为200 L， 在37反应30分钟， 采用荧光分光光 度计测量在激发波长为290nm时溶液的荧光光谱， 并根据不同浓度的Cu2+与对应的鲁米诺与 Tb3+的荧光信号强度之间的比值的线性关系来实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测， 或在波 长为253.7nm的紫外灯照射下， 观察稀释后溶液颜色的变化来实现对Cu2+的快速可视化分 析。
14、。 0009 本发明制备得到的稀土比率荧光探针溶液应用于Cu2+的检测时， 稀土比率荧光探 针同时发射鲁米诺和稀土Tb3+的双荧光信号； 随着Cu2+浓度的增加， 鲁米诺在430nm处的荧 光强度不变， Tb3+在547nm处的荧光强度逐渐减弱， 则鲁米诺和Tb3+的荧光信号比率F430/F547 逐渐增大， 根据F430/F547可实现对Cu2+的高灵敏和选择性检测； 此外， 将稀土比率荧光探针溶 液、 10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混合， 在37反应30分钟， 在波长 为253.7nm的紫外灯照射下， 观察溶液颜色的变化； 稀土比率荧光探针溶液呈Tb。
15、3+的绿色， 随 着Cu2+浓度的增加， Tb3+的绿色逐渐减弱， 而鲁米诺的蓝色逐渐显现， 根据溶液颜色变化可 实现对Cu2+的快速可视化分析。 0010 本发明制得的稀土比率荧光探针溶液应用于Cu2+的具体检测时， Cu2+浓度在0.01- 80 M范围内时， 浓度的Cu2+对应的荧光信号强度的比值呈良好的线性， 检出限为4.2nM。 0011 本发明的有益效果为： 0012 本发明以鲁米诺和生物分子单磷酸鸟苷为双配体， 以稀土离子Tb3+为发光中心离 子， 通过luminol、 GMP和Tb3+之间的自聚合配位作用， 建立简单、 快速、 绿色的luminol-Tb- GMP荧光探针制备方。
16、法； 本发明方法制备的luminol-Tb-GMP荧光探针兼具luminol和Tb3+的 双荧光信号， 在同一激发波长下可同时发射luminol和Tb3+的双荧光信号， 其中， 当Cu2+存在 时， luminol和GMP对Cu2+的强配位作用， 阻止了电子由GMP的氨基向Tb3+传递， 导致Tb3+的荧 光猝灭， 而luminol的荧光强度不变， 随着Cu2+浓度的增加， luminol在430nm处的荧光强度与 Tb3+在547nm处的荧光强度的比值F430/F547逐渐增大， 根据F430/F547可实现对Cu2+的高灵敏和 选择性检测， 双荧光比率法可修正环境干扰并排除激发光强度的波动。
17、， 可大大改善对Cu2+定 量分析的精确性； 此外， 随着Cu2+浓度的增加， 在波长为253.7nm的紫外灯照射下， Tb3+的绿 光逐渐减弱， 而luminol的蓝光逐渐显现， 据此还可实现对Cu2+的可视化检测。 本发明方法可 用于环境水样以及复杂生物样品中Cu2+的检测。 说明书 2/5 页 4 CN 108517208 A 4 附图说明 0013 图1是(a)luminol,(b)luminol-Tb,(c)GMP-Tb,(d)luminol-Tb-GMP,(e)luminol- GMP的荧光光谱图。 0014 图2是(a)luminol,(b)GMP,(c)luminol-Tb-G。
18、MP的傅利叶变换红外光谱图。 0015 图3是(a)luminol,(b)GMP,(c)luminol-Tb-GMP的紫外可见吸收光谱图。 0016 图4是(A)luminol-Tb-GMP的扫描电镜图,(B)GMP-Tb的扫描电镜图。 0017 图5是(A)luminol-Tb-GMP对不同浓度Cu2+响应的荧光光谱图,(B)F430/F547对Cu2+ 的校准曲线。 0018 图6是luminol-Tb-GMP对Cu2+检测的选择性图。 具体实施方式 0019 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述， 但本发明并不限于此； 0020 实施例1 0021 luminol-Tb-GMP比。
19、率荧光探针的制备： 将40 L 10mM鲁米诺溶液与90 L 100mM单 磷酸鸟苷溶液混合， 充分搅拌30分钟， 再加入100 L 100mM的Tb(NO3)36H2O溶液， 继续搅拌 反应30分钟， 得到乳白色絮状沉淀； 将乳白色絮状沉淀在12000rpm转速下离心， 得到的沉淀 用超纯水洗净后再次离心， 反复3次， 将得到的沉淀溶于1mL超纯水中， 制成稀土比率荧光探 针溶液。 0022 采用荧光光谱法分别对luminol、 luminol-Tb、 GMP-Tb、 luminol-Tb-GMP和 luminol-GMP进行表征， 结果如图1所示。 其中， 图1为luminol、 lumi。
20、nol-Tb、 GMP-Tb、 luminol-Tb-GMP和luminol-GMP的荧光光谱图。 在290nm激发波长下， luminol的最大荧光发 射峰位于430nm， 但是峰强度很弱(曲线a)； 而luminol-Tb极大地增强了luminol在430nm处 的荧光(曲线b)； GMP-Tb产生了Tb3+的四个特征峰， 分别位于488nm、 547nm、 586nm和630nm(曲 线c)； luminol-Tb-GMP同时具有luminol和Tb3+的荧光峰， 表明luminol与GMP成功地与Tb3+ 配位聚合(曲线d)； GMP与luminol的混合溶液的荧光强度与luminol。
21、相同， 表明GMP对 luminol的荧光没有干扰(曲线e)。 0023 采用傅利叶变换红外光谱法对luminol、 GMP和luminol-Tb-GMP进行定性鉴定， 结 果如图2所示。 其中， 图2为luminol、 GMP和luminol-Tb-GMP的傅利叶变换红外光谱图。 luminol在3420cm-1和3330cm-1处出现了N-H的伸缩振动， 1622cm-1和1053cm-1处分别出现了C O的弯曲振动和伸缩振动(曲线a)。 GMP在1688cm-1、 1475cm-1、 1240cm-1和1083cm-1处的吸收 峰分别对应于P-OH的伸缩振动、 鸟嘌呤N7-C8伸缩振动、。
22、 磷酸的反对称和对称振动(曲线b)。 luminol-Tb-GMP中GMP的特征吸收峰1688cm-1、 1475cm-1和1083cm-1分别移动至1692cm-1、 1479cm-1和1088cm-1， 而1240cm-1处的特征吸收峰消失； 同时， luminol的N-H特征峰和CO特 征峰也发生了改变， 1053cm-1处的特征吸收峰消失， 1622cm-1处的特征吸收峰移动至1625cm -1(曲线c)。 以上结果表明GMP和luminol参与了luminol-Tb-GMP的形成。 0024 采用紫外-可见光谱法谱进一步证实luminol-Tb-GMP的形成， 结果如图3所示。 GM。
23、P 在260nm处有强吸收峰(曲线a)， luminol在300nm和347nm有明显的吸收峰(曲线b)， 而 luminol-Tb-GMP明显扩大了紫外吸收宽度且在260nm和347nm处发生了明显的减色效应(曲 说明书 3/5 页 5 CN 108517208 A 5 线c)， 表明luminol和GMP均与Tb3+发生了配位作用。 0025 图4A为luminol-Tb-GMP的扫描电镜图， 可见， luminol-Tb-GMP由致密的网状纳米 粒子构成， 纳米粒子粒径约50nm。 与单配体形成的GMP-Tb的透射电镜形貌相比(图4B)， 掺入 luminol的luminol-Tb-GM。
24、P的结构明显更紧密， 表明采用本发明方法成功制备了luminol和 GMP双配体的luminol-Tb-GMP。 0026 实施例2 0027 luminol浓度、 Tb3+浓度和检测pH的优化 0028 对制备的luminol-Tb-GMP溶液中的luminol浓度和Tb3+浓度以及对Cu2+检测时溶 液的pH值等实验条件进行了优化。 luminol的浓度在传感过程中起着重要的作用， 它不仅影 响luminol-Tb-GMP对Cu2+的灵敏度和选择性， 还起到内参比信号的作用。 当不存在Cu2+时， 随着luminol-Tb-GMP中的luminol浓度的增加， F430/F547的值逐渐增。
25、大； 当加入Cu2+时， 由于 Cu2+淬灭Tb3+的荧光而使F430/F547值增加， 且luminol-Tb-GMP中的luminol浓度为0.4mM时对 Cu2+响应最灵敏， 因此， 制备的luminol-Tb-GMP溶液中的luminol的最佳浓度为0.4mM。 当不 存在Cu2+时， 随着luminol-Tb-GMP中Tb3+浓度的增加， F430/F547的比值缓慢降低； 当Cu2+存在 时， 在luminol-Tb-GMP中的Tb3+浓度小于10mM时F430/F547的比值随着Tb3+浓度增加而增大， 当Tb3+浓度大于10mM时又稍有降低， 因此， 制备的luminol-Tb。
26、-GMP溶液中的Tb3+的最佳浓度 为10mM， 此时对Cu2+的响应最灵敏。 当不存在Cu2+时， F430/F547的比值随着溶液pH的增加而增 大， 这是由于luminol对溶液pH的响应比较灵敏； 当Cu2+存在时， pH值小于9.0时F430/F547的比 值随着pH增加而增大， 当pH大于9.0时逐渐降低， 表明弱碱性环境更有利于提高检测Cu2+的 灵敏度， 因此， 选择在pH为9.0时进行检测。 0029 实施例3 0030 luminol-Tb-GMP对Cu2+的检测应用 0031 在优化实验条件下， 采用luminol-Tb-GMP比率荧光探针对Cu2+进行定量检测。 将10。
27、 L luminol-Tb-GMP溶液、 40 L 10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混 合， 用超纯水稀释溶液总体积为200 L， 在37反应30分钟， 测量激发波长为290nm时溶液的 荧光光谱。 由图5可见， luminol-Tb-GMP比率荧光探针同时发射luminol和Tb3+的双荧光信 号； 随着Cu2+浓度的增加， luminol在430nm处的荧光强度不变， Tb3+在547nm处的荧光强度逐 渐减弱， 则luminol和Tb3+的荧光信号比率F430/F547逐渐增大(图5A)， F430/F547与Cu2+浓度在 0.01-80 M范围内。
28、呈良好的线性， 检出限为4.2nM(图5B)， 比GMP单配体制备的GMP-Tb荧光探 针对Cu2+的检出限低了近三个数量级。 此外， 将luminol-Tb-GMP溶液、 10mM pH 9.0Tris-HCl 缓冲溶液和不同浓度的Cu2+溶液混合， 在37反应30分钟， 在波长为253.7nm的紫外灯照射 下， 观察溶液颜色的变化； luminol-Tb-GMP溶液呈Tb3+的绿色， 随着Cu2+浓度的增加， Tb3+的 绿色荧光逐渐减弱， 而luminol的蓝色荧光逐渐显现， 根据溶液颜色变化可实现对Cu2+的快 速可视化分析。 0032 考察了luminol-Tb-GMP对Cu2+检测。
29、的选择性， 由图6可见， 50 M Cu2+使得luminol- Tb-GMP的F430/F547迅速增大， 而500 M其他金属离子(包括Ba2+,Mn2+,Zn2+,Cd2+,Pb2+,Hg2+,Ag +,As(V),As(III),Fe2+,Co2+,SO42-,PO43-)、 葡萄糖、 抗坏血酸以及尿素等均不干扰Cu2+检测， 表明本发明方法制备的luminol-Tb-GMP比率荧光探针对Cu2+检测具有良好的选择性。 0033 采用标准加入法考察了luminol-Tb-GMP对环境水样中的Cu2+的检测应用。 取赣江 说明书 4/5 页 6 CN 108517208 A 6 南昌段水。
30、样， 用0.22 m的醋酸纤维素滤膜过滤， 滤去漂浮物。 将100 L水样、 10 L luminol- Tb-GMP溶液和不同浓度的Cu2+标准溶液混合， 加入10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液直至溶液 总体积为200 L， 在37反应30分钟， 测量激发波长为290nm时溶液的荧光光谱。 结果表明， 本方法对水样中的Cu2+的回收率为97-103， 与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测量 得到的结果相一致。 结果表明， 本发明方法能用于检测实际水样中的Cu2+。 0034 此外， 采用标准加入法考察了luminol-Tb-GMP对生物样品中的Cu2+的检测应用。 相 关文。
31、献表明， 由卵巢癌引起的腹水液中Cu2+的浓度明显升高， 甚至比正常情况下高出10倍。 肝硬化患者尿液中Cu2+的浓度明显高于正常人体尿液中Cu2+浓度。 据此， 我们收集了卵巢癌 患者的腹水液和肝硬化患者的尿液， 经3kDa的超滤装置去除蛋白质， 滤液稀释5倍作为生物 样品。 将100 L生物样品、 10 L luminol-Tb-GMP溶液和不同浓度的Cu2+标准溶液混合， 加入 10mM pH 9.0Tris-HCl缓冲溶液直至溶液总体积为200 L， 在37反应30分钟， 测量激发波 长为290nm时溶液的荧光光谱。 结果表明， 本方法对卵巢癌患者的腹水液样品和肝硬化患者 尿液样品中的Cu2+的回收率分别为96-102和97-104， 与ICP-MS法测量得到的结果 相一致。 结果表明， 本发明方法能用于检测复杂生物样品中的Cu2+， 具有良好的应用价值。 说明书 5/5 页 7 CN 108517208 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 8 CN 108517208 A 8 图4 图5 图6 说明书附图 2/2 页 9 CN 108517208 A 9 。