技术领域
本发明属于生物药物领域，具体涉及一株由牛支原体强毒株Mycoplasma bovis HB0801(MbovHB0801)体外传代致弱的弱毒菌株MbovHB0801-150.2，还涉及 该致弱菌株在制备预防和控制由牛支原体所致疾病中的用途。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis)主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结 膜炎等。该病原于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到(Hale et al.， 1962)。1976年牛支原体被描述为致呼吸道疾病的主要病因(Gourlay R N et al.， 1976)，此后不同国家都有暴发流行，给养牛业造成了严重的经济损失。欧洲每 年约有25％～33％的犊牛肺炎是由牛支原体引起的，相当于每年损失1.44～1.92 亿欧元，其中英国每年就有190万头牛患牛支原体肺炎，死亡数达15.7万头。 美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成损失达1.40亿 美元，单个牛场最高感染率达70％。我国于2008年首次报道牛支原体肺炎的流 行(石磊等，2008)，此后发现该病在我国肉牛养殖为事普遍发生，造成了严重 的经济损失。
虽然牛支原体自首次发现至今已有50年，但牛支原体所致疾病的防控手段仍 处于初级阶段，疫苗研究尤其如此，目前还没有一种高效安全的疫苗用于牛支原 体预防。但由于药物临床治疗效果差，疫苗研究一直受到重点关注。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株，该牛支原体弱毒株对牛的 致病力明显减弱，但保持良好的免疫原性。与现有的牛支原体灭活疫苗相比，该 菌株具有制备方法简单、成本相对低、对动物体刺激性小和免疫效果好等优点。
本发明的另一个目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株在制备预防和控制 牛支原体所致疾病生物制剂的药物中的应用。
本发明的再一个目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150.2 在制备治疗或预防牛肺炎的生物制剂的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
将从临床分离的牛支原体强毒株MbovHB0801在体外液体培养基中高温条 件下(41℃)连续传至150代，得到牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150.2。
该牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150.2的制备步骤是：
A.分离鉴定牛支原体强毒株：2008年，湖北省从外地引进肉牛中，陆续报 道发生呼吸道疾病，牛群引进后不久即发病，表现为发热、咳嗽、流鼻涕，犊牛 和体质弱的架子牛发病严重，死亡率可高达40％甚至更高，病后期可见关节炎和 腹泻症状。剖检时，病理变化主要集中在胸腔，以化脓性或干酪样坏死性肺炎为 主。胸腔内有浆液样积液，肺与胸膜可发生粘连，肺组织发生肉变，并分布大小 不等的白色坏死灶，关节积液等(石磊等，2008)。通过病原分离培养、PCR检 测与测序分析、动物回归试验等方法，确定其病原为牛支原体，命名为 MbovHB0801。
B.牛支原体弱毒株MbovHB0801-150.2的培育：将本发明分离到的牛支原 体(MbovHB0801株)在体外培养基中高温条件下(41℃)连续传至150代。
具体操作是：
①.将牛支原体MbovHB0801接种含有酚红的PPLO液体培养基，于41℃ 培养箱中培养2-3天后，培养基从红色变成透亮的黄色。
②.从上一代菌液取出1μL，接种新鲜PPLO培养基，于41℃恒温培养箱中 培养2-3天后，再传下一代，直到150代。
C.动物试验表明，该代次牛支原体已充分致弱。通过形态学检测，纯粹性 检测、特异性检测和外源细菌检测等试验结果验证了由牛支原体MbovHB0801 培育的150代传代菌株MbovHB0801-150.2具有典型的牛支原体菌落特征，纯净 无外源细菌污染。
D.该牛支原体致弱株MbovHB0801-150.2已提交认可的机构保藏，其保藏 号是：CCTCC NO：M2011102；保藏时间：2011年3月31日；保藏单位是：中 国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名：牛支原体 MbovHB0801-150.2 Mycoplasma bovis MbovHB0801-150.2。
牛支原体致弱毒株MbovHB0801-150.2的具体特征如下：
A.形态学特征：形态特性符合细菌分类学中支原体的形态特性，是一种缺乏 细胞壁、呈高度多形性、可通过滤菌器，并能在无生命培养基中生长繁殖的最小 的原核细胞型微生物；在固体培养基上形成特征性的“煎荷包蛋”样菌落。革兰氏 染色阴性，不易着色，通常用吉姆萨染色呈淡紫色。
B.培养特征：本菌为兼性厌氧菌，在含0.8万单位/ml青霉素的PPLO培养 基平板上，于37℃在含5％(v/v)的C02的细胞培养箱中培养，2-3天后，用光 学显微镜低倍观察菌落形态，具有“煎荷包蛋”样菌落典型特征(图1)。
C.生化特性：将MbovHB0801-150.2菌液50μl加入到生化管中，置于37 ℃恒温培养箱中，根据生化管要求判断结果(如下表)。经与标准(参考兽医微 生物学第三版，陆承平主编)比对，MbovHB0801-150.2与牛支原体及无乳支原 体生化反应最接近。
牛支原体弱毒株MbovHB0801-150.2牛体试验：牛体鼻腔接种不同代次传代 菌株，观察临床症状，检测排菌和所诱导的免疫反应，20天后扑杀试验牛，观 察组织脏器的病理变化。将临床症状和病理变化逐一评分，对分值进行累加，评 价毒力变化。对血液抗体和干扰素进行检测，以评价菌株诱导的免疫反应状况。
各项试验结果证实，体外41℃下传代150代菌株MbovHB0801-150.2的毒 力显著减弱但保持良好的免疫原性，可望将其制备成单苗或联苗，为牛支原体肺 炎和其它相关传染病的预防和控制提供技术手段。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
虽然牛支原体自首次发现至今已有50年，主要引起牛的肺炎、关节炎、乳 房炎、角膜结膜炎等，给世界各国养牛业造成了严重的经济损失。但牛支原体所 致疾病的防控手段仍处于初级阶段，疫苗研究尤其如此，目前还没有一种高效安 全的疫苗用于牛支原体预防。我国于2008年首次报道牛支原体肺炎的流行(石 磊等，2008)，此后发现该病在我国肉牛养殖业中普遍发生，造成了严重的经济 损失。因此研发一种新型高效的牛支原体疫苗对我国养牛业的发展显得至关重 要。
本发明获得的牛支原体致弱菌株MbovHB0801-150.2具有良好的疫苗开发 前景和广阔的临床应用价值，产品成熟后可用于防治牛支原体引起疾病，包括肺 炎、乳腺炎和关节炎等。跟现有的牛支原体灭活疫苗相比，弱毒菌株制备的疫苗 具有制备简单、成本相对低、对动物体刺激性小等优点，推广后可望产生巨大的 经济效益和社会效益。
附图说明
图1为一种牛支原体致弱菌株的光学显微镜观察图(放大倍数4×10)。
图2为一种牛支原体致弱菌株所培育的不同传代次数的牛支原体的PCR产 物凝胶电泳检测图。
图3为一种牛支原体致弱菌株MbovHB0801和致弱菌株MbovHB0801-150.2 接种牛体后，ELISA检测牛血清抗牛支原体抗体的动态变化图。
图4为一种牛支原体致弱菌株接种牛体前后不同时间血液IFN-γ测定结果图。
图5一种牛支原体致弱菌株接种牛体前后6天内血液IFN-β的产生比较图。
具体实施方式
下面结合实例来进一步描述本发明，本发明的优缺点会在描述中得以体现。 但是这些实施例仅是示范性的，并不对发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但是这些修改和替换均属于本发明的保护范围，
实施例1：
牛支原体强毒分离株(MovHB0801)的分离鉴定：通过对临床病料进行细 菌学分离培养、分离菌株的实验室鉴定和动物回归试验，确定分离到的细菌为牛 支原体(Mycoplasma bovis)，命名为Mycoplasma bovis HB0801(MbovHB0801)。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病料：病肺采自2008年湖北省多个养殖场送检的以坏死性肺炎为主要 病征的重症病牛或病死牛。
1.1.2牛支原体培养基：PPLO培养基(含PPLO肉汤粉、酵母粉、丙酮酸钠 MEM、马血清、青霉素和1％(w/v)酚红)。
1.1.3试验动物：8月龄本地黄牛，购自湖北松滋当地牛场，经一周健康检查 后，确定健康后备用。
1.1.4PCR扩增鉴定：16sRNA扩增通用引物，由发明人设计，由上海生物工 程技术有限公司合成备用。引物序列如下：
16S rRNA forward：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′
16S rRNA reverse：3′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′
PCR反应体系为20μL，其中2×Taq Mixture(Tiangen)10μL，Primers(10μmol/L) 各0.8μL，支原体DNA模板3.0μL，去离子水5.4μL。PCR反应程序如下：94℃预 变性10min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃ 延伸7min。
PCR产物在含有溴化乙锭的0.8％(w/v)琼脂糖上电泳，目的带大小应为 1600bp。PCR产物委托上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。
设计牛传染性胸膜肺炎支原体的特异性引物，进行PCR鉴别诊断。引物序列 如下：
SC1：5′-ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG-3′
SC2：5′-CTGATTATGATGACAGTGGTCA-3′
PCR反应体系为20μL，其中：2×Taq Mixture(Tiangen)10μL，引物SC1和 SC2(10μmol/L)各1.0μL，支原体DNA模板1.0μL，去离子水7.0μL。PCR反应程序： 94℃预变性5min，变性45s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延 伸10min。PCR产物预期大小为277bp。
同时，针对牛支原体UvrC基因(GenBank accession no.AF003959)设计一对特 异性PCR引物，进行牛支原体鉴定。引物序列如下：
UvrC1 5′TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCGC3′
UvrC2 5′CATATCTAGGTCAATTAAGGCTTTG3′
PCR反应体系为20μL，其中：浓度10μmol/L的引物uvr C1和uvr C2各1.0μL， 2×Taq Mixture(Tiangen)10μL，支原体DNA模板1.0μL，去离子水7.0μL。PCR反 应程序：94℃预变性5min，94℃45s，55℃1min，72℃30s，35个循环后，72℃延 伸10min。PCR产物大小为238bp，PCR产物委托上海生物工程技术服务有限公司 进行序列测定。
1.2细菌分离鉴定方法
1.2.1细菌的分离
按照无菌操作取小块病牛肺组织，将组织切面涂于PPLO固体培养基表面， 于含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，同时将小块组织样本投入到PPLO液 体培养基中。2～3d后，用光学显微镜低倍观察菌落形态。固体培养基上生长的 支原体菌落应具有“煎荷蛋样”典型特征，液体培养基应由红色变为黄色，但保 持透亮，同时对照不变色，保持红色。
将上述具有“煎蛋样”典型特征的细菌在不含青霉素的液体培养基中连续传 5代，再接种固体培养基，72h后观察，菌落形态依然保持“煎荷蛋样”典型特 征。将分离菌株冻干保存。
1.2.2细菌的鉴定
1.2.2.1细菌菌落形态的观察
固体培养物72h后在显微镜下观察，菌落呈“煎荷蛋样”形态。
1.2.2.2支原体种群鉴定
从固体平皿上挖取小块带支原体菌落的琼脂于预加入0.5mL灭菌水的 Eppendorf管中，煮沸10min，冰浴1min，12000rpm离心30S，取上清作为DNA 模板。利用16SrRNA通用引物及牛肺疫支原体特异性引物进行PCR扩增，将PCR 产物克隆至质粒pMD18-T(宝生物工程大连有限公司)中，委托上海生物工程技术 服务有限公司进行序列测定。
1.2.2.3牛支原体特异性PCR检测
取在无抗生素培养中连续传至第五代的培养物0.2ml至Eppendorf管中，煮 沸10min，冰浴1min，12000rpm离心30S，取上清作为DNA模板，利用牛支 原体特异性的uvrC基因引物、16srRNA通用引物和牛传染性胸膜肺炎特异性引 物分别进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.2.5动物感染试验
将7头8月龄本地黄牛随机分成两组，对照组3头，实验组4头。实验组通 过喉气管注射感染牛支原体48h培养物3ml。每天观察临床表现，测量体温，采 取鼻拭子。
2实验结果
2.1牛支原体的分离培养
在不含青霉素的液体培养基中连续体外传至第5代，接种固体培养基72h后， 显微镜下观察菌落依然保持“煎荷包蛋”样典型特征(图1)。将菌株命名为 MbovHB0801。
2.2支原体种群鉴定
对16S rRNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序分析，利用BLAST软件进 行序列同源性比较，结果表明所分离支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)，与 GenBank中牛支原体16S rRNA序列(GenBank登录号：U02968)的同源性为99％， 与无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)16S rRNA(GenBank登录号：CU179680)同 源性为99％。
2.3牛支原体PCR检测
对牛支原体保守基因UvrC进行PCR扩增，结果扩增到预期大小的目的条带， 测序证明为牛支原体UvrC基因的同源性为100％，表明牛支原体检测阳性。
2.5动物试验结果
实验组牛在接种新鲜培养的牛支原体菌液24h，既表现出明显得呼吸道症状， 体温上升，随后的时间里连接出现了流涕、咳嗽等症状。接种菌液72h后，剖检 试验牛，观察到牛的肺脏有明显的病理变化，表现为肺“肉样变”病灶，胸腔积 液。从病变的肺组织上无菌取下小块组织涂布PPLO固体培养基，在含有CO2的 培养箱中培养2-3天，显微镜下观察到典型“煎荷蛋样”菌落，16srRNA测序证 实病变是由接种物牛支原体引起。
3实验小结
对分离菌进行培养72h后显微镜观察表明，菌落呈现典型的“煎荷蛋样”菌 落。通过测序和动物回归试验证实分离到的菌株为牛支原体(Mycoplasma bovis)， 命名为Mycoplasma bovis HB0801(MbovHB0801)。
实施例2：
牛支原体弱毒株MbovHB0801-150.2的培育：将本发明分离到的牛支原体 (MbovHB0801株)在体外培养基中高温条件下(41℃)连续传至150代。通过 形态学检测，纯粹性检测、特异性检测和外源细菌检测等试验结果验证了由牛支 原体MbovHB0801培育的150代传代菌株具有典型的牛支原体菌落特征，纯净 无外源细菌污染，命名为MbovHB0801-150.2。动物试验表明，该代次牛支原体 已充分致弱。
1.1试验材料
1.1.1牛支原体培养基：PPLO培养基(含PPLO肉汤粉、酵母粉、丙酮酸钠 MEM、马血清、青霉素和1％酚红)
1.1.2试验动物为8～12月龄的健康黄牛(检测牛支原体感染阴性)。
1.2MbovHB0801弱毒株的培育与鉴定
1.2.1MbovHB0801弱毒株的培育通过将牛支原体强毒株MbovHB0801在体 外培养基中高温条件下(41℃)连续传代的方法传至150代。
1.2.2MbovHB0801弱毒株的形态学观察
将得到的MbovHB0801的第25、50、75、100、125、150代次体外培养物涂 布固体培养基，72h后显微镜下观察菌落形态。
1.2.3MbovHB0801弱毒株的纯净性检验
取MbovHB0801的第25、50、75、100、125、150代次体外培养物，按《中 华人民共和国兽药典》附录进行，应该无其他细菌、霉菌污染。
1.2.4牛支原体特异性PCR检测
取MbovHB0801的第25、50、75、100、125、150代次体外培养物各0.2ml 至Eppendorf管中，煮沸10min，冰浴1min，12000rpm离心30S，取上清作为 DNA模板，利用牛支原体特异性的引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5MbovHB0801弱毒株致弱评价试验
39头8月龄左右健康本地黄牛随即分成5组，1-4组为实验组，第5组为空 白对照组。每组用3个不同浓度(109CFU/ml，1010CFU/ml，3×1010CFU/ml) 的菌接种，每个浓度接种3头。接种细菌分别为：野毒株MbovHB0801，115代 传代株，41℃传代150代株(150-2)，37℃传代150代株接种。对照组接种相 同剂量的PBS缓冲液。观察28天，记录临床症状和发病情况。
肺部病变评分标准如下：
35分制。左尖叶，左心叶，左隔叶，右尖叶，右心叶，右隔叶和右附叶等 7叶，每叶分值为5分，共35分(Vordermeier HM，2002)。赋分标准如下表：
肺病变评分标准
1.2.6MbovHB0801弱毒株免疫力的评价
取150-2代、野毒组和空白对照组牛，接种前、接种后每隔3天采取静脉血 一次，检测抗体水平、IFN-γ(Applied MABTECH，Sweden)和IFN-β(武汉华美生 物工程有限公司)浓度变化。抗体检测采用菌体ELISA，IFN检测用商品试剂盒。
2试验结果
2.1MbovHB0801弱毒株的培育和形态学观察
将传代150代的牛支原体液体培养物接种固体培养基，72h后，显微镜下观 察菌落依然保持“煎蛋样”典型特征，且没有观察到其它类型菌落的存在。将菌 株命名为MbovHB0801-150.2。
2.2MbovHB0801弱毒株的纯净性检验
按《中华人民共和国兽药典》附录进行，无其他细菌、霉菌污染。
2.3牛支原体特异性PCR检测
用牛支原体特异性的引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示， MbovHB0801的第25、50、75、100、125、150代次体外培养物UvrC基因序列 PCR扩增均为阳性(图2)。
2.4MbovHB0801弱毒株毒力评价试验
接种牛观察20天后，扑杀，检查肺的病变，各叶分别打分，计算各头牛肺 的平均得分。由分值可以看出，传至150代菌牛的平均分值明显低于野毒株接种 组，其中150-2代在1010和3×1010浓组分值最低。综合考虑，取150-2代作为疫 苗株侯选菌株。
牛支原体不同传代次数对牛毒力的影响
由上表可以看出，跟野毒株MbovHB0801相比，牛支原体传代弱毒株 MbovHB0801-150.2对牛的致病力有明显的减弱。
2.5MbovHB0801弱毒株免疫力的评价
(1)抗体检测
对野毒株和传代菌株(150-2)接种牛不同时间采集的血清进行抗体检测，采 样时间为接种前(12月7日)，接种后1天(12月11日)、3天(12月13日)、 6天(12月16日)、9天(12月19日)、22天(12月22日)和29天(12月29 日)。血清200倍稀释后进行检测，结果表明，传代菌株和野毒株都能诱导抗体 产生，但抗体水平无显著差异(图3)。
(2)干扰素检测
对感染接种前及接种后1-11天内血液IFN-γ进行检测，发现牛支原体接种未 导致IFN-γ显著升高(图4)。
进一步对IFN-β进行检测，发现传代菌株接种后IFN-β产生较晚。野毒株接 种后IFN-β分泌在感染后1、3、6天逐渐增加，第一天增加就很明显；115代菌 株在接种牛后第1和3天未见IFN-β产生明显增加，但第6天时突然增加至比野 毒株稍低的水泄不平；150-2代能较好的诱导IFN-β产生(图5)。进一步表明150-2 可以做为疫苗毒株的侯选菌株。