一种牛支原体致弱菌株及其应用.pdf

1、(10)授权公告号 CN 102220263 B (45)授权公告日 2012.10.03 CN 102220263 B *CN102220263B* (21)申请号 201110117094.7 (22)申请日 2011.05.06 CCTCC NO ： M2011102 2011.03.31 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (73)专利权人 华中农业大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人 郭爱珍 白智迪 巴晓亮 胡长敏 陈颖钰 彭清洁 张瑞 祁晶晶 崔鹏 陈焕春 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42

2、001 代理人 王敏锋 CN 1522152 A,2004.08.18, 全文 . 胡长敏 . 牛支原体病研究进展 .动物医学 进展 .2009, 第 30 卷 ( 第 8 期 ),73-77. 彭清洁 . 一例奶牛牛支原体乳房炎的诊 断 .2010 年中国牛业进展 .2010, 全文 . (54) 发明名称 一种牛支原体致弱菌株及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种牛支原体致弱菌株及其应 用， 其步骤是 A分离鉴定牛支原体强毒株 ： 通过 病原分离培养、 PCR 检测， 确定其病原为牛支原体 B牛支原体弱毒株的培育 ： 将分离到的牛支原 体在体药物体培养基， 于培养箱中培养， 培养基从

3、红色变成透亮的黄色。. 从上一代菌液取出 1L， 接种 PPLO 培养基， 培养。C试验表明， 该代 次牛支原体已充分致弱。 通过形态学检测， 试验结 果验证了由牛支原体MbovHB0801培育的150代传 代菌株 MbovHB0801-150.2。D该牛支原体致弱 株 MbovHB0801-150.2， CCTCCNO ： M2011102。具有 良好的疫苗开发前景和广阔的临床应用价值， 成 本低、 对动物体刺激性小， 产生巨大的经济效益和 社会效益。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 穆彬 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华

4、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种牛支原体致弱株， 其特征在于 ： 牛支原体 （Mycoplasma Bovis， M.bovis） 致弱株 MbovHB0801-150.2， CCTCC NO ： M2011102。 2. 权利要求 1 所述的一种牛支原体致弱株 MbovHB0801-150.2 在制备预防和控制牛支 原体感染生物制剂的药物中的应用。 3. 权利要求 1 所述的一种牛支原体致弱株 MbovHB0801-150.2 在制备预防牛支原体肺 炎制剂的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102

5、220263 B 2 1/8 页 3 一种牛支原体致弱菌株及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物药物领域， 具体涉及一株由牛支原体强毒株 Mycoplasma bovis HB0801(MbovHB0801) 体外传代致弱的弱毒菌株 MbovHB0801-150.2， 还涉及该致弱菌株在 制备预防和控制由牛支原体所致疾病中的用途。 背景技术 0002 牛支原体 (Mycoplasma bovis) 主要引起牛的肺炎、 关节炎、 乳房炎、 角膜结膜炎 等。该病原于 1961 年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到 (Hale et al.， 1962)。1976 年牛支原体被描述为致呼吸道疾

6、病的主要病因(Gourlay R N et al.， 1976)， 此后不同国家 都有暴发流行， 给养牛业造成了严重的经济损失。欧洲每年约有 25 33的犊牛肺炎是 由牛支原体引起的， 相当于每年损失 1.44 1.92 亿欧元， 其中英国每年就有 190 万头牛患 牛支原体肺炎， 死亡数达 15.7 万头。美国每年由于牛支原体导致的牛呼吸系统疾病和乳腺 疾病所造成损失达 1.40 亿美元， 单个牛场最高感染率达 70。我国于 2008 年首次报道牛 支原体肺炎的流行 ( 石磊等， 2008)， 此后发现该病在我国肉牛养殖为事普遍发生， 造成了 严重的经济损失。 0003 虽然牛支原体自首次发

7、现至今已有 50 年， 但牛支原体所致疾病的防控手段仍处 于初级阶段， 疫苗研究尤其如此， 目前还没有一种高效安全的疫苗用于牛支原体预防。 但由 于药物临床治疗效果差， 疫苗研究一直受到重点关注。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株， 该牛支原体弱毒株对牛的致病 力明显减弱， 但保持良好的免疫原性。 与现有的牛支原体灭活疫苗相比， 该菌株具有制备方 法简单、 成本相对低、 对动物体刺激性小和免疫效果好等优点。 0005 本发明的另一个目的在于提供了一种牛支原体致弱菌株在制备预防和控制牛支 原体所致疾病生物制剂的药物中的应用。 0006 本发明的再一个目的在于提供了一

8、种牛支原体致弱菌株 MbovHB0801-150.2 在制 备治疗或预防牛肺炎的生物制剂的药物中的应用。 0007 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术措施 ： 0008 将从临床分离的牛支原体强毒株 MbovHB0801 在体外液体培养基中高温条件下 (41 ) 连续传至 150 代， 得到牛支原体致弱菌株 MbovHB0801-150.2。 0009 该牛支原体致弱菌株 MbovHB0801-150.2 的制备步骤是 ： 0010 A. 分离鉴定牛支原体强毒株 ： 2008 年， 湖北省从外地引进肉牛中， 陆续报道发生 呼吸道疾病， 牛群引进后不久即发病， 表现为发热、 咳嗽、 流鼻涕，

9、 犊牛和体质弱的架子牛发 病严重， 死亡率可高达 40甚至更高， 病后期可见关节炎和腹泻症状。剖检时， 病理变化主 要集中在胸腔， 以化脓性或干酪样坏死性肺炎为主。 胸腔内有浆液样积液， 肺与胸膜可发生 粘连， 肺组织发生肉变， 并分布大小不等的白色坏死灶， 关节积液等 ( 石磊等， 2008)。通过 说 明 书 CN 102220263 B 3 2/8 页 4 病原分离培养、 PCR 检测与测序分析、 动物回归试验等方法， 确定其病原为牛支原体， 命名为 MbovHB0801。 0011 B. 牛支原体弱毒株 MbovHB0801-150.2 的培育 ： 将本发明分离到的牛支原体 (Mbov

10、HB0801 株 ) 在体外培养基中高温条件下 (41 ) 连续传至 150 代。 0012 具体操作是 ： 0013 . 将牛支原体 MbovHB0801 接种含有酚红的 PPLO 液体培养基， 于 41培养箱中 培养 2-3 天后， 培养基从红色变成透亮的黄色。 0014 . 从上一代菌液取出 1L， 接种新鲜 PPLO 培养基， 于 41恒温培养箱中培养 2-3 天后， 再传下一代， 直到 150 代。 0015 C. 动物试验表明， 该代次牛支原体已充分致弱。通过形态学检测， 纯粹性检测、 特 异性检测和外源细菌检测等试验结果验证了由牛支原体 MbovHB0801 培育的 150 代传

11、代菌 株 MbovHB0801-150.2 具有典型的牛支原体菌落特征， 纯净无外源细菌污染。 0016 D. 该牛支原体致弱株 MbovHB0801-150.2 已提交认可的机构保藏， 其保藏号是 ： CCTCC NO ： M2011102 ； 保藏时间 ： 2011 年 3 月 31 日 ； 保藏单位是 ： 中国典型培养物保藏中 心 ； 保藏地址 ： 中国.武汉.武汉大学， 分类命名 ： 牛支原体MbovHB0801-150.2 Mycoplasma bovis MbovHB0801-150.2。 0017 牛支原体致弱毒株 MbovHB0801-150.2 的具体特征如下 ： 0018

12、A. 形态学特征 ： 形态特性符合细菌分类学中支原体的形态特性， 是一种缺乏细胞 壁、 呈高度多形性、 可通过滤菌器， 并能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微 生物 ； 在固体培养基上形成特征性的 “煎荷包蛋” 样菌落。革兰氏染色阴性， 不易着色， 通常 用吉姆萨染色呈淡紫色。 0019 B. 培养特征 ： 本菌为兼性厌氧菌， 在含 0.8 万单位 /ml 青霉素的 PPLO 培养基平板 上， 于 37在含 5 (v/v) 的 C02的细胞培养箱中培养， 2-3 天后， 用光学显微镜低倍观察菌 落形态， 具有 “煎荷包蛋” 样菌落典型特征 ( 图 1)。 0020 C.生化特性 ：

13、将MbovHB0801-150.2菌液50l加入到生化管中， 置于37恒温培 养箱中， 根据生化管要求判断结果 ( 如下表 )。经与标准 ( 参考兽医微生物学第三版， 陆承 平主编 ) 比对， MbovHB0801-150.2 与牛支原体及无乳支原体生化反应最接近。 0021 0022 牛支原体弱毒株 MbovHB0801-150.2 牛体试验 ： 牛体鼻腔接种不同代次传代菌株， 说 明 书 CN 102220263 B 4 3/8 页 5 观察临床症状， 检测排菌和所诱导的免疫反应， 20 天后扑杀试验牛， 观察组织脏器的病理变 化。将临床症状和病理变化逐一评分， 对分值进行累加， 评价毒力

14、变化。对血液抗体和干扰 素进行检测， 以评价菌株诱导的免疫反应状况。 0023 各项试验结果证实， 体外41下传代150代菌株MbovHB0801-150.2的毒力显著减 弱但保持良好的免疫原性， 可望将其制备成单苗或联苗， 为牛支原体肺炎和其它相关传染 病的预防和控制提供技术手段。 0024 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果 ： 0025 虽然牛支原体自首次发现至今已有 50 年， 主要引起牛的肺炎、 关节炎、 乳房炎、 角 膜结膜炎等， 给世界各国养牛业造成了严重的经济损失。但牛支原体所致疾病的防控手段 仍处于初级阶段， 疫苗研究尤其如此， 目前还没有一种高效安全的疫苗用于牛支原

15、体预防。 我国于2008年首次报道牛支原体肺炎的流行(石磊等， 2008)， 此后发现该病在我国肉牛养 殖业中普遍发生， 造成了严重的经济损失。因此研发一种新型高效的牛支原体疫苗对我国 养牛业的发展显得至关重要。 0026 本发明获得的牛支原体致弱菌株 MbovHB0801-150.2 具有良好的疫苗开发前景和 广阔的临床应用价值， 产品成熟后可用于防治牛支原体引起疾病， 包括肺炎、 乳腺炎和关节 炎等。跟现有的牛支原体灭活疫苗相比， 弱毒菌株制备的疫苗具有制备简单、 成本相对低、 对动物体刺激性小等优点， 推广后可望产生巨大的经济效益和社会效益。 附图说明 0027 图 1 为一种牛支原体致

16、弱菌株的光学显微镜观察图 ( 放大倍数 410)。 0028 图2为一种牛支原体致弱菌株所培育的不同传代次数的牛支原体的PCR产物凝胶 电泳检测图。 0029 图 3 为一种牛支原体致弱菌株 MbovHB0801 和致弱菌株 MbovHB0801-150.2 接种牛 体后， ELISA 检测牛血清抗牛支原体抗体的动态变化图。 0030 图 4 为一种牛支原体致弱菌株接种牛体前后不同时间血液 IFN- 测定结果图。 0031 图 5 一种牛支原体致弱菌株接种牛体前后 6 天内血液 IFN- 的产生比较图。 具体实施方式 0032 下面结合实例来进一步描述本发明， 本发明的优缺点会在描述中得以体现

17、。但是 这些实施例仅是示范性的， 并不对发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的 是， 在不偏离本发明的范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换， 但是 这些修改和替换均属于本发明的保护范围， 0033 实施例 1 ： 0034 牛支原体强毒分离株 (MovHB0801) 的分离鉴定 ： 通过对临床病料进行细菌学分离 培养、 分离菌株的实验室鉴定和动物回归试验， 确定分离到的细菌为牛支原体 (Mycoplasma bovis)， 命名为 Mycoplasma bovis HB0801(MbovHB0801)。 0035 1 材料和方法 0036 1.1 材料 0037 1.

18、1.1 病料 ： 病肺采自 2008 年湖北省多个养殖场送检的以坏死性肺炎为主要病征 说 明 书 CN 102220263 B 5 4/8 页 6 的重症病牛或病死牛。 0038 1.1.2 牛支原体培养基 ： PPLO 培养基 ( 含 PPLO 肉汤粉、 酵母粉、 丙酮酸钠 MEM、 马 血清、 青霉素和 1 (w/v) 酚红 )。 0039 1.1.3 试验动物 ： 8 月龄本地黄牛， 购自湖北松滋当地牛场， 经一周健康检查后， 确 定健康后备用。 0040 1.1.4PCR 扩增鉴定 ： 16sRNA 扩增通用引物， 由发明人设计， 由上海生物工程技术 有限公司合成备用。引物序列如下 ：

19、 0041 16S rRNA forward ： 5 -ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3 0042 16S rRNA reverse ： 3 -CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3 0043 PCR 反应体系为 20L， 其中 2Taq Mixture(Tiangen)10L， Primers(10mol/ L) 各 0.8L， 支原体 DNA 模板 3.0L， 去离子水 5.4L。PCR 反应程序如下 ： 94预变性 10min 后， 94变性 1min， 60退火 1min， 72延伸 1min， 30 个循环后， 72延伸 7min。 00

20、44 PCR 产物在含有溴化乙锭的 0.8 (w/v) 琼脂糖上电泳， 目的带大小应为 1600bp。 PCR 产物委托上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 0045 设计牛传染性胸膜肺炎支原体的特异性引物， 进行 PCR 鉴别诊断。引物序列如下 ： 0046 SC1 ： 5 -ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG-3 0047 SC2 ： 5 -CTGATTATGATGACAGTGGTCA-3 0048 PCR 反 应 体 系 为 20L， 其 中 ： 2Taq Mixture(Tiangen)10L， 引 物 SC1 和 SC2(10mol/L)各1.0L， 支原体DNA

21、模板1.0L， 去离子水7.0L。 PCR反应程序 ： 94 预变性 5min， 变性 45s， 57退火 30s， 72延伸 1min， 35 个循环后， 72延伸 10min。PCR 产 物预期大小为 277bp。 0049 同时， 针对牛支原体UvrC基因(GenBank accession no.AF003959)设计一对特异 性 PCR 引物， 进行牛支原体鉴定。引物序列如下 ： 0050 UvrC1 5 TAATTTAGAAGCTTTAAATGAGCGC3 0051 UvrC2 5 CATATCTAGGTCAATTAAGGCTTTG3 0052 PCR反应体系为20L， 其中 ：

22、浓度10mol/L的引物uvr C1和uvr C2各1.0L， 2Taq Mixture(Tiangen)10L， 支原体 DNA 模板 1.0L， 去离子水 7.0L。PCR 反应程 序 ： 94预变性 5min， 94 45s， 55 1min， 72 30s， 35 个循环后， 72延伸 10min。PCR 产 物大小为 238bp， PCR 产物委托上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 0053 1.2 细菌分离鉴定方法 0054 1.2.1 细菌的分离 0055 按照无菌操作取小块病牛肺组织， 将组织切面涂于 PPLO 固体培养基表面， 于含 5 (v/v)CO2的细胞培养箱中

23、培养， 同时将小块组织样本投入到 PPLO 液体培养基中。2 3d 后， 用光学显微镜低倍观察菌落形态。固体培养基上生长的支原体菌落应具有 “煎荷蛋 样” 典型特征， 液体培养基应由红色变为黄色， 但保持透亮， 同时对照不变色， 保持红色。 0056 将上述具有 “煎蛋样” 典型特征的细菌在不含青霉素的液体培养基中连续传 5 代， 再接种固体培养基， 72h 后观察， 菌落形态依然保持 “煎荷蛋样” 典型特征。将分离菌株冻干 保存。 0057 1.2.2 细菌的鉴定 说 明 书 CN 102220263 B 6 5/8 页 7 0058 1.2.2.1 细菌菌落形态的观察 0059 固体培养物

24、 72h 后在显微镜下观察， 菌落呈 “煎荷蛋样” 形态。 0060 1.2.2.2 支原体种群鉴定 0061 从固体平皿上挖取小块带支原体菌落的琼脂于预加入 0.5mL 灭菌水的 Eppendorf 管中， 煮沸 10min， 冰浴 1min， 12000rpm 离心 30S， 取上清作为 DNA 模板。利用 16SrRNA 通用 引物及牛肺疫支原体特异性引物进行 PCR 扩增， 将 PCR 产物克隆至质粒 pMD18-T( 宝生物工 程大连有限公司 ) 中， 委托上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 0062 1.2.2.3 牛支原体特异性 PCR 检测 0063 取在无抗生素培养中

25、连续传至第五代的培养物 0.2ml 至 Eppendorf 管中， 煮沸 10min， 冰浴1min， 12000rpm离心30S， 取上清作为DNA模板， 利用牛支原体特异性的uvrC基 因引物、 16srRNA 通用引物和牛传染性胸膜肺炎特异性引物分别进行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶 电泳检测扩增产物。 0064 1.2.2.5 动物感染试验 0065 将 7 头 8 月龄本地黄牛随机分成两组， 对照组 3 头， 实验组 4 头。实验组通过喉气 管注射感染牛支原体 48h 培养物 3ml。每天观察临床表现， 测量体温， 采取鼻拭子。 0066 2 实验结果 0067 2.1 牛支原体的分离

26、培养 0068 在不含青霉素的液体培养基中连续体外传至第5代， 接种固体培养基72h后， 显微 镜下观察菌落依然保持 “煎荷包蛋” 样典型特征 ( 图 1)。将菌株命名为 MbovHB0801。 0069 2.2 支原体种群鉴定 0070 对 16S rRNA 进行 PCR 扩增， 并对扩增产物进行测序分析， 利用 BLAST 软件进行 序列同源性比较， 结果表明所分离支原体为牛支原体 (Mycoplasma bovis)， 与 GenBank 中牛支原体 16S rRNA 序列 (GenBank 登录号 ： U02968) 的同源性为 99， 与无乳支原体 (Mycoplasma agala

27、ctiae)16S rRNA(GenBank 登录号 ： CU179680) 同源性为 99。 0071 2.3 牛支原体 PCR 检测 0072 对牛支原体保守基因 UvrC 进行 PCR 扩增， 结果扩增到预期大小的目的条带， 测序 证明为牛支原体 UvrC 基因的同源性为 100， 表明牛支原体检测阳性。 0073 2.5 动物试验结果 0074 实验组牛在接种新鲜培养的牛支原体菌液 24h， 既表现出明显得呼吸道症状， 体温 上升， 随后的时间里连接出现了流涕、 咳嗽等症状。接种菌液 72h 后， 剖检试验牛， 观察到牛 的肺脏有明显的病理变化， 表现为肺 “肉样变” 病灶， 胸腔积液

28、。从病变的肺组织上无菌取 下小块组织涂布 PPLO 固体培养基， 在含有 CO2的培养箱中培养 2-3 天， 显微镜下观察到典 型 “煎荷蛋样” 菌落， 16srRNA 测序证实病变是由接种物牛支原体引起。 0075 3 实验小结 0076 对分离菌进行培养 72h 后显微镜观察表明， 菌落呈现典型的 “煎荷蛋样” 菌落。 通过测序和动物回归试验证实分离到的菌株为牛支原体 (Mycoplasma bovis)， 命名为 Mycoplasma bovis HB0801(MbovHB0801)。 0077 实施例 2 ： 0078 牛支原体弱毒株 MbovHB0801-150.2 的培育 ： 将本

29、发明分离到的牛支原体 说 明 书 CN 102220263 B 7 6/8 页 8 (MbovHB0801 株 ) 在体外培养基中高温条件下 (41 ) 连续传至 150 代。通过形态学检 测， 纯粹性检测、 特异性检测和外源细菌检测等试验结果验证了由牛支原体 MbovHB0801 培育的 150 代传代菌株具有典型的牛支原体菌落特征， 纯净无外源细菌污染， 命名为 MbovHB0801-150.2。动物试验表明， 该代次牛支原体已充分致弱。 0079 1.1 试验材料 0080 1.1.1 牛支原体培养基 ： PPLO 培养基 ( 含 PPLO 肉汤粉、 酵母粉、 丙酮酸钠 MEM、 马 血

30、清、 青霉素和 1酚红 ) 0081 1.1.2 试验动物为 8 12 月龄的健康黄牛 ( 检测牛支原体感染阴性 )。 0082 1.2MbovHB0801 弱毒株的培育与鉴定 0083 1.2.1MbovHB0801 弱毒株的培育通过将牛支原体强毒株 MbovHB0801 在体外培养 基中高温条件下 (41 ) 连续传代的方法传至 150 代。 0084 1.2.2MbovHB0801 弱毒株的形态学观察 0085 将得到的MbovHB0801的第25、 50、 75、 100、 125、 150代次体外培养物涂布固体培养 基， 72h 后显微镜下观察菌落形态。 0086 1.2.3Mbov

31、HB0801 弱毒株的纯净性检验 0087 取MbovHB0801的第25、 50、 75、 100、 125、 150代次体外培养物， 按 中华人民共和国 兽药典 附录进行， 应该无其他细菌、 霉菌污染。 0088 1.2.4 牛支原体特异性 PCR 检测 0089 取 MbovHB0801 的 第 25、 50、 75、 100、 125、 150 代 次 体 外 培 养 物 各 0.2ml 至 Eppendorf管中， 煮沸10min， 冰浴1min， 12000rpm离心30S， 取上清作为DNA模板， 利用牛支 原体特异性的引物进行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测。 0090 1

32、.2.5MbovHB0801 弱毒株致弱评价试验 0091 39 头 8 月龄左右健康本地黄牛随即分成 5 组， 1-4 组为实验组， 第 5 组为空白对 照组。每组用 3 个不同浓度 (109CFU/ml， 1010CFU/ml， 31010CFU/ml) 的菌接种， 每个浓度接 种 3 头。接种细菌分别为 ： 野毒株 MbovHB0801， 115 代传代株， 41传代 150 代株 (150-2)， 37传代 150 代株接种。对照组接种相同剂量的 PBS 缓冲液。观察 28 天， 记录临床症状和 发病情况。 0092 肺部病变评分标准如下 ： 0093 35分制。 左尖叶， 左心叶，

33、左隔叶， 右尖叶， 右心叶， 右隔叶和右附叶等7叶， 每叶分 值为 5 分， 共 35 分 (Vordermeier HM， 2002)。赋分标准如下表 ： 0094 肺病变评分标准 0095 0096 1.2.6MbovHB0801 弱毒株免疫力的评价 0097 取150-2代、 野毒组和空白对照组牛， 接种前、 接种后每隔3天采取静脉血一次， 检 说 明 书 CN 102220263 B 8 7/8 页 9 测抗体水平、 IFN-(Applied MABTECH， Sweden) 和 IFN-( 武汉华美生物工程有限公司 ) 浓度变化。抗体检测采用菌体 ELISA， IFN 检测用商品试剂

34、盒。 0098 2 试验结果 0099 2.1MbovHB0801 弱毒株的培育和形态学观察 0100 将传代 150 代的牛支原体液体培养物接种固体培养基， 72h 后， 显微镜下观察 菌落依然保持 “煎蛋样”典型特征， 且没有观察到其它类型菌落的存在。将菌株命名为 MbovHB0801-150.2。 0101 2.2MbovHB0801 弱毒株的纯净性检验 0102 按 中华人民共和国兽药典 附录进行， 无其他细菌、 霉菌污染。 0103 2.3 牛支原体特异性 PCR 检测 0104 用牛支原体特异性的引物进行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测显示， MbovHB0801 的第 25、

35、 50、 75、 100、 125、 150 代次体外培养物 UvrC 基因序列 PCR 扩增均为阳性 ( 图 2)。 0105 2.4MbovHB0801 弱毒株毒力评价试验 0106 接种牛观察 20 天后， 扑杀， 检查肺的病变， 各叶分别打分， 计算各头牛肺的平均得 分。由分值可以看出， 传至 150 代菌牛的平均分值明显低于野毒株接种组， 其中 150-2 代在 1010和 31010浓组分值最低。综合考虑， 取 150-2 代作为疫苗株侯选菌株。 0107 牛支原体不同传代次数对牛毒力的影响 0108 0109 由 上 表 可 以 看 出，跟 野 毒 株 MbovHB0801 相

36、比，牛 支 原 体 传 代 弱 毒 株 MbovHB0801-150.2 对牛的致病力有明显的减弱。 0110 2.5MbovHB0801 弱毒株免疫力的评价 0111 (1) 抗体检测 0112 对野毒株和传代菌株 (150-2) 接种牛不同时间采集的血清进行抗体检测， 采样时 间为接种前(12月7日)， 接种后1天(12月11日)、 3天(12月13日)、 6天(12月16日)、 说 明 书 CN 102220263 B 9 8/8 页 10 9 天 (12 月 19 日 )、 22 天 (12 月 22 日 ) 和 29 天 (12 月 29 日 )。血清 200 倍稀释后进行检 测，

37、结果表明， 传代菌株和野毒株都能诱导抗体产生， 但抗体水平无显著差异 ( 图 3)。 0113 (2) 干扰素检测 0114 对感染接种前及接种后 1-11 天内血液 IFN- 进行检测， 发现牛支原体接种未导 致 IFN- 显著升高 ( 图 4)。 0115 进一步对 IFN- 进行检测， 发现传代菌株接种后 IFN- 产生较晚。野毒株接种 后 IFN- 分泌在感染后 1、 3、 6 天逐渐增加， 第一天增加就很明显 ； 115 代菌株在接种牛后 第 1 和 3 天未见 IFN- 产生明显增加， 但第 6 天时突然增加至比野毒株稍低的水泄不平 ； 150-2 代能较好的诱导 IFN- 产生 ( 图 5)。进一步表明 150-2 可以做为疫苗毒株的侯选 菌株。 说 明 书 CN 102220263 B 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102220263 B 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102220263 B 12 3/3 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 102220263 B 13