技术领域
本发明涉及一种细胞培养支架的制备方法，尤其涉及一种能够适用于多种细胞培养的三维细胞培养支架的制备方法，属于细胞培养技术领域。
本发明还涉及一种细胞培养装置，尤其涉及一种能够适用于多种细胞培养的三维细胞培养装置，属于细胞培养技术领域。
背景技术
研究观察细胞的形态结构和生命活动的技术手段已用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种科学研究。它已成为生命研究的一种前期必要的筛选和预实验手段，二维细胞培养并建立模型对我们深入研究细胞行为、感染以及疾病发生机理做出了巨大的贡献，而且已成为分子生物学和基因工程学、细胞工程、抗体工程等重要组成部分。
随着技术发展和培养方法的改进，近些年发现在体外二维培养的细胞的基因表达、信号转导和形态学都可能与在生物体的细胞有差异。目前体外用于细胞研究的都为二维细胞培养，它只能部分反映细胞学特性，再则通常体外培养几代之后细胞正常的形态不仅会有所变化，而且其生化特征和一些正常生物学功能都会有所改变，致使实验结果有效性降低。随着三维细胞培养方法的建立将为该项工作提供高效研究手段，三维细胞培养是完全模拟生物体内环境，使培养的细胞具有最佳的生存能力和分化程度，对药物试验的评价会更加有效和准确。有科学家应用二维和三维细胞培养方法对人胶质母细胞瘤细胞的形成率、大小和存活率以及表达蛋白功能进行了研究，并发现三维培养的细胞表达了适当的蛋白，而对应的二维培养的细胞则没有表达适当的蛋白。可见不同培养方法对细胞功能与形态有着直接影响。
三维细胞培养的生物反应器研制进展迅速，而且种类多样，各有不同特点，都是以不同的方式提供给细胞最适宜的生长环境，目前较有代表性的有搅拌式、中空纤维、旋转等各种生物反应器。但由于生物细胞种类繁多而且所需要的环境和培养条件各不相同，所以不同细胞在支架上的生长、移植等往往需要不同孔结构、孔隙、孔大小以及孔形状的细胞支架。
此外，由于目前常用的致孔剂制孔法和静电纺丝法制备的细胞支架所用材料问题, 不论是支架质地,支架材料表面化学特征还是细胞支架的孔结构、孔隙、孔的大小以及孔的形状等都不能完全满足所有细胞在支架上的生长、移植等需要,可能适用于某些细胞,而对另外一些细胞生长分化等可能还会有不同程度影响。
所以目前为止，仍然没有一种细胞支架能完全同时满足多种细胞的黏附、浸润、持续分化以及细胞长期生长的需要。
有鉴于此，有必要对现有三维细胞培养支架予以改进，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供两种三维细胞培养支架的制备方法，所述制备方法通过在制备三维细胞培养支架时加入不同比例或种类的纳米颗粒，从而改变支架质地使之能够适合多种细胞的培养。
本发明的另一目的在于提供两种三维细胞培养装置，所述培养装置具有利用上述三维细胞培养支架制备方法制备的支架，该支架的质地由于加入了纳米颗粒而得到改变，因此能够适用于多种细胞的培养。
为实现上述发明目的之一，本发明的一种三维细胞培养支架的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.称取1~10g的聚合物溶于10~100ml的有机溶剂中，配置成聚合物溶液；
b.称取0~500mg增塑剂，加入到上述聚合物溶液中，混合均匀；
c.称取羟基磷灰石胶纳米颗粒1.2~2g；银纳米颗粒0.9~2g；氧化锌纳米颗粒1.5~2g；壳聚糖纳米颗粒0.8~2g，加入到经过步骤b处理的溶液中，混合均匀，获得纺丝原液；
d.将所述纺丝原液注入到静电纺丝设备中，进行静电纺丝处理，在静电纺丝设备的接收装置上获得纺丝；
e.将所获得的纺丝进行烘干处理，即制得三维细胞培养支架。
作为本发明的进一步改进，所述静电纺丝法的纺丝条件为：电压：10~70kv，接收距离：5~26cm，出样速度：0.5~3.0ml/h。
作为本发明的进一步改进，所述羟基磷灰石胶纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒的粒径范围为：10~500nm。
作为本发明的进一步改进，步骤a中所述聚合物为聚氯乙烯（Polyvinylchloride，PVC），步骤a中所述有机溶剂为四氢呋喃，步骤b中所述增塑剂为邻苯二甲酸二辛脂或者癸二酸二辛酯。
为实现上述发明目的之一，本发明的一种三维细胞培养支架的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.称取形成细胞培养支架的第一基质材料5~50g，第二基质材料5~50g;
b.称取有机溶剂1~10g，将所述基质材料溶于有机溶剂中，混合均匀,形成混合溶液；
c.称取羟基磷灰石胶纳米颗粒0.8~2g；银纳米颗粒0.5~2g；氧化锌纳米颗粒1.1~2g；壳聚糖纳米颗粒1.3~2g，加入到所述混合溶液中，混合均匀；
d.向经过步骤c处理的混合溶液中加入二氧化硅颗粒，混合均匀；
e.将加入二氧化硅颗粒的混合溶液烘干，并用酸性溶液浸泡烘干物溶去二氧化硅，获得三维细胞培养支架。
作为本发明的进一步改进，所述羟基磷灰石胶纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒的粒径范围为：10~500nm。
作为本发明的进一步改进，步骤a中所述第一基质材料为左旋聚乳酸，所述第二基质材料为加聚己内酯。
作为本发明的进一步改进，步骤b中所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，步骤e中所述酸性溶液为氢氟酸。
为实现上述另一发明目的，本发明提供一种三维细胞培养装置，所述三维细胞培养装置包括所述第一种三维细胞培养支架的制备方法制得的三维细胞培养支架。
为实现上述另一发明目的，本发明提供一种三维细胞培养装置，所述三维细胞培养装置包括所述第二种三维细胞培养支架的制备方法制得的三维细胞培养支架。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用本发明的三维细胞培养支架制备方法获得的支架无毒性，且能够为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞间联系，既有利于各类细胞的分化定向诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；又可望在体外构建与各类组织、器官相应的三维细胞生长类似物或等同物。细胞在此支架中生长良好，细胞呈多面体，含有丰富的微绒毛、线粒体，并且细胞之间能够紧密连接。同时，通过控制不同比例或者种类的纳米颗粒的加入以及根据纳米材料的特点能够制备出满足部分癌细胞、肝细胞、上皮细胞、神经纤维细胞等多种细胞的黏附、增生、浸润、持续分化以及细胞长期生长的需要的三维细胞培养支架。
附图说明
图1为静电纺丝法中制得的实心纺丝的示意图；
图2为静电纺丝法中制得的空心纺丝的示意图；
图3为本发明的一具体实施方式中利用静电纺丝法制得的三维细胞培养支架的示意图；
图4为本发明的另一具体实施方式中利用致孔剂制孔法制得的三维细胞培养支架的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但这些实施例并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据实施例所作出等效变换或等效替代均包含在本发明的保护范围内。
本发明利用不同方法及材料建立各种支架或和不同基质，使细胞在培养时呈空间立体方式生长,让细胞在培养时其生长环境与生长模式更接近于生物体内,这样培养的细胞不但形态而且生理功能亦与生物体内的更为近似,用于实验时结果将更为可信。
在第一实施方式中，采用静电纺丝法制备三维细胞培养支架，静电纺丝设备包括：高压电源、溶液储存装置、喷射装置、接收装置。可通过控制电压高度、液体粘稠度、毛细喷头粗细、接收距离、注射泵或压力泵压力等方法获得不同纤维直径和孔径及孔型的支架，以适合各种不同细胞生长的需要。还可根据实验需要制得实心或空心纺丝以满足贴近支架细胞的生长需求。
如图1所示，为制得的实心纺丝的示意图。
如图2所示，为制得的空心纺丝的示意图。
所述高压电源的电压范围为：10～70kv。
所述接收距离为喷射装置到接收装置的距离。
本实施方式中，三维细胞培养支架的制备方法包括如下步骤：
a.称取1~10g的聚合物溶于10~100ml的有机溶剂中，配置成聚合物溶液，聚合物包括聚氯乙烯（Polyvinylchloride，PVC）等，有机溶剂包括四氢呋喃等。
b.称取0~500mg增塑剂，加入到上述聚合物溶液中，混合均匀。增塑剂包括邻苯二甲酸二辛脂、癸二酸二辛酯等。
c.称取羟基磷灰石胶纳米颗粒0~2g；银纳米颗粒0~2g；氧化锌纳米颗粒0~2g；壳聚糖纳米颗粒0~2g，加入到经过步骤b处理的溶液中，混合均匀，获得纺丝原液。其中上述纳米颗粒的粒径范围为：10~500nm。
d.将所述纺丝原液注入到静电纺丝设备中，进行静电纺丝处理，在静电纺丝设备的接收装置上获得纺丝。静电纺丝的纺丝条件为：电压：10~70kv，接收距离：5~26cm，出样速度：0.5~3.0ml/h。
e.将所获得的纺丝进行烘干处理，即制得三维细胞培养支架。
在第二实施方式中，采用致孔剂制孔法制备三维细胞培养支架，该方法包括如下步骤：
a.称取形成细胞培养支架的第一基质材料5~50g，第二基质材料5~50g，第一基质材料包括左旋聚乳酸等，第二基质材料包括加聚己内酯等。
b.称取有机溶剂1~10g，将所述基质材料溶于有机溶剂中，混合均匀,形成混合溶液，有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺等。
c.称取羟基磷灰石胶纳米颗粒0~2g；银纳米颗粒0~2g；氧化锌纳米颗粒0~2g；壳聚糖纳米颗粒0~2g，加入到所述混合溶液中，混合均匀。其中上述纳米颗粒的粒径范围为：10~500nm。
d.向经过步骤c处理的混合溶液中加入二氧化硅颗粒，混合均匀。
e.将加入二氧化硅颗粒的混合溶液烘干，并用酸性溶液浸泡烘干物溶去二氧化硅，获得三维细胞培养支架。所述酸性溶液包括氢氟酸等。
以下结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例一：利用静电纺丝法制备三维细胞培养支架
本具体实施方式中，聚合物为：聚氯乙烯（Polyvinylchloride，PVC）；有机溶剂为：四氢呋喃；增塑剂为：邻苯二甲酸二辛脂。
取聚氯乙烯粉末5g溶于65ml四氢呋喃中，根据实验可加适量增塑剂邻苯二甲酸二辛脂275mg，为了使聚氯乙烯分子链间引力的削弱变得柔软富有弹性，分别加入10～500nm的羟基磷灰石胶纳米颗粒1.2g，银纳米颗粒0.9g，氧化锌纳米颗粒1.5g，壳聚糖纳米颗粒0.8g，并将它们混合均匀。然后，在电压45kV，接收距离17cm，出样速度每小时1.8ml，接收屏为铝箔（亦可用滚筒收集纺丝）的条件下，制得有序状纺丝，然后将纺丝烘干，即得用于细胞培养的三维细胞支架。
如图3所示，为利用上述实施例的方法制得的三维细胞培养支架的示意图。
实施例二：利用致孔剂制孔法制备三维细胞培养支架
本具体实施方式中，第一基质材料为：左旋聚乳酸；第二基质材料为：加聚己内酯；有机溶剂为：N，N-二甲基甲酰胺；酸性溶液为氢氟酸。
称取左旋聚乳酸38g，加聚己内酯42g与N，N-二甲基甲酰胺7.5g。将左旋聚乳酸、加聚己内酯加入到N，N-二甲基甲酰胺中，混合均匀。然后，分别加10～500nm的羟基磷灰石胶纳米颗粒0.8g，氧化锌纳米颗粒1.1g，银纳米颗粒0.5g，壳聚糖纳米颗粒1.3g混匀，在复合物并加入直径为10～50微米的二氧化硅颗粒混合制成各种形态，烘干后用氢氟酸浸泡溶去二氧化硅颗粒即得圆孔型细胞培养支架。
如图4所示，为利用实施例二的方法制得的三维细胞培养支架的示意图。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。