八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103436620 B (45)授权公告日 2015.02.04 CN 103436620 B (21)申请号 201310379653.0 (22)申请日 2013.08.27 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (73)专利权人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工路 2 号 (72)发明人 孙世国 彭孝军 李志勇 王继涛 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 贾汉生 李馨 蔡元志 . 葫芦脲 （瓜环） 及其超分子化学简 介 。

2、.兴义民族师范学院学报 .2010,( 第 3 期 ), 张同艳等 . 紫精与八元瓜环的超分子组装及 光切割质粒 DNA.高等学校化学学报 .2012, 第 33 卷 ( 第 2 期 ), 康燕等 . 分子信标研究进展 .化学传感 器 .2008, 第 28 卷 ( 第 2 期 ), (54) 发明名称 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和 应用 (57) 摘要 本发明提供了一种八元瓜环自组装型分子信 标， 其特征在于， 所述八元瓜环自组装型分子信标 为发夹型分子， 包括由核苷酸序列组成的茎 - 环 结构、 荧光团 F 和淬灭团 Q、 在带有荧光团 F 的一 端有一个萘和 / 或其衍生物官能。

3、团、 在带有淬灭 团 Q 的一端有一个紫晶和 / 或其衍生物官能团、 所述萘和 / 或其衍生物官能团及紫晶和 / 或其衍 生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的 空腔内。本发明的分子信标可最大限度消除背景 荧光， 提高检测灵敏度， 特别地， 即使发生核酸酶 降解， 其荧光团 F 和淬灭团 Q 仍将被八元瓜环 “锁 定” ， 不会产生假阳性信号， 为分子信标性能优化 提供了一种创新思路， 对分子生物学和生物医学 的发展具有重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张艳青 权利要求书 5 页 说明书 14 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明。

4、专利 权利要求书5页 说明书14页 附图5页 (10)授权公告号 CN 103436620 B CN 103436620 B 1/5 页 2 1. 一种八元瓜环自组装型分子信标， 其特征在于， 所述八元瓜环自组装型分子信标为 发夹型分子， 包括由核苷酸序列组成的茎-环结构、 荧光团F和淬灭团Q、 在带有荧光团F的 一端有一个萘或其衍生物官能团、 在带有淬灭团 Q 的一端有一个紫晶或其衍生物官能团、 所述萘或其衍生物官能团及紫晶或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的 空腔内， 其结构式如通式所示 ： 通式中， 表示由核苷酸序列组成的茎 - 环结构， 其中环部分为与所要特异性识别的碱基序。

5、 列成互补的单链碱基序列， 茎部分为由 5-8 对互补的碱基序列组成的双链结构 ； 表示八元瓜环 ； Ax、 Ay 各自独立地选自 C1-10烷基、 C1-10烷基氨基、 C1-10烷氧基、 C1-10酰胺基、 C1-10卤代烷 基和 (CH2)xO(CH2)y， 其中 x、 y 为 1 10 的整数 ； F 独立地选自荧光素类染料、 罗丹明类染料、 菁染料、 二苯乙烯、 萘酰亚胺、 香豆素类、 吖 啶类、 芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种 ； Q 独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团 ； R1、 R2、 R3和 R4各自独立地选自 H、 C1-6烷基、 CHO、 COOH、 NH2、 C。

6、1-6烷基氨基、 OH、 SH、 C1-6 烷氧基、 C1-6酰胺基、 取代或未取代的苄基、 卤素和 C1-6卤代烷基 ； m、 n 为 1 10 的整数。 2. 一种用于制备八元瓜环自组装型分子信标的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： (1) 合成带有紫晶或其衍生物官能团及 NHS 酯活性基团的淬灭团 权 利 要 求 书 CN 103436620 B 2 2/5 页 3 (a) 中间体 I 的合成 将化合物 a、 EDC、 NHS 溶解在干燥四氢呋喃、 乙腈、 DMF 或其混合溶剂中搅拌并加热至 50-100， 反应 6-12h 后旋转蒸发除去溶剂， 得到的油状物质用二氯甲烷溶解后， 硅。

7、胶色谱 柱层析分离， 得到中间体 I ； (b) 中间体 II 的合成 将中间体 I、 三乙胺、 DMAP 在丙酮、 乙腈、 二氯甲烷或其混合溶剂中冰浴搅拌 5-20min， 将对甲苯磺酰氯溶入二氯甲烷中， 然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中反应过夜， 旋 转蒸发蒸干溶剂， 用二氯甲烷溶解， 再加入冰水洗涤， 分液后干燥， 得到二氯甲烷溶液， 蒸干 溶剂， 残渣用二氯甲烷溶解后， 硅胶色谱柱分离， 得到中间体 II ； (c) 中间体 III 的合成 将中间体 II、 NaI 加入丙酮、 乙腈、 四氢呋喃或其混合溶剂中， 回流 6-12h， 过滤除去固 体， 旋转蒸发除去溶剂， 用二氯甲烷溶。

8、解后用硅胶色谱柱分离， 得到中间体 III ； (d) 淬灭团 IV 的合成 将中间体 III 与带有取代基 R2的单边紫晶衍生物 b 溶入干燥乙腈、 DMF 或其混合溶剂 中， 氮气保护下回流 12-48h， 反应结束后过滤， 用 CH2Cl2洗涤， 得到淬灭团 IV ； (2) 合成带有萘或其衍生物官能团及 2- 氰乙基 -N,N- 二异丙基亚磷酰胺的荧光团 权 利 要 求 书 CN 103436620 B 3 3/5 页 4 (a) 中间体 V 的合成 将化合物 c 和 d 溶于乙二醇单甲醚、 DMF 或其混合溶剂中， 氮气保护下回流 6-12h， 停止 反应后旋转蒸发除去溶剂， 用 C。

9、H2Cl2溶解固体， 硅胶柱层析得到中间体 V ； (b) 荧光团 VI 的合成 分别将中间体和 2- 氰乙基 N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺 e 溶解在干燥二氯甲烷、 四 氢呋喃、 乙腈或其混合溶剂中， 先向 V 溶液中加入 N,N- 二异丙基乙胺， 再在氮气保护下缓 慢滴加 2- 氰乙基 N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺溶液， 室温反应 10-60min 后， 反应液用饱和 NaHCO3溶液洗涤， 有机相用无水 Na2SO4干燥， 过滤后旋转蒸发除去溶剂， 硅胶柱层析纯化得 到荧光团 VI ； (3) 八元瓜环自组装型分子信标的制备 (a) 核苷酸序列的合成 采用常规的固相亚磷酰胺三酯法在 。

10、DNA 自动合成仪上得到需要的核苷酸序列 ； (b) 在核苷酸序列的 5 端连接荧光团 经过脱 DMT、 偶联、 封闭、 氧化四步反应将荧光团 VI 连接到核苷酸序列上， 然后用 25 的浓氨水于55-75下反应8-15h进行氨解， 将核苷酸序列从CPG上切除下来同时脱掉荧光 团VI上的氰乙基保护基， 将得到的溶液在冰上冷却， 真空除去氨， 离心除去CPG后即可得到 5 端带有荧光团的核苷酸序列 ； (c) 在核苷酸序列的 3 端连接淬灭团 在核苷酸序列的 3 -OH 端修饰上一个带 Ax 的氨基末端， 然后与带有 NHS 酯活性基团 的淬灭团 IV 反应， 经 HPLC 分离纯化， 得到在核。

11、苷酸序列的 5 端、 3 端分别连接荧光团和淬 灭团的核苷酸序列， 即新型 MB ； (d) 将该新型 MB 与八元瓜环的水溶液混合， 萘或其衍生物官能团及紫晶或其衍生物官 能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内， 得到八元瓜环自组装型 MB ； 权 利 要 求 书 CN 103436620 B 4 4/5 页 5 上述各反应式中， Ax、 Ay 各自独立地选自 C1-10烷基、 C1-10烷基氨基、 C1-10烷氧基、 C1-10酰胺基、 C1-10卤代烷 基和 (CH2)xO(CH2)y， 其中 x、 y 为 1 10 的整数 ； Ax 为 Ax 的反应前体 ； F 独立地选自荧光素类。

12、染料、 罗丹明类染料、 菁染料、 二苯乙烯、 萘酰亚胺、 香豆素类、 吖 啶类、 芳香烃类及其衍生物官能团中的任意一种 ； Q 独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团 ； R1、 R2、 R3和 R4各自独立地选自 H、 C1-6烷基、 CHO、 COOH、 NH2、 C1-6烷基氨基、 OH、 SH、 C1-6 烷氧基、 C1-6酰胺基、 取代或未取代的苄基、 卤素和 C1-6卤代烷基 ； m、 n 为 1 10 的整数 ； X 表示卤素 ； 表示 CPG 微珠，表示八元瓜环。 权 利 要 求 书 CN 103436620 B 5 5/5 页 6 3. 权利要求 1 所述的八元瓜环自组装型分子。

13、信标在非疾病诊断或治疗目的特异性识 别核苷酸序列中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103436620 B 6 1/14 页 7 八元瓜环自组装型分子信标及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种八元瓜环 （CB8） 自组装型分子信标及其制备方法和应用。 背景技术 0002 1996 年， Tyagi 和 Krammer 设计了一种可以特异性识别核苷酸序列的新型荧光探 针 - 分子信标 （Molecular Beacon， MB） ， 它是由寡核苷酸形成的发夹型分子， 分子的一端标 记荧光染料， 另一端标记淬灭团。 该探针与核苷酸靶分子杂交后发生构象变化而发出荧光， 没有识别靶序。

14、列的 MB 不发荧光， 可以不必从检测体系中分离出来， 大大简化了操作。茎环 结构使 MB 对靶序列的识别有很强的特异性， 甚至可以区分单碱基错配。由于其独特的性质 和多功能性， MB 在短时间内即得到了迅速发展， 广泛应用于实时定量 PCR 监测、 核苷酸动态 定量测定、 活细胞成像以及 DNA/ 蛋白质相互作用研究等， 临床医学上用于 SARS 病毒、 乙肝 病毒及癌症诊断等， 并且其应用领域仍在不断拓展。 0003 随着 MB 应用研究的深入开展， 特别是后基因组时代的到来， 对细胞内 mRNA 的表 达、 折叠、 运输和亚细胞定位的了解显得愈发重要， 尤其是在单个活细胞内进行 mRNA。

15、 追踪， 对于广大生物学家和化学家来说更是一个富有挑战性的课题。要想实现 MB 对活体 mRNA 的 高灵敏检测， 必须面对以下二个方面的挑战 ： 第一是核苷酸酶对 MB 骨架的降解和破坏， 其 不可避免地产生假阳性信号 （MB 包括一段核苷酸片断， 普通 MB 在细胞中稳定存在的时间大 概为 45 分钟， 随后细胞内核苷酸酶的酶切使荧光团与淬灭团分开， 背景信号显著增强） ； 第 二是灵敏度， 尽管 MB 已经具有其他核苷酸探针无可比拟的灵敏度， 但在不进行扩增的情况 下， 要实时监测单细胞内低丰度目标物， 其灵敏度仍远远不够。 0004 为解决上述问题， 研究者开展了大量的工作。首先， 为。

16、避免核苷酸酶降解， 提高 MB 在细胞中的稳定性， 尝试对 MB 的结构进行各种改造修饰。如采用 2 - 氧 - 甲基化碱基修饰 MB、 硫代修饰 MB、 肽核苷酸 MB（PNA） 等。但遗憾的是， 2 - 氧 - 甲基化碱基修饰的 MB 与蛋 白质可以进行非特异性结合， 在细胞内背景信号很强 ； 硫代化 MB 本身毒副作用比较大 ； 肽 核苷酸 MB 受限于其溶解度和团聚现象， 使其应用受到了限制。 0005 提高灵敏度的研究则主要集中在增强荧光团的荧光强度和提高淬灭团的淬灭 效率两个方面。在荧光团的改进方面， Tan 研究组将具有高量子产率的水溶性聚电解 质 PPEs（Poly(pheny。

17、lene ethynylene)）通过聚合反应联结到 DNA 的末端作为分子 信标的荧光团， 虽然增强了分子信标与靶分子结合后的荧光信号强度， 一定程度上提 高了检测灵敏度， 但其合成相对复杂 （Huang H.,et al.Design of a modular-based fluorescent conjugated polymer for selective sensing.Angewandte Chemie International Edition,2004,43:5635-5638） 。Kim 等设计了一种用巯基乙酸包覆的量 子点作为荧光团的分子信标， 但其灵敏度还有待提高 （Ki。

18、m J.H.,et al.Adaptation of inorganic quantum dots for stable molecular beacons.Sensors and Actuators B:Chemical,2004,102:315-319） 。在提高淬灭团的淬灭效率方面， Tan 研究组将多个淬灭 团同时修饰在分子信标上形成超淬灭分子信标， 与带有单个淬灭团的分子信标相比， 其灵 说 明 书 CN 103436620 B 7 2/14 页 8 敏度提高了将近 14 倍， 但其合成难度及加工成本显著增加 （Yang C.J.,et al.Molecular assembly o。

19、f superquenchers in signaling molecular interactions.Journal of the American Chemical Society,2005,127:12772-12773） 。 发明内容 0006 目前对分子信标性能的改进都是围绕其茎 - 环结构， 以及对荧光团、 淬灭团进行 修饰和调整， 但现有方法都不能同时解决核苷酸酶切带来的假阳性和提高灵敏度两个难 题。 其根本原因是， 现有分子信标中荧光团和淬灭团与核苷酸的连接都是借助柔性的长链， 两者在空间上的相对自由势必导致彼此不能最大限度靠近， 而荧光团与淬灭团在空间上的 充分靠近是其发生。

20、能量转移导致荧光淬灭的必要前提。 0007 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种能同时解决这两个难题的八元瓜 环自组装型分子信标， 并提供该分子信标的制备方法和应用。 0008 本发明的发明人经大量研究发现， 解决假阳性信号的有效办法是保证核苷酸酶切 后荧光信号团和淬灭团彼此不发生分离， 而提高荧光灵敏度的有效途径则是最大限度降低 其背景荧光。 0009 依据文献， 电子云密度较高的 2,6- 二羟基萘 （Np(OH)2） 可以在带有正电荷的甲 基紫晶 （MV2+） 陪伴下， 通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内， 三者自组装得到稳定 性较高的 1 1 1 配位化合物 - 甲基紫晶 。

21、/2,6- 二羟基萘 / 八元瓜环 （MV2+/Np(OH)2/ CB8） 。而染料与八元瓜环的自组装建立在热力学最稳定的构型基础之上。本发明的发 明人在该现象的基础上通过深入研究， 发现如果将萘及其衍生物引入到分子信标的荧光团 末端， 将紫晶及其衍生物引入到淬灭团末端， 利用八元瓜环独特的自组装特性将分子信标 的荧光团和淬灭团在底部 “套箍” 在一起， 再加上分子信标茎部碱基对的 “束缚” ， 就可彻底 消除两者在空间上的相对自由度使彼此充分靠近， 获得最高效率的荧光淬灭及高的信背比 （signal-background ratio） ， 大大提高检测灵敏度。此外， 即使发夹的茎部被核苷酸酶。

22、降 解切开， 八元瓜环仍能将荧光团和淬灭团紧紧 “锁定” ， 彼此不能分离， 因此不会产生核苷酸 酶切造成的假阳性信号， 显著提高检测灵敏度。 0010 本发明的八元瓜环自组装型分子信标正是基于上述设计思想完成的发明， 其特征 在于， 所述八元瓜环自组装型分子信标为发夹型分子， 包括由核苷酸序列组成的茎 - 环结 构、 荧光团F和淬灭团Q、 在带有荧光团F的一端有一个萘和/或其衍生物官能团、 在带有淬 灭团Q的一端有一个紫晶和/或其衍生物官能团、 所述萘和/或其衍生物官能团及紫晶和/ 或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内， 其结构式如通式所示 ： 0011 说 明 书 CN 。

23、103436620 B 8 3/14 页 9 0012 通式中， 0013 表示由核苷酸序列组成的茎 - 环结构， 其中环部分为与所要特异性识别的碱 基序列成互补的单链碱基序列， 茎部分为由 5-8 对互补的碱基序列组成的双链结构 ； 0014 表示八元瓜环 ； 0015 Ax、 Ay 各自独立地选自 C1-10烷基、 C1-10烷基氨基、 C1-10烷氧基、 C1-10酰胺基、 C1-10卤 代烷基和 (CH2)xO(CH2)y， 其中 x、 y 为 1 10 的整数 ； 0016 F 独立地选自荧光素类染料、 罗丹明类染料、 菁染料、 二苯乙烯、 萘酰亚胺、 香豆素 类、 吖啶类、 芳香烃。

24、类及其衍生物官能团中的任意一种 ； 0017 Q 独立地选自偶氮类染料及其衍生物官能团 ； 0018 R1、 R2、 R3和 R4各自独立地选自 H、 C1-6烷基、 CHO、 COOH、 NH2、 C1-6烷基氨基、 OH、 SH、 C1-6烷氧基、 C1-6酰胺基、 取代或未取代的苄基、 卤素和 C1-6卤代烷基 ； 0019 m、 n 为 1 10 的整数。 0020 除另有说明外， 本文中使用的术语 “烷基” 包括直链烷基和支链烷基。例如，“C1-6 烷基” 包括 C6烷基、 C5烷基、 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本 说明书中使用的其它基团。本文中使用。

25、的术语 “卤素” 包括氟、 氯、 溴、 碘。 0021 本发明中， 优选 Ax、 Ay 各自独立地选自 C1-10烷基、 C1-10烷氧基和 (CH2)xO(CH2)y， 更 优选各自独立地选自 C1-6烷基和 (CH2)2O(CH2)2。 0022 优选 R1、 R2和 R3各自独立地选自 H、 C1-6烷基和 C1-6烷氧基， 更优选各自独立地选 自 H 和甲基。优选 R4选自 C1-6烷基、 OH 和 C1-6烷氧基， 更优选选自 OH 和甲氧基。 0023 此外， 优选 m、 n 为 1-6 的整数。 0024 最优地， 本发明的八元瓜环自组装型分子信标为如下化合物 ： 0025 说 。

26、明 书 CN 103436620 B 9 4/14 页 10 0026 本发明用于制备上述八元瓜环自组装型分子信标的方法包括如下步骤 ： 0027 用于制备八元瓜环自组装型分子信标的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 0028 （1） 合成带有紫晶或其衍生物官能团及 NHS 酯活性基团的淬灭团 0029 0030 （a） 中间体 I 的合成 0031 将化合物 a、 EDC、 NHS 溶解在干燥四氢呋喃、 乙腈、 DMF 或其混合溶剂中搅拌并加热 说 明 书 CN 103436620 B 10 5/14 页 11 至 50-100， 反应 6-12 h 后旋转蒸发除去溶剂， 得到的油状物质。

27、用二氯甲烷溶解后， 硅胶 色谱柱层析分离， 得到中间体 I ； 0032 （b） 中间体 II 的合成 0033 将中间体 I、 三乙胺、 DMAP 在丙酮、 乙腈、 二氯甲烷或其混合溶剂中冰浴搅拌 5-20 min， 将对甲苯磺酰氯溶入二氯甲烷中， 然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中反应过 夜， 旋转蒸发蒸干溶剂， 用二氯甲烷溶解， 再加入冰水洗涤， 分液后干燥， 得到二氯甲烷溶 液， 蒸干溶剂， 残渣用二氯甲烷溶解后， 硅胶色谱柱分离， 得到中间体 II ； 0034 （c） 中间体 III 的合成 0035 将中间体 II、 NaI 加入丙酮、 乙腈、 四氢呋喃或其混合溶剂中， 回流 。

28、6-12 h， 过滤除 去固体， 旋转蒸发除去溶剂， 用二氯甲烷溶解后用硅胶色谱柱分离， 得到中间体 III ； 0036 （d） 淬灭团 IV 的合成 0037 将中间体 III 与带有取代基 R2的单边紫晶衍生物 b 溶入干燥乙腈、 DMF 或其混合 溶剂中， 氮气保护下回流 12-48 h， 反应结束后过滤， 用 CH2Cl2洗涤， 得到固体 IV ； 0038 （2） 合成带有萘或其衍生物官能团及2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺的荧光团 0039 0040 （a） 中间体 V 的合成 0041 将化合物 c 和 d 溶于乙二醇单甲醚、 DMF 或其混合溶剂中， 氮气保护下回流 6-。

29、12h， 停止反应后旋转蒸发除去溶剂， 用 CH2Cl2溶解固体， 硅胶柱层析得到中间体 V ； 0042 （b） 荧光团 VI 的合成 0043 分别将中间体和 2- 氰乙基 N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺 e 溶解在干燥二氯甲 烷、 四氢呋喃、 乙腈或其混合溶剂中， 先向 V 溶液中加入 N,N- 二异丙基乙胺， 再在氮气保护 下缓慢滴加 2- 氰乙基 N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺溶液， 室温反应 10-60min 后， 反应液用 饱和 NaHCO3溶液洗涤， 有机相用无水 Na2SO4干燥， 过滤后旋转蒸发除去溶剂， 硅胶柱层析纯 化得到荧光团 VI ； 0044 （3） 八元瓜环自组。

30、装型分子信标的制备 0045 （a） 核苷酸序列的合成 0046 采用常规的固相亚磷酰胺三酯法在 DNA 自动合成仪上得到需要的核苷酸序列 （例 如采用 Wang(Edge R.). 核酸探针的合成、 标记及应用 . 北京 ： 科学出版社 1998:10 记载的 方法） ； 0047 （b） 在核苷酸序列的 5 端连接荧光团 0048 经过脱 DMT、 偶联、 封闭、 氧化四步反应将荧光团 VI 连接到核苷酸序列上， 然后用 25% 的浓氨水于 55-75下反应 8-15h 进行氨解， 将核苷酸序列从 CPG 上切除下来同时脱掉 说 明 书 CN 103436620 B 11 6/14 页 1。

31、2 荧光团VI上的氰乙基保护基， 将得到的溶液在冰上冷却， 真空除去氨， 离心除去CPG后即可 得到 5 端带有荧光团的核苷酸序列 ； 0049 （c） 在核苷酸序列的 3 端连接淬灭团 0050 在核苷酸序列的 3 -OH 端修饰上一个带 Ax 的氨基末端， 然后与带有 NHS 酯活性 基团的淬灭团 IV 反应， 经 HPLC 分离纯化， 得到在核苷酸序列的 5 端、 3 端分别连接荧光团 和淬灭团的核苷酸序列， 即新型 MB ； 0051 （d） 将该新型 MB 与八元瓜环的水溶液混合， 萘和 / 或其衍生物官能团及紫晶和 / 或其衍生物官能团通过静电吸引共同进入到八元瓜环的空腔内， 得到。

32、八元瓜环自组装型 MB ； 0052 0053 上述各反应式中， Ax、 Ay、 F、 Q、 R1、 R2、 R3、 R4、 m、 n 的含义同上， X 表示卤素， Ax 为 Ax 的反应前体 ；表示 CPG 微珠。 说 明 书 CN 103436620 B 12 7/14 页 13 0054 由本发明的方法合成的分子信标， 可以采用核磁、 质谱和液相色谱来确定其结构。 0055 本发明还提供上述自组装型分子信标在特异性识别核苷酸序列中的应用。即， 通 过将本发明自组装型分子信标环部分的核苷酸序列设计成与所要特异性识别的靶核苷酸 序列成互补的序列， 就可用来特异性识别靶核苷酸序列。 0056 。

33、本发明的有益效果在于 ： 0057 （1） 利用八元瓜环的自组装将分子信标中的荧光团 F 和淬灭团 Q 在底部 “锁住” ， 既拉近了荧光团与淬灭团之间的距离， 又增加了分子信标的荧光淬灭效率， 有助于进一步 提高分子信标的信噪比， 最大限度消除背景荧光， 提高检测灵敏度。 0058 （2） 即使发生核酸酶降解， 本发明分子信标的荧光团F和淬灭团Q仍将被八元瓜环 “锁定” ， 不会产生假阳性信号。 0059 （3） 本发明分子信标的结构简单， 制备原料易得， 通过几步反应即可合成目标分 子， 易产业化。 0060 （4） 本发明为分子信标性能优化提供了一种创新思路， 对分子生物学和生物医学 的。

34、发展具有重要意义。 附图说明 0061 图 1 是分子信标荧光团 -9 的荧光光谱及淬灭团 -5 的紫外吸收光谱。 0062 图 2 是分子信标淬灭团 -5 对荧光团 -9 淬灭效果的紫外吸收光谱。 0063 图 3 是分子信标淬灭团 -5 对荧光团 -9 淬灭效果的荧光光谱。 0064 图 4 是分子信标与八元瓜环自组装前后的相对荧光强度测试结果。 0065 图 5 是分子信标与八元瓜环自组装前与靶序列 cDNA 作用的性能测试结果。 0066 图 6 是分子信标与八元瓜环自组装后与靶序列 cDNA 作用的性能测试结果。 0067 图7是分子信标与八元瓜环自组装前后与靶序列cDNA作用的性能。

35、测试的对比图。 0068 图 8 是分子信标与八元瓜环自组装前的抗酶切能力测试结果。 0069 图 9 是分子信标与八元瓜环自组装后的抗酶切能力测试结果。 0070 图 10 是分子信标与八元瓜环自组装前后抗酶切能力的对比柱状图。 具体实施方式 0071 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明并不限定于此。对于本发 明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简 单推演或替换， 这些都应当落入本发明的保护范围内。 0072 一、 淬灭团的合成 0073 说 明 书 CN 103436620 B 13 8/14 页 14 0074 （1） 中间体 。

36、-1 的合成 0075 将 4- 氨基苯甲酸 （10.0g， 73.0mmol） 溶解在 18% 盐酸 （150mL） 中， 冷却至 0。然 后在 4下半小时内将冰冻的 NaNO2水溶液 （5.2g， 75.4mmol） 逐滴加入， 很快形成淡黄色的 重氮化溶液。将重氮化溶液缓慢加入到 N- 甲基 -N- 羟乙基苯胺 （11.0g， 73.0mmol） 与 37% 盐酸 （50mL） 的溶液中， 形成深红色反应液， 反应在 4以下进行 2h 后， 用饱和醋酸钠溶液中 和至中性， 产生大量红色沉淀， 过滤， 水洗， 烘干得到红色固体 18.5g， 产率 85%。 0076 （2） 中间体 -2 。

37、的合成 0077 称取 3.0g（10.0mmol） 中间体 -1， 4.0g（20.8mmol） EDC， 2.3g（20.0mmol） NHS， 溶解在 35mL 干燥 DMF 中搅拌并加热至 60， 反应 12h 后旋转蒸发除去 DMF， 将剩余油状 物质用二氯甲烷溶解后， 硅胶色谱柱层析分离， 洗脱液为 CH2Cl2/CH3OH（500/1-200/1， v/ v） ， 得红色固体 2.98g， 产率 75%。1H NMR（400MHz,CDCl3） ， =8.23（d,J=8.6Hz,2H） ， 7.92 （d,J=8.8Hz,2H） ， 7.91 （d,J=8.8Hz,2H） ， 。

38、6.83 （d,J=9.2Hz,2H） ， 3.90 （t,J=5.7Hz,2H） ， 3.65 说 明 书 CN 103436620 B 14 9/14 页 15 （t,J=5.6Hz,2H） ， 3.15（s,3H） ， 2.92（s,4H） 。 0078 （3） 中间体 -3 的合成 0079 取 3.45g （8.7mmol） 中间体 -2 溶于 80mL 丙酮中， 再量取 3.6mL （26.1mmol） 三乙 胺加入溶液中， 加入催化量的DMAP （10mg） ， 将此溶液冰浴搅拌10分钟。 将4.96g （26.1mmol） 对甲苯磺酰氯 （TsCl） 溶入 50mL 二氯甲烷中。

39、， 然后将该二氯甲烷溶液滴入上述反应液中， 14 小时后， 发现继续增加反应时间转化率也不再提高。旋转蒸发蒸干溶剂， 用 150mL 二氯甲 烷溶解， 再加入约 200mL 冰水洗涤， 分液后干燥， 得到二氯甲烷溶液， 蒸干溶剂， 残渣用二氯 甲烷溶解后， 硅胶色谱柱分离， 洗脱液为 CH2Cl2/CH3OH（200/1， v/v） ， 得到 2.4g 产物， 产率 51%。1H NMR （400MHz,CDCl3） ， =8.24 （d,J=8.7Hz,2H） ， 7.997.88 （d,J=9.0Hz,2H） ， 7.84 （d,J=9.1Hz,2H） ， 7.69 （d,J=8.3Hz,。

40、2H） ， 7.23 （d,J=8.0Hz,2H） ， 6.62 （d,J=9.2Hz,2H） ， 4.23 （t,J=5.7Hz,2H） ， 3.74（t,J=5.7Hz,2H） ， 3.03（s,3H） ， 2.92（s,4H） ， 2.36（s,3H） 。 0080 （4） 中间体 -4 的合成 0081 将中间体 -3（1.5g， 2.73mmol） ， NaI（0.82g， 5.46mmol）加入 50mL 丙酮中， 回 流 10h， 过滤除去固体， 旋转蒸发除去溶剂， 用二氯甲烷溶解固体后用硅胶色谱柱分离， 洗脱 液为甲醇 / 二氯甲烷 （1/500， v/v） ， 得红色粉末状固。

41、体 V-4（1.3g， 2.57mmol） ， 产率 94%。1H NMR （400MHz,CDCl3） ， =8.24 （d,J=8.7Hz,1H） ， 8.057.85 （m,2H） ， 6.77 （d,J=9.2Hz,1H） ， 4.053.69（m,1H） ， 3.403.22（m,1H） ， 3.15（s,1H） ， 2.92（s,2H） 。 0082 （5） 中间体单边甲基紫晶的合成 0083 向溶解有 10g（0.064mol） 4,4 - 联吡啶的 150mL 干燥二氯甲烷中缓慢滴加 1.6mL （0.022mol） 碘甲烷， 室温氮气保护下搅拌 2 天。将生成的沉淀过滤， 用。

42、二氯甲烷洗涤 （50mL3） ， 干燥得到产品 5.6g（0.0187mol） ， 产率 85%， 直接用于下一步反应。 0084 （6） 淬灭团 -5 的合成 0085 称取 1.424g（2.81mmol）中间体 -4 及 0.422g（1.4mmol）单边甲基紫晶溶入 30mL 除水乙腈中， 氮气保护下回流 48h。反应结束后过滤得黄黑色固体， 用 CH2Cl2洗至无黄 色 （50mL2） ， 得固体 90.0mg， 产率 ： 8.8%。1H NMR （400MHz,D2O） ， =9.34 （d,J=5.1Hz,1H） ， 9.17 （d,J=5.9Hz,1H） ， 8.70 （d,J。

43、=5.2Hz,1H） ， 8.64 （d,J=6.4Hz,1H） ， 8.33 （d,J=8.0Hz,1H） ， 7.98（d,J=7.8Hz,1H） ， 7.85（d,J=8.2Hz,1H） ， 6.94（d,J=9.0Hz,1H） ， 5.21（s,1H） ， 4.55 （s,2H） ， 4.38（s,1H） ， 3.19（s,2H） ， 3.09（s,2H） ； HRMS（TOF MS EI+） calculated for C31H30N6O42+550.2329， Found550.2320，（M-2I-） 2+。 0086 二、 荧光团的合成 0087 说 明 书 CN 10343。

44、6620 B 15 10/14 页 16 0088 （1） 中间体 -6 的合成 0089 分别称取 7.74g（4.5mmol） 6- 羟基 -2- 萘甲醛， 2.4g（60mmol）氢氧化钠溶于 75mL 乙醇中， 加热至缓慢回流， 反应液由开始的绿色荧光、 不太溶解变为荧光消失， 直至完 全溶解。 向反应液中缓慢滴加CH3I （4mL） ， 点板监测至反应物消失， 将乙醇旋转蒸发除去， 用 乙酸乙酯溶解， 氢氧化钠水溶液洗至无荧光， 无水硫酸钠干燥， 旋转蒸发除去溶剂得到 7.2g 白色固体 （产率 86%） 。 0090 （2） 中间体 -7 的合成 0091 将上述 -6 溶于 10。

45、0mL 甲醇中， 溶液呈浑浊状， 加入 5mL 甲胺水溶液后， 反应物开 始溶解直至完全溶解， 常温搅拌过夜。往反应液中分批加入 1.7g（45mmol） 硼氢化钠， 有大 量气泡产生， 加完后再在常温下反应 2 小时。反应完成后往反应液中加入约 10mL 水， 产生 少量白色沉淀， 旋出甲醇， 产物为不溶于水的油状物， 静置冷却过夜， 产物凝固， 滤出， 得白 色固体 7.2g。 0092 （3） 中间体 -8 的合成 0093 将 5.54g（20mmol） 4- 溴萘酐、 2.4mL（24mmol） 2-（2- 胺基乙氧基）乙醇溶于 100mL乙醇中， 回流6h， 放置过夜， 析出晶体，。

46、 过滤， 再用100mL乙醇重结晶， 得灰色晶状固体 N-（2-（2- 羟乙氧基） 乙基） -4- 溴 -1,8- 萘酰亚胺 （即中间体 -8） 5.8g， 收率 80.0%。 说 明 书 CN 103436620 B 16 11/14 页 17 0094 （4） 荧光团 -9 的合成 0095 将 1.2g（3.3mmol） 中间体 -8、 2.1g（10.4mmol） 中间体 -7 溶于 20mL 乙二醇 单甲醚中， 氮气保护下回流 10h， 停止反应后旋转蒸发除去溶剂， 用 CH2Cl2溶解固体并过硅 胶柱， 洗脱液为 CH2Cl2/CH3OH （100/1， v/v） 。柱层析分出黄色。

47、粉末产物 -90.9g （1.9mmol） ， 产率 56.3%。1H NMR （400MHz,CDCl3） ， =8.59 （d,J=6.3Hz,1H） ， 8.56 （d,J=7.8Hz,1H） ， 8.51 （d,J=8.2Hz,1H） ， 7.897.82 （m,1H） ， 7.78 （d,J=16.3Hz,1H） ， 7.75 （d,J=8.4Hz,1H） ， 7.66 7.58（m,1H） ， 7.35（d,J=8.4Hz,1H） ， 7.22（d,J=8.3Hz,1H） ， 7.20（d,J=2.6Hz,1H） ， 7.16 （s,1H） ， 4.69（s,2H） ， 4.45（。

48、m,J=7.0Hz,2H） ， 3.94（t,J=4.6Hz,2H） ， 3.87（t,J=4.6Hz,2H） ， 3.793.57（m,5H） ， 3.03（s,3H） 。 0096 （5） 荧光团 V-10 的合成 0097 将 484mg（1.0mmol）中间体 -9 溶解在 20mL 干燥二氯甲烷中， 再加入 0.5mL N,N- 二异丙基乙胺， 量取 0.34mL（1.5mmol） 2- 氰乙基 N,N- 二异丙基氯代亚磷酰胺溶解在 5mL 干燥二氯甲烷中， 氮气保护下缓慢滴加到反应混合液中。室温反应 30min 后， 用二氯甲 烷稀释至 50mL， 反应液用饱和 NaHCO3溶液洗。

49、涤 2 次， 有机相用无水 Na2SO4干燥， 过滤并旋 转蒸发除去溶剂。硅胶柱层析纯化残留固体 （石油醚 / 二氯甲烷 / 三乙胺 =1:1:0.1， V/V/ V） 得 390mg 黄色油状中间体 -10， 产率 57.0%。1H NMR(400MHz,CDCl3)， =8.55(d,J=7. 3Hz,1H),8.52(d,J=9.4Hz,1H),8.48(d,J=8.2Hz,1H),7.78(s,1H),7.74(d,J=8.4Hz1H),7. 73(m,J=8.8Hz1H),7.60(t,J=8.4Hz1H),7.35(d,J=8.4Hz,1H),7.207.15(m,3H),4.65(s, 2H),4.42(t,J=6.2Hz,2H),3.92(s,3H),3.84-3.69(m,10H),3.633.45(m,2H),3.00(s,3H ),2.60(t,J=6.0Hz,2H),1.13(dd,J=6.7,5.1Hz,12H).HRMS(TOF MS EI+),calculated for C38H45N4O6P+H+： 685.7688,Found ： 685.2895， (M。