白桦脂酸衍生物.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610545783.0	申请日：	20160712
公开号：	CN106117304A	公开日：	20161116
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07J63/00,A61K31/56,A61P35/00,A61P35/02	主分类号：	C07J63/00,A61K31/56,A61P35/00,A61P35/02
申请人：	四川省中医药科学院
发明人：	徐超群,李东晓,阮佳,谭镭,詹雁,胡竟一,雷玲
地址：	610041 四川省成都市武侯区人民南路四段51号
优先权：	CN201610545783A
专利代理机构：	北京市浩天知识产权代理事务所(普通合伙)	代理人：	刘云贵;周华宁
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内容摘要

本申请涉及一种白桦脂酸衍生物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，以及包含上述物质的药物组合物和用于治疗癌症的用途。

权利要求书

1.由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药：其中，R、R分别选自R、R、R分别选自-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基中任意一种；X选自氧、氮、硫或碳原子。 2.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，其特征在于，R为R为 3.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，其特征在于，所述X为氧原子。 4.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，其特征在于，R为羟基、R和R为-H。 5.化合物1及其药学上可接受的盐、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药： 6.一种药物组合物，其包含权利要求1～5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物、前药和药学上可接受的载体。 7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、缓释制剂、溶液剂、悬浮液、注射剂、软膏、乳膏或栓剂。 8.如权利要求1～5任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药在制备具有抗癌作用的药物中的应用。 9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症包括白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃肠道间质瘤、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌或黑色素瘤。

说明书

技术领域

本申请涉及一种白桦脂酸衍生物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，包含上述物质的药物组合物和用于治疗抗肿瘤疾病的用途，属于医药领域。

背景技术

桦木酸(或白桦脂酸，betulinic acid)为羽扇豆烷型五环三萜类化合物，广泛分布于鼠李科、桃金娘科、桦木科等多种植物中，但普遍含量较低。由于桦木酸的母环结构较大，使得其分子极性较小，脂溶性较大。因此，桦木酸在水中的溶解度较小，易溶于乙醚，氯仿、乙醇等有机溶剂。桦木酸对黑素瘤细胞具有极强的选择性细胞毒性(Pisha E,Chai H,Lee I S,et al.Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis[J].Nat Med,1995,1(10):1046-1051)；诱导初级胶质母细胞瘤细胞凋亡率远远高于长春新碱和亚硝基脲(Jeremias I,Steiner H H,Benner A,et al.Cell death induction by betulinic acid,ceramide and TRAIL in primary glioblastoma multiforme cells[J].Acta Neurochir,2006,146(7):721-729)；能与许多细胞毒性化合物如多柔比星、紫杉醇、依托泊昔、放线菌素D联合用药，且具有协同作用，有望作为增效剂，用于肿瘤化学联合疗法，避免多药耐药性的产生，增强抗肿瘤药的治疗效果(Eder-Czembirek C,Czembirek C,Erovic B M,et al.Combination of betulinic acid with cisplatin-different cytotoxic effects in two head and neck cancer cell lines[J].Oncol Rep,2005,14(3):667-671)；能在病毒生命周期的几乎全部环节抑制H9淋巴细胞中HIV的复制(Mayaux J F,Bousseau A,Pauwels R,et al.Triterpene derivatives that block entry of human immunodeficiency virus type 1into cells[J].Pro Nat Acad Sci,1994,91(9):3564-3568)。此外，桦木酸还具有免疫调节、抗炎、抗氧化应激、抗菌、抗寄生虫、抗疟疾及抗溃疡等多种活性(易金娥,邬静,文利新,等.桦木酸的药理作用研究进展.中草药,2014,45(14):2118-2124)。随着对桦木酸药理活性的认识不断加深，不少研究者尝试以桦木酸为母核进行结构修饰，以求提高其溶解度，增加其生物利用度，降低其毒性。对桦木酸的结构修饰主要集中在三个位置：C-3位、C-20位和C-28位。

在文献《桦木酸及其衍生物的研究进展》(李丹,周金培,吴晓明.[J].药学进展,2004，28(3):120-125)中：

(1)对3位羟基的改造一般是以吡啶作溶剂，与各种环状二酸酐反应，合成末端带羧酸基的酯。这一类型的改造还是比较成功的。如表1所示，化合物3、4、5与桦木酸相比，活性大大增强。说明该类型的酰基可能增强抗HIV活性。对桦木酸及其类似物白桦素3位羟基的其它改造，如将β位羟基改为α位、羟基改为羰基、醇改为酰胺等，大都造成活性增强。说明发挥活性时关键的氢键反应可能与3β位的氧相关。其中，化合物3(DSB，又称YK-FH312)，尤其引人注目。Taisei Kanamoto等的研究结果显示，YK-FH312可能是通过作用于病毒粒子装配和(或)病毒粒子出芽步骤实现抗HIV活性。

(2)对桦木酸19位异丙烯基的改造未得到很令人满意的结果。在30位上取代，活性保持，但酸性基团取代对活性明显有害；碳20位改为酮或肟，失活或活性降低；19位改为酰基或酸性基团，会导致失活。说明高电负性的氧原子可能改变桦木酸的静电性，使其细胞毒性降低。改造19位获得的唯一成功是二氢桦木酸(Dihydrobetulinic acid)及其衍生物。二氢桦木酸是HIV与细胞膜的融合抑制剂。它的抗HIV测定以H9细胞为感染模型，IC50为12.6μmol/L，EC50＝0.9μmol/L。以二氢桦木酸为先导物，经修饰后得到的化合物7的治疗指数为14000，抗HIV活性比其先导物高约1000倍。

(3)28位羧基是当前桦木酸的修饰热点，对其修饰得到的衍生物种类繁多。在近年的研究中，对28位羧基的结构改造以生物活性为指导，逐渐集中于将羧酸基转变成各种酰胺，而且在这些酰胺类衍生物中大多数的支链末端都保留了羧酸基。现将比较有代表性的化合物加以介绍。如表2所示，该类衍生物的酰胺链较短时活性不好。酰胺链较长的时候R＝CONH(CH2)m COOH,m＝7-11时活性有意义，m＝10时活性最强；R＝CONH(CH2)7CONH(CH2)nCOOH,n＝1-4时活性比前面m＝7、10都有提高；R＝CONH(CH2)7NHCO(CH2)n COOH，n＝1-3时活性又有提高。另外，可能因为胺部分和相邻质子相互作用对羧酸基起到空间定位的作用，链中第一个CONH,N上有取代，CONH变成NHCO或NHCONH，都失活。第二个CONH:①与小的α-氨基酸(该氨基酸包含1-2个甲基的亲脂性部分)相连，活性增加。②与邻位的苯甲酸相连，失活；与间位、对位的苯甲酸相连，IC50可达100nmol/L左右。③若CONH换成NHCO，活性便增强。该类衍生物中最著名的是RPR103611，它通过抑制病毒和细胞膜融合过程中的后结合，即包膜依赖性阶段来抑制HIV感染(IC50＝10nmol/L)，是目前唯一通过影响gp41来阻止HIV入侵的小分子非肽类物质，有希望开发成为HIV细胞膜融合剂。PRP103611的旋光异构体IC9564.(34.)在病毒感染性降低测定K NL4-3的IC90＝0.22±0.05μmol/L，显示出很强的抗HIV活性。而在IC9564的系列衍生物中，较突出的是化合物35(EC50＝0.33μmol/L)和36(EC50＝0.46μmol/L)，它们的活性与IC9564相当。研究显示，IC9564.能强力阻断HIV-1外壳介导的膜融合，从而在穿入步骤阻断HIV的复制。这个过程中的关键物质HIV-1gp120是IC9564作用的分子靶点。

在文献《23-羟基白桦酸衍生物抗肿瘤作用的三维定量构效关系及分子对接模式》(张婷婷，毕毅，陈蒙蒙等.[J].中国药学杂志,2014,49(14):1200-1203)中：23-羟基白桦酸衍生物(结构如下)也是五环三萜类化合物，是一种从中药白头翁中分离得到的白桦酸类似物，具有与白桦酸相当的抗肿瘤活性，但其作用机制目前正在研究之中。该实验室前期合成了大量的23-羟基白桦酸衍生物并对其进行了抗肿瘤活性研究，研究表明，28-COOH是影响该类化合物抗肿瘤活性的主要部位。

到目前为止，对C-3位羟基和C-28位羧基的改造已取得一定进展，但C-20位的结构修饰和改造尚缺乏令人满意的结果。其它位置取代的桦木酸衍生物则未见报道。

发明内容

本发明提供了一种白桦脂酸衍生物，可用于制备抗肿瘤的药物。

作为本申请的一个方面，本申请提供了由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药：

其中，R1、R2分别选自

R3、R4、R5分别选自-H、卤素、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基中至少一种；

X选自氧、氮、硫或碳原子。

优选的，R1为R2为

进一步优选的，X为氧原子；

进一步优选的，R4为羟基、R3和R5为-H。

更进一步优选的，所述式I化合物结构式为：

作为本申请的另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请上述的式I化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，和药学上可接受的载体。所述药物组合物包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型。在一些实施方式中，所述药物组合物可以是口服的片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、缓释制剂、溶液剂和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软膏或乳膏，或者用于直肠给药的栓剂。在一些实施方式中，所述药物组合物和至少一种治疗剂分别以独立的剂型组合成组合产品，如药剂盒。

作为本申请的另一个方面，本申请提供所述式I化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。

作为本申请的另一个方面，本申请提供一种治疗肿瘤疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的所述式I化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药施用于由此需求的个体。在一些实施方式中，所述肿瘤疾病包括白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃肠道间质瘤、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、黑色素瘤等。

本申请所述“药学上可接受的盐”是指保留了指定化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其他方面没有不良作用的盐。本申请中的盐指用有机酸/无机酸形成的酸式盐，以及用有机碱/无机碱形成的碱式盐。

本申请所述“溶剂化物”是指通过溶剂化作用形成的本申请化合物与溶剂分子的组合。如水合物、乙醇溶剂化物、甲醇溶剂化物等。

本申请所述“多晶形物”或“多晶形”是指以不同的晶格形式存在的本申请化合物。

本申请所述“同位素标记物”是指由同位素标记的本申请化合物。例如本申请的化合物中的同位素包括H、C、O的各种同位素，如2H，3H，13C， 14C，18O，17O。

本申请所述“药学上可接受的前药”是指本申请化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐或其他衍生物，其在向受体施用后能够直接或间接的提供本申请的化合物或其具有药学活性的代谢物或残基。

本申请所述“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。

本申请所述“治疗有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。

本申请所述“药物组合物”是指任选的混合有至少一种药学上可接受的化学成分的生物活性化合物，所述药学上可接受的化学成分包括但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。所述“载体”是指相对无毒的化学试剂，其有助于将化合物引入到细胞或组织中。

本发明体外研究表明，式I化合物对多种肿瘤细胞株，如宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株HepG-2、人肝癌细胞株BEL7404、人胃癌细胞株AGS、人肝癌细胞株SMMC7721、小鼠结肠癌细胞株C26均具有明显的抑制作用。体内研究表明，式I化合物可抑制S180在小鼠体内的生长，抑制率为53.8％，与化疗药环磷酰胺接近，表明其具有较好的抗肿瘤活性。

附图说明

图1化合物1的HMBC相关图

图2化合物1的NOSEY相关图

图3化合物2的HMBC相关图

图4化合物2的NOSEY相关图

具体实施方式

实施例1化合物1的制备

1.乙酸乙酯提取物的制备

取马甲子适量，10倍量95％乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩后得浸膏。浸膏加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物。

2.色谱条件

Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱：BDS-C 18(100*4.6mm，2.4um)，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，检测波长：320nm(DAD)，流动相：乙腈-甲醇(按下表梯度洗脱)。

Time(min) 乙腈(％) 0.1％甲酸液(％) 0 2 98 5 2 98 55 100 0

3.硅胶柱层析

(1)原料溶解：原料200g乙酸乙酯部位加入甲醇中(55℃)溶解，抽滤，取滤液。

(2)硅胶拌样：称取180-200目硅胶约300g，在水浴锅上将滤液缓慢加入硅胶中拌样。

(3)装柱参数：玻璃柱直径10cm，填料180-200目硅胶1.5kg，氯仿装柱；洗脱剂：三氯甲烷→三氯氯甲烷：甲醇＝15:1梯度洗脱；展开剂：三氯甲烷：甲醇＝8:1；TLC：硅胶G板，10％硫酸乙醇加热显色。

(4)洗脱过程及结果：

纯三氯甲烷装柱，纯三氯甲烷洗脱至色带即将被洗脱出来时换成三氯甲烷--甲醇80：1洗脱，TLC监测合并相同部分，依次变换系统液比例→60:1→50:1→40:1→30:1至白桦脂酸洗脱完全后,采用高效液相色谱仪分析监测流份(色谱条件同“2.色谱条件”)，并变换比例30：1→20：1→15：1，合并包含35-40min组峰的洗脱物。

4.MCI纯化

(1)原料溶解：将上述洗脱物用最少乙醇量溶解，湿法上样。

(2)装柱参数：玻璃柱直径3cm，装柱高度45cm。

(3)洗脱过程：50％乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，换75％乙醇洗脱，流份每500ml一份收集，高效液相监测流份(色谱条件同“2.色谱条件”)并换95％乙醇洗脱，高效液相监测(色谱条件同“2.色谱条件”)，合并包含35-40min组峰的流份。

(4)干燥：合并35-40min流份液体旋干到无乙醇味，用乙酸乙酯萃取三次，旋干乙酸乙酯后于真空干燥箱中干燥24h，得目标段混合物。

5.HPLC制备

上述目标段混合物以甲醇溶解，过滤，采用制备高效液相色谱制备，获得化合物1、2粗品。色谱条件：检测设备：waters；柱子型号：XB-C18 250×4.6mm 5um；柱温：35℃；流速：1ml/min；UV320nm；流动相:乙腈-0.2％磷酸水(梯度洗脱)，梯度洗脱程序：时间/min：0→30→35→45→46→58；乙腈/％：53→63→90→90→53→53。

纯化：将制备得到的化合物1、2粗品40℃浓缩至无乙腈，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物40℃浓缩至干，即得化合物1、2纯品。

6.化合物1的鉴别

化合物1为白色粉末，易容于甲醇、乙醇、乙腈等，不溶于水；m.p.：201-203℃；IRνmax(KBr)：3389，2947，1702，1604，1584，1513，1450，1167，832，表明该化合物具有羟基、羰基和苯环结构单元；ESI-MS:m/z 779.48[M-H]-，781.49[M+H]+，803.44[M+Na]+，819.50[M+K]+，显示该化合物的分子量为780；HRESI-MS：781.4532[M+H]+(计算值781.4522)，确定其分子式为C48H60O9。

化合物1的碳氢归属(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)

化合物1的碳氢归属(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)(续)

1H-NMR(600MHz，DMSO)显示该化合物有5个甲基信号δH 0.74， 0.91，0.92,0.93，1.67(each 3H，s)，其中δH1.67为连接在双键上面的甲基氢信号。在低场部分δH 7.72(2H，d，J＝8.4Hz)，7.55(2H，d，J＝8.4Hz)，6.79(2H，d，J＝8.4Hz)，6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，说明分子中有两个苯环结构，且苯环为对位取代，同时在δH 7.53(1H，d，J＝15.6Hz)，6.82(1H，d，J＝12.6Hz)，6.39(1H，d，J＝15.6Hz)，5.74(1H，d，J＝12.6Hz)，为两个顺反结构双键上面的氢信号。δH 12.19，10.02，9.87(1H，s)为分子中的活泼氢信号。

结合13C-NMR(150MHz，DMSO)和DEPT 135°，该化合物共有48个碳原子信号，在低场部分δC 177.7，167.1，166.1为酯羰基碳信号，δC 160.3，159.2，150.5，126.0，125.4，为季碳信号，δC 145.0，143.3，133.2，130.8，116.6，116.2，115.3，114.9，为叔碳信号峰，δC 110.2为仲碳信号。结合氢谱数据，说明该化合物有两个对羟基肉桂酰基，根据它们之间的耦合常数，可以判断其中一个是反式结构，另一个是顺式结构。除此之外，分子中还有一个双键。在DEPT 135°中，δC 78.5，72.5是连氧基团叔碳信号，δC 62.5是连氧基团仲碳信号。除了两个对羟基肉桂酰基，该化合物还剩30个碳信号，再结合1H、13C-NMR和DEPT135°综合特征，推断该化合物为C30型三萜结构。

由HSQC对化合物的碳氢信号进行归属，两个对羟基肉桂酰基通过HMBC相关来确定。δH 4.88(δC 72.5，C-2)与δC 166.1(C-γ)，δH 4.51(δC 62.5，C-27)与δC 167.1(C-γ′)具有相关；同时δH 5.74，6.82与δC 166.1(C-γ)，δH 7.53，6.39与δC 167.1(C-γ′)具有相关，说明顺式对羟基肉桂酰基是与母核2位碳相连，反式对羟基肉桂酰基是与母核27位碳相连。δH 1.67(H-18)，1.82、1.38(H-22)与δC 177.7(C-28)，55.5(C-17)HMBC相关；δH 4.71、4.58(H-29)，1.68(H-30)与δC 150.5(C-20)，46.9(C-19)相关；δH 0.91(H-23)、0.74(H-24)与δC 78.5(C-3)，39.5(C-4)相关。以上进一步说明该化合物为2-O-顺式对羟基肉桂酰基-27-O-反式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。

2，3位取代基的相对构型是由NOESY确定，在NOESY谱图中δH 4.88(H-2)与δH 3.05(H-3)相关，同时δH 4.88(H-2)与δH 0.93(H-25) 相关，δH 3.05(H-3)与δH 0.74(H-24)相关，δH 0.74(H-24)与δH 0.93(H-25)相关。说明2，3位取代基均为α构型，同样从NOESY图谱中可以看出19位取代基为α构型。

HMBC相关图和NOESY相关图分别见图1、2。

综合以上结构分析，该化合物鉴定为2α-O-顺式对羟基肉桂酰基-3α-羟基-27-O-反式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。经scifinder检索，未见有该化合物的相关报道，确定其为新三萜类结构。

7.化合物2的鉴别

化合物2为白色无定性粉末，m.p.202-203℃,(c 0.02，MeOH)，ESI-MS：负离子m/z 779.02[M-H]-，正离子m/z 803.43[M+Na]+，提示该化合物的分子量为780；HRESI-MS给出m/z 781.4530[M+H]-(理论计算值为781.4522)，确定该化合物的分子式为C48H60O9。

化合物2的碳氢归属(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)

化合物2的碳氢归属(DMSO-d6，δppm，J＝Hz)(续)

13C-NMR谱数据显示该化合物有48个碳，由1H-NMR谱数据显示的芳氢和烯氢质子信号δ7.51(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.76(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),7.54(1H,d,J＝15.6Hz,H-α),6.32(1H,d,J＝15.6Hz,H-β),7.65(2H,d,J＝8.4Hz,H-2″,6″),6.80(2H,d,J＝8.4Hz,H-3″,5″),6.87(1H,d,J＝12.6Hz,H-α′),5.78(1H,d,J＝12.6Hz,H-β′)以及13C-NMR谱中的18个sp2杂化碳吸收信号，可推测存在2个苯丙烯酸基，再根据化学位移值δ160.3和159.2，推测苯环的对位可能各有1个OH取代，可知化合物2中含有2个对羟基肉桂酰氧基结构单元；再由H-α和H-β的耦合常数J＝15.6Hz与H-α′和H-β′的耦合常数J＝12.6Hz,说明分子中有1个反式结构和1个顺式结构的双键氢。

13C-NMR谱中余下的30个碳信号包括6×CH3、11×CH2、6×CH、7×C，且出现δ177.8(C)以及δ150.5(C),110.1(CH2)和19.5(CH3)等白桦脂酸型三萜的特征峰，可确定化合物2为白桦脂酸衍生物。通过和白桦脂酸的结构对比可看出，C-2和C-27位的化学位移变为δ72.6(d)和δ62.5(t)，表明C-2位和C-27位有氧取代。在HMBC谱中(图1)，δH 4.90(H-2) 与δC166.8(C-γ)，δH 4.54(H-27)与δC 166.6(C-γ′)相关；同时δH 7.54(H-α)与δC 166.8(C-γ)，δH 6.87(H-α′)与δC 166.6(C-γ′)相关，说明反式的取代基接于C-2位，而顺式的接于C-27位。则推测化合物2为2-O-反式对羟基肉桂酰基-27-O-顺式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。

2，3位取代基的相对构型是由NOESY确定，在NOESY谱图中δH 4.90(H-2)与δH 3.11(H-3)相关，同时δH 4.90(H-2)与δH 0.93(H-25)相关，δH 3.11(H-3)与δH 0.74(H-24)相关，δH 0.74(H-24)与δH 0.93(H-25)相关。说明2，3位取代基均为α构型，同样从NOESY图谱中可以看出19位取代基为α构型。

HMBC相关图和NOESY相关图分别见图3、4。

综合以上分析，化合物2鉴定为2α-O-反式对羟基肉桂酰基-3α-羟基-27-O-顺式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。经scifinder检索，未见有该化合物的相关报道，确定化合物2为新三萜类结构。

实施例2化合物1、2抗肿瘤活性试验

本实施例采用的细胞株、试剂的来源为：宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株HepG-2、人肺癌细胞株A549、人白血病细胞株K562、人胃癌细胞株MGC-803、小鼠结肠癌细胞株C26均由成都宝科生物科技有限公司提供，人胃癌细胞株AGS购自中国科学院上海细胞研究所。胎牛血清及其相应培养基购自美国Hyclone公司；MTT、DMSO、西黄芪胶、戊巴比妥钠、TNBS、植烷(pristane)购自美国sigma公司；环磷酰胺(CTX) 购自江苏恒瑞医药股份有限公司；地塞米松购自海南制药厂有限公司；四氯化碳购自成都试剂厂；丙氨酸转氨酶(ALT)购自南京建成；ELISA、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、透明质酸(HA)购自武汉华美；层黏连蛋白(LH)购自上海西唐；雷公藤多苷，购自黄石飞云制药有限公司；云芝多糖购自上海康舟真菌多糖有限公司；4-二硝氟苯(DNFB)购自美国sigma公司。

1、体外抗肿瘤试验

取处于对数生长期的各种肿瘤细胞(采用的肿瘤细胞株有如下几种：宫颈癌细胞株Hela；人肝癌细胞株HepG-2；人肝癌细胞株BEL7404；人胃癌细胞株AGS；人肝癌细胞株SMMC7721；小鼠结肠癌细胞株C26)，制备细胞悬液，用含有10％胎牛血清的相应培养基将细胞浓度调为1×105个/mL细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200μL，次日分别加入一定浓度无菌的化合物1、2溶液，混匀后置37℃、5％CO2孵箱中培养24h后，析出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/mL的MTT磷酸缓冲液20μL以及150μL培养基，同样条件下继续培养4h后终止培养。2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸光值。选择测定波长为490nm。计算化合物1、2对肿瘤细胞的IC50，结果见表1。

表1化合物1、2对多种肿瘤细胞的抑制作用

上述结果表明，化合物1、2具有体外抑瘤作用，且效果显著优于化疗药5-氟尿嘧啶。

2、对荷S180小鼠的影响

选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生理盐水按1︰4(腹水体积：生理盐水体积)混悬备用。雄性昆明种小鼠60只，18～20g，按体重分层随机均分为5组，分别为模型对照组(0.5％西黄芪胶)、阳性对照组(环磷酰胺，CTX)、化合物1组，均在其右侧腋部皮下接种0.2mL前述混悬液。2h后模型对照组和药物组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，连续14日；阳性对照组腹腔注射给予CTX，隔日一次，共7次。末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤块称重，并计算抑瘤率((1-实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重)*100％)，结果见表2。

表2化合物1对荷S180小鼠的影响()

组别动物数(只) 剂量瘤重(g) 抑瘤率(％) 模型对照 12 —— 1.32±0.47 —— 阳性对照(CTX) 9 40mg/kg 0.41±0.28** 68.9 化合物1 12 40mg/kg 0.47±0.25** 64.4

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实验结果表明，化合物1给予400mg/kg灌胃，可抑制S180在小鼠体内的生长，具有较好的抗肿瘤活性。

3、化合物1对荷人肝癌SMMC-7721裸鼠的影响

BALB/c裸鼠24只，按0.2ml/只于左侧腋下接种人肝癌细胞株SMMC-7721细胞悬液，细胞密度约3.3×106个/ml。每3天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V＝0.5ab2)，同时称量体重，待肿瘤体积大于100mm3开始进行给药。按肿瘤体积分层随机均分为3组，分别为模型对照组、阳性对照组(环磷酰胺，CTX，40mg/kg)、化合物1组(40mg/kg)。分组当日开始给药，化合物1组和模型对照组按10ml/kg灌胃给予相应受试物或混悬剂，每日1次，连续14d；阳性对照组皮下注射给予CTX生理盐水溶液，隔日1次，共7次。第15d脱颈椎处死动物，剥离肿瘤，称重，测量体积，计算抑瘤率((1－给药组平均肿瘤重量/模型对照组平均肿瘤重量)×100％)和肿瘤生长抑制率((1－给药组平均肿瘤体积/模型对照组平均肿瘤体积)×100％)，结果见表3。

表3化合物1对荷SMMC-7721小鼠的影响(N＝8,)

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

实验结果表明，化合物1按40mg/kg灌胃给予，可抑制人源性肿瘤SMMC-7721在裸鼠体内的生长，显示较好的抗肿瘤活性。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610545783.0 (22)申请日 2016.07.12 (71)申请人四川省中医药科学院地址 610041 四川省成都市武侯区人民南路四段51号 (72)发明人徐超群李东晓阮佳谭镭詹雁胡竟一雷玲 (74)专利代理机构北京市浩天知识产权代理事务所(普通合伙) 11276 代理人刘云贵周华宁 (51)Int.Cl. C07J 63/00(2006.01) A61K 31/56(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(。

2、2006.01) (54)发明名称白桦脂酸衍生物 (57)摘要本申请涉及一种白桦脂酸衍生物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，以及包含上述物质的药物组合物和用于治疗癌症的用途。权利要求书2页说明书15页附图2页 CN 106117304 A 2016.11.16 CN 106117304 A 1.由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药：其中， R1、 R2分别选自 R3、 R4、 R5分别选自-H、卤素、羟基、 C1C6烷基、 C1C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基中。

3、任意一种； X选自氧、氮、硫或碳原子。 2.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，其特征在于， R1为R2为 3.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，其特征在于，所述X为氧原子。 4.如权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，其特征在于， R4为羟基、 R3和R5为-H。 5.化合物1及其药学上可接受的盐、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药：权利要求书 1/。

4、2 页 2 CN 106117304 A 2 6.一种药物组合物，其包含权利要求15任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物、前药和药学上可接受的载体。 7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、缓释制剂、溶液剂、悬浮液、注射剂、软膏、乳膏或栓剂。 8.如权利要求15任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药在制备具有抗癌作用的药物中的应用。 9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症包括白血病、。

5、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃肠道间质瘤、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌或黑色素瘤。权利要求书 2/2 页 3 CN 106117304 A 3 白桦脂酸衍生物技术领域 0001 本申请涉及一种白桦脂酸衍生物及其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，包含上述物质的药物组合物和用于治疗抗肿瘤疾病的用途，属于医药领域。背景技术 0002 桦木酸(或白桦脂酸， betulinicacid)为羽扇豆烷型五环三萜类化合物，广泛分布于鼠。

6、李科、桃金娘科、桦木科等多种植物中，但普遍含量较低。由于桦木酸的母环结构较大，使得其分子极性较小，脂溶性较大。因此，桦木酸在水中的溶解度较小，易溶于乙醚，氯仿、乙醇等有机溶剂。桦木酸对黑素瘤细胞具有极强的选择性细胞毒性(PishaE,ChaiH, LeeIS,etal.Discoveryofbetulinicacidasaselectiveinhibitorofhuman melanomathatfunctionsbyinductionofapoptosisJ.NatMed,1995,1(10):1046- 1051)；诱导初级胶质母细胞瘤细胞凋亡率远远高于长春新。

7、碱和亚硝基脲(JeremiasI, SteinerHH,BennerA,etal.Celldeathinductionbybetulinicacid,ceramide andTRAILinprimaryglioblastomamultiformecellsJ.ActaNeurochir,2006,146 (7):721-729)；能与许多细胞毒性化合物如多柔比星、紫杉醇、依托泊昔、放线菌素D联合用药，且具有协同作用，有望作为增效剂，用于肿瘤化学联合疗法，避免多药耐药性的产生，增强抗肿瘤药的治疗效果( Eder-CzembirekC ,CzembirekC ,ErovicB。

8、M ,et al.Combinationofbetulinicacidwithcisplatin-differentcytotoxiceffects intwoheadandneckcancercelllinesJ.OncolRep,2005,14(3):667-671)；能在病毒生命周期的几乎全部环节抑制H9淋巴细胞中HIV的复制(MayauxJF,BousseauA, PauwelsR ,etal .Triterpenederivativesthatblockentryofhuman immunodeficiencyvirustype1intocellsJ.ProNatAcadSci,。

9、1994,91(9):3564- 3568)。此外，桦木酸还具有免疫调节、抗炎、抗氧化应激、抗菌、抗寄生虫、抗疟疾及抗溃疡等多种活性(易金娥,邬静,文利新,等.桦木酸的药理作用研究进展.中草药,2014,45(14): 2118-2124)。随着对桦木酸药理活性的认识不断加深，不少研究者尝试以桦木酸为母核进行结构修饰，以求提高其溶解度，增加其生物利用度，降低其毒性。对桦木酸的结构修饰主要集中在三个位置： C-3位、 C-20位和C-28位。 0003 在文献桦木酸及其衍生物的研究进展 (李丹,周金培,吴晓明.J.药学进展, 2004， 28(3):120-12。

10、5)中： 0004 (1)对3位羟基的改造一般是以吡啶作溶剂，与各种环状二酸酐反应，合成末端带羧酸基的酯。这一类型的改造还是比较成功的。如表1所示，化合物3、 4、 5与桦木酸相比，活性大大增强。说明该类型的酰基可能增强抗HIV活性。对桦木酸及其类似物白桦素3位羟基的其它改造，如将位羟基改为位、羟基改为羰基、醇改为酰胺等，大都造成活性增强。说明发挥活性时关键的氢键反应可能与3 位的氧相关。其中，化合物3(DSB，又称YK-FH312)，尤其引人注目。 TaiseiKanamoto等的研究结果显示， YK-FH312可能是通过作用于病毒粒子装说明。

11、书 1/15 页 4 CN 106117304 A 4 配和(或)病毒粒子出芽步骤实现抗HIV活性。 0005 (2)对桦木酸19位异丙烯基的改造未得到很令人满意的结果。在30位上取代，活性保持，但酸性基团取代对活性明显有害；碳20位改为酮或肟，失活或活性降低； 19位改为酰基或酸性基团，会导致失活。说明高电负性的氧原子可能改变桦木酸的静电性，使其细胞毒性降低。改造19位获得的唯一成功是二氢桦木酸(Dihydrobetulinicacid)及其衍生物。二氢桦木酸是HIV与细胞膜的融合抑制剂。它的抗HIV测定以H9细胞为感染模型， IC50为12.6 mol/L，。

12、EC500.9 mol/L。以二氢桦木酸为先导物，经修饰后得到的化合物7的治疗指数为 14000，抗HIV活性比其先导物高约1000倍。 0006 (3)28位羧基是当前桦木酸的修饰热点，对其修饰得到的衍生物种类繁多。在近年的研究中，对28位羧基的结构改造以生物活性为指导，逐渐集中于将羧酸基转变成各种酰胺，而且在这些酰胺类衍生物中大多数的支链末端都保留了羧酸基。现将比较有代表性的化合物加以介绍。如表2所示，该类衍生物的酰胺链较短时活性不好。酰胺链较长的时候R CONH(CH2)mCOOH,m7-11时活性有意义， m10时活性最强； RCONH(CH2)7CONH。

13、(CH2) nCOOH,n1-4时活性比前面m7、 10都有提高； RCONH(CH2)7NHCO(CH2)nCOOH， n1-3时活性又有提高。另外，可能因为胺部分和相邻质子相互作用对羧酸基起到空间定位的作用，链中第一个CONH,N上有取代， CONH变成NHCO或NHCONH，都失活。第二个CONH:与小的 -氨基酸(该氨基酸包含1-2个甲基的亲脂性部分)相连，活性增加。与邻位的苯甲酸相连，失活；与间位、对位的苯甲酸相连， IC50可达100nmol/L左右。若CONH换成NHCO，活性便增强。该类衍生物中最著名的是RPR103611，它通过抑制病毒和细。

14、胞膜融合过程中的后结合，即包膜依赖性阶段来抑制HIV感染(IC5010nmol/L)，是目前唯一通过影响gp41来阻止HIV入侵的小分子非肽类物质，有希望开发成为HIV细胞膜融合剂。 PRP103611的旋光异构体IC9564. (34.)在病毒感染性降低测定KNL4-3的IC900.220.05 mol/L，显示出很强的抗HIV活性。而在IC9564的系列衍生物中，较突出的是化合物35(EC500.33 mol/L)和36(EC50 0.46 mol/L)，它们的活性与IC9564相当。研究显示， IC9564.能强力阻断HIV-1外壳介导的膜融合，从而在穿入步骤阻。

15、断HIV的复制。这个过程中的关键物质HIV-1gp120是IC9564作用的分子靶点。 0007 在文献 23-羟基白桦酸衍生物抗肿瘤作用的三维定量构效关系及分子对接模式 (张婷婷，毕毅，陈蒙蒙等.J.中国药学杂志,2014,49(14):1200-1203)中： 23-羟基白桦酸衍生物(结构如下)也是五环三萜类化合物，是一种从中药白头翁中分离得到的白桦酸类似物，具有与白桦酸相当的抗肿瘤活性，但其作用机制目前正在研究之中。该实验室前期合成了大量的23-羟基白桦酸衍生物并对其进行了抗肿瘤活性研究，研究表明， 28-COOH是影响该类化合物抗肿瘤活性的主要部位。 0008。

16、到目前为止，对C-3位羟基和C-28位羧基的改造已取得一定进展，但C-20位的结构修饰和改造尚缺乏令人满意的结果。其它位置取代的桦木酸衍生物则未见报道。发明内容 0009 本发明提供了一种白桦脂酸衍生物，可用于制备抗肿瘤的药物。 0010 作为本申请的一个方面，本申请提供了由式I表示的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药：说明书 2/15 页 5 CN 106117304 A 5 0011 0012其中， R1、 R2分别选自 0013 R3、 R4、 R5分别选自-H、卤素、羟基、 C1C6烷基、 C1C6烷氧基、。

17、乙酰氧基或乙酰基中至少一种； 0014 X选自氧、氮、硫或碳原子。 0015优选的， R1为R2为 0016 进一步优选的， X为氧原子； 0017 进一步优选的， R4为羟基、 R3和R5为-H。 0018 更进一步优选的，所述式I化合物结构式为： 0019 0020 作为本申请的另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请上述的式I化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药，和药学上可接受的载体。所述药物组合物包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型。在一些实施方式中，所述药物组合物可以是。

18、口服的片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、缓释制剂、溶液剂和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软膏或乳膏，或者用于直肠给药的栓剂。在一些实施方式中，所述药物组合物和至少一种治说明书 3/15 页 6 CN 106117304 A 6 疗剂分别以独立的剂型组合成组合产品，如药剂盒。 0021 作为本申请的另一个方面，本申请提供所述式I化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。 0022 作为本申请的另一个方面，本申请提供一种治疗肿瘤疾病的方法，该方法包括将治疗有。

19、效量的所述式I化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、同位素标记物、溶剂化物、多晶形物或前药施用于由此需求的个体。在一些实施方式中，所述肿瘤疾病包括白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃肠道间质瘤、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、黑色素瘤等。 0023 本申请所述 “药学上可接受的盐” 是指保留了指定化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其他方面没有不良作用的盐。本申请中的盐指用有机酸/无机酸形成的酸式盐，以及用有机碱/无机碱形成的碱式盐。。

20、 0024 本申请所述 “溶剂化物” 是指通过溶剂化作用形成的本申请化合物与溶剂分子的组合。如水合物、乙醇溶剂化物、甲醇溶剂化物等。 0025 本申请所述 “多晶形物” 或 “多晶形” 是指以不同的晶格形式存在的本申请化合物。 0026 本申请所述 “同位素标记物” 是指由同位素标记的本申请化合物。例如本申请的化合物中的同位素包括H、 C、 O的各种同位素，如2H， 3H，13C， 14C，18O，17O。 0027 本申请所述 “药学上可接受的前药” 是指本申请化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐或其他衍生物，其在向受体施用后能够直接或间接的提供本申请的化合物或其具。

21、有药学活性的代谢物或残基。 0028 本申请所述 “立体异构体” 是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。 0029 本申请所述 “治疗有效量” 是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状的至少一种药剂或化合物的量。 0030 本申请所述 “药物组合物” 是指任选的混合有至少一种药学上可接受的化学成分的生物活性化合物，所述药学上可接受的化学成分包括但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂。所述 “载体” 是指相对无毒的化学试剂，其有助于将化合物引入到细胞或组织中。 0031 本发明体外研究表明，式I化合物对多。

22、种肿瘤细胞株，如宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株HepG-2、人肝癌细胞株BEL7404、人胃癌细胞株AGS、人肝癌细胞株SMMC7721、小鼠结肠癌细胞株C26均具有明显的抑制作用。体内研究表明，式I化合物可抑制S180在小鼠体内的生长，抑制率为53.8，与化疗药环磷酰胺接近，表明其具有较好的抗肿瘤活性。附图说明 0032 图1化合物1的HMBC相关图 0033 图2化合物1的NOSEY相关图 0034 图3化合物2的HMBC相关图 0035 图4化合物2的NOSEY相关图说明书 4/15 页 7 CN 106117304 A 7 具体实施方式 0036 实。

23、施例1化合物1的制备 0037 1.乙酸乙酯提取物的制备 0038 取马甲子适量， 10倍量95乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩后得浸膏。浸膏加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯提取物。 0039 2.色谱条件 0040 Agilent1260高效液相色谱仪，色谱柱： BDS-C18(100*4.6mm， 2.4um)，流速： 1.0ml/min，柱温： 30，检测波长： 320nm(DAD)，流动相：乙腈-甲醇(按下表梯度洗脱)。 0041 Time(min) 乙腈() 0.1甲酸液() 0 2 98 5 2 98 55 100 0 0042 3.硅胶柱层析。

24、0043 (1)原料溶解：原料200g乙酸乙酯部位加入甲醇中(55)溶解，抽滤，取滤液。 0044 (2)硅胶拌样：称取180-200目硅胶约300g，在水浴锅上将滤液缓慢加入硅胶中拌样。 0045 (3)装柱参数：玻璃柱直径10cm，填料180-200目硅胶1.5kg，氯仿装柱；洗脱剂：三氯甲烷三氯氯甲烷：甲醇15:1梯度洗脱；展开剂：三氯甲烷：甲醇8:1； TLC：硅胶G板， 10硫酸乙醇加热显色。 0046 (4)洗脱过程及结果： 0047 纯三氯甲烷装柱，纯三氯甲烷洗脱至色带即将被洗脱出来时换成三氯甲烷-甲醇 80： 1洗脱， TLC监测合并相同部分。

25、，依次变换系统液比例60:150:140:130:1至白桦脂酸洗脱完全后,采用高效液相色谱仪分析监测流份(色谱条件同 “2.色谱条件” )，并变换比例30： 120： 115： 1，合并包含35-40min组峰的洗脱物。 0048 4.MCI纯化 0049 (1)原料溶解：将上述洗脱物用最少乙醇量溶解，湿法上样。 0050 (2)装柱参数：玻璃柱直径3cm，装柱高度45cm。 0051 (3)洗脱过程： 50乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，换75乙醇洗脱，流份每500ml一份收集，高效液相监测流份(色谱条件同 “2.色谱条件” )并换95乙醇洗脱，高效液相监测 (色谱条件。

26、同 “2.色谱条件” )，合并包含35-40min组峰的流份。 0052 (4)干燥：合并35-40min流份液体旋干到无乙醇味，用乙酸乙酯萃取三次，旋干乙酸乙酯后于真空干燥箱中干燥24h，得目标段混合物。 0053 5.HPLC制备 0054 上述目标段混合物以甲醇溶解，过滤，采用制备高效液相色谱制备，获得化合物1、 2粗品。色谱条件：检测设备： waters；柱子型号：XB-C182504.6mm5um；柱温： 35；流速： 1ml/min； UV320nm；流动相:乙腈-0.2磷酸水(梯度洗脱)，梯度洗脱程序：时间/min： 03035454658；。

27、乙腈/： 536390905353。说明书 5/15 页 8 CN 106117304 A 8 0055 纯化：将制备得到的化合物1、 2粗品40浓缩至无乙腈，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物40浓缩至干，即得化合物1、 2纯品。 0056 6.化合物1的鉴别 0057 化合物1为白色粉末，易容于甲醇、乙醇、乙腈等，不溶于水； m.p.： 201-203； IR max(KBr)： 3389， 2947， 1702， 1604， 1584， 1513， 1450， 1167， 832，表明该化合物具有羟基、羰基和苯环结构单元； ESI-MS:m/z779.48M-H-，。

28、781.49M+H+， 803.44M+Na+， 819.50M+K+，显示该化合物的分子量为780； HRESI-MS： 781.4532M+H+(计算值781.4522)，确定其分子式为C48H60O9。 0058 化合物1的碳氢归属(DMSO-d6， ppm， JHz) 说明书 6/15 页 9 CN 106117304 A 9 0059 0060 化合物1的碳氢归属(DMSO-d6， ppm， JHz)(续) 说明书 7/15 页 10 CN 106117304 A 10 0061 0062 1H-NMR(600MHz， DMSO)显示该化合物有5个甲基信号 H0.74， 0.91。

29、， 0.92,0.93， 1.67(each3H， s)，其中 H1.67为连接在双键上面的甲基氢信号。在低场部分 H7.72(2H， d， J8.4Hz)， 7.55(2H， d， J8.4Hz)， 6.79(2H， d， J8.4Hz)， 6.76(2H， d， J8.4Hz)，说明分说明书 8/15 页 11 CN 106117304 A 11 子中有两个苯环结构，且苯环为对位取代，同时在 H7.53(1H， d， J15.6Hz)， 6.82(1H， d， J 12.6Hz)， 6.39(1H， d， J15.6Hz)， 5.74(1H， d， J12.6Hz)，为两个顺。

30、反结构双键上面的氢信号。 H12.19， 10.02， 9.87(1H， s)为分子中的活泼氢信号。 0063 结合13C-NMR(150MHz， DMSO)和DEPT135 ，该化合物共有48个碳原子信号，在低场部分 C177.7， 167.1， 166.1为酯羰基碳信号，C160.3， 159.2， 150.5， 126.0， 125.4，为季碳信号，C145.0， 143.3， 133.2， 130.8， 116.6， 116.2， 115.3， 114.9，为叔碳信号峰，C110.2 为仲碳信号。结合氢谱数据，说明该化合物有两个对羟基肉桂酰基，根据它们之间的耦合常。

31、数，可以判断其中一个是反式结构，另一个是顺式结构。除此之外，分子中还有一个双键。在 DEPT135 中， C78.5， 72.5是连氧基团叔碳信号， C62.5是连氧基团仲碳信号。除了两个对羟基肉桂酰基，该化合物还剩30个碳信号，再结合1H、 13C-NMR和DEPT135 综合特征，推断该化合物为C30型三萜结构。 0064 由HSQC对化合物的碳氢信号进行归属，两个对羟基肉桂酰基通过HMBC相关来确定。 H4.88(C72.5， C-2)与 C166.1(C-)， H4.51(C62.5， C-27)与 C167.1(C- ) 具有相关；同时 H5.74， 6.。

32、82与 C166.1(C-)， H7.53， 6.39与 C167.1(C- )具有相关，说明顺式对羟基肉桂酰基是与母核2位碳相连，反式对羟基肉桂酰基是与母核27位碳相连。 H1.67(H-18)， 1.82、 1.38(H-22)与 C177.7(C-28)， 55.5(C-17)HMBC相关； H4.71、 4.58(H-29)， 1.68(H-30)与 C150.5(C-20)， 46.9(C-19)相关；H0.91(H-23)、 0.74(H-24) 与 C78.5(C-3)， 39.5(C-4)相关。以上进一步说明该化合物为2-O-顺式对羟基肉桂酰基- 27-O-反式对羟基。

33、肉桂酰基白桦脂酸。 0065 2， 3位取代基的相对构型是由NOESY确定，在NOESY谱图中 H4.88(H-2)与 H3.05 (H-3)相关，同时 H4.88(H-2)与 H0.93(H-25)相关， H3.05(H-3)与 H0.74(H-24)相关，H0.74(H-24)与 H0.93(H-25)相关。说明2， 3位取代基均为构型，同样从NOESY图谱中可以看出19位取代基为构型。 0066 HMBC相关图和NOESY相关图分别见图1、 2。 0067 综合以上结构分析，该化合物鉴定为2 -O-顺式对羟基肉桂酰基-3 -羟基-27-O- 反式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。。

34、经scifinder检索，未见有该化合物的相关报道，确定其为新三萜类结构。 0068 0069 7.化合物2的鉴别说明书 9/15 页 12 CN 106117304 A 12 0070化合物2为白色无定性粉末， m.p.202-203,(c0.02， MeOH)， ESI- MS：负离子m/z779.02M-H-，正离子m/z803.43M+Na+，提示该化合物的分子量为780； HRESI-MS给出m/z781.4530M+H-(理论计算值为781.4522)，确定该化合物的分子式为 C48H60O9。 0071 化合物2的碳氢归属(DMSO-d6， ppm， JHz) 。

35、0072 0073 化合物2的碳氢归属(DMSO-d6， ppm， JHz)(续) 说明书 10/15 页 13 CN 106117304 A 13 0074 0075 化合物2的碳氢归属(DMSO-d6， ppm， JHz)(续) 说明书 11/15 页 14 CN 106117304 A 14 0076 0077 13C-NMR谱数据显示该化合物有48个碳，由1H-NMR谱数据显示的芳氢和烯氢质子信号 7.51(2H,d,J8.4Hz,H-2 ,6 ),6.76(2H,d,J8.4Hz,H-3 ,5 ),7.54(1H,d,J 15.6Hz,H- ),6.32(1H,d,J15.6Hz。

36、,H- ),7.65(2H,d,J8.4Hz,H-2 ,6 ),6.80(2H,d,J 8.4Hz,H-3 ,5 ),6.87(1H,d,J12.6Hz,H- ),5.78(1H,d,J12.6Hz,H- )以及13C- NMR谱中的18个sp2杂化碳吸收信号，可推测存在2个苯丙烯酸基，再根据化学位移值 160.3 和159.2，推测苯环的对位可能各有1个OH取代，可知化合物2中含有2个对羟基肉桂酰氧基结构单元；再由H- 和H- 的耦合常数J15.6Hz与H- 和H- 的耦合常数J12.6Hz,说明分子中有1个反式结构和1个顺式结构的双键氢。 0078 13C-NMR谱中余下的3。

37、0个碳信号包括6CH3、 11CH2、 6CH、 7C，且出现 177.8 (C)以及 150.5(C),110.1(CH2)和19.5(CH3)等白桦脂酸型三萜的特征峰，可确定化合物2为白桦脂酸衍生物。通过和白桦脂酸的结构对比可看出， C-2和C-27位的化学位移变为 72.6 (d)和 62.5(t)，表明C-2位和C-27位有氧取代。在HMBC谱中(图1)， H4.90(H-2)与 C 166.8(C-)， H4.54(H-27)与 C166.6(C- )相关；同时 H7.54(H- )与 C166.8(C- )， H6.87(H- )与 C166.6(C- )相关，说明。

38、反式的取代基接于C-2位，而顺式的接于 C-27位。则推测化合物2为2-O-反式对羟基肉桂酰基-27-O-顺式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。 0079 2， 3位取代基的相对构型是由NOESY确定，在NOESY谱图中 H4.90(H-2)与 H3.11 (H-3)相关，同时 H4.90(H-2)与 H0.93(H-25)相关，H3.11(H-3)与 H0.74(H-24)相关， H0.74(H-24)与 H0.93(H-25)相关。说明2， 3位取代基均为构型，同样从NOESY图谱中可以看出19位取代基为构型。 0080 HMBC相关图和NOESY相关图分别见图3、 4。 0081。

39、综合以上分析，化合物2鉴定为2 -O-反式对羟基肉桂酰基-3 -羟基-27-O-顺式对羟基肉桂酰基白桦脂酸。经scifinder检索，未见有该化合物的相关报道，确定化合物2为新说明书 12/15 页 15 CN 106117304 A 15 三萜类结构。 0082 0083 实施例2化合物1、 2抗肿瘤活性试验 0084 本实施例采用的细胞株、试剂的来源为：宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株HepG- 2、人肺癌细胞株A549、人白血病细胞株K562、人胃癌细胞株MGC-803、小鼠结肠癌细胞株C26 均由成都宝科生物科技有限公司提供，人胃癌细胞株AGS购自中国科。

40、学院上海细胞研究所。胎牛血清及其相应培养基购自美国Hyclone公司； MTT、 DMSO、西黄芪胶、戊巴比妥钠、 TNBS、植烷(pristane)购自美国sigma公司；环磷酰胺(CTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；地塞米松购自海南制药厂有限公司；四氯化碳购自成都试剂厂；丙氨酸转氨酶(ALT)购自南京建成； ELISA、型前胶原(PC-)、透明质酸(HA)购自武汉华美；层黏连蛋白(LH)购自上海西唐；雷公藤多苷，购自黄石飞云制药有限公司；云芝多糖购自上海康舟真菌多糖有限公司； 4-二硝氟苯(DNFB)购自美国sigma公司。 0085 1、体外抗肿瘤。

41、试验 0086 取处于对数生长期的各种肿瘤细胞(采用的肿瘤细胞株有如下几种：宫颈癌细胞株Hela；人肝癌细胞株HepG-2；人肝癌细胞株BEL7404；人胃癌细胞株AGS；人肝癌细胞株 SMMC7721；小鼠结肠癌细胞株C26)，制备细胞悬液，用含有10胎牛血清的相应培养基将细胞浓度调为1105个/mL细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200 L，次日分别加入一定浓度无菌的化合物1、 2溶液，混匀后置37、 5CO2孵箱中培养24h后，析出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/mL的MTT磷酸缓冲液20 L以及150 L培养基，同。

42、样条件下继续培养4h后终止培养。 2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的培养液，每孔加入150 LDMSO，震荡10min，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸光值。选择测定波长为490nm。计算化合物1、 2对肿瘤细胞的IC50，结果见表1。 0087 表1化合物1、 2对多种肿瘤细胞的抑制作用说明书 13/15 页 16 CN 106117304 A 16 0088 0089 上述结果表明，化合物1、 2具有体外抑瘤作用，且效果显著优于化疗药5-氟尿嘧啶。 0090 2、对荷S180小鼠的影响 0091 选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小。

43、鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生理盐水按1 4(腹水体积：生理盐水体积)混悬备用。雄性昆明种小鼠60只， 1820g，按体重分层随机均分为5组，分别为模型对照组(0.5西黄芪胶)、阳性对照组(环磷酰胺， CTX)、化合物1组，均在其右侧腋部皮下接种0.2mL前述混悬液。 2h后模型对照组和药物组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，连续14日；阳性对照组腹腔注射给予CTX，隔日一次，共7 次。末次给药后24h颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤块称重，并计算抑瘤率(1-实验组平均瘤重/ 模型对照组平均瘤重)*100)，结果见表2。 0092表2化合物1对荷S。

44、180小鼠的影响() 0093 组别动物数(只) 剂量瘤重(g) 抑瘤率() 模型对照 12 1.320.47 阳性对照(CTX) 9 40mg/kg 0.410.28* 68.9 化合物1 12 40mg/kg 0.470.25* 64.4 0094 与模型对照组比较， *P0.05， *P0.01。 0095 实验结果表明，化合物1给予400mg/kg灌胃，可抑制S180在小鼠体内的生长，具有较好的抗肿瘤活性。 0096 3、化合物1对荷人肝癌SMMC-7721裸鼠的影响 0097 BALB/c裸鼠24只，按0.2ml/只于左侧腋下接种人肝癌细胞株SMMC-7721细胞悬液。

45、，细胞密度约3.3106个/ml。每3天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V0.5ab2)，同时称量体重，待肿瘤体积大于100mm3开始进行给药。按肿瘤体积分层随机均分为3组，分别为模型对照组、阳性对照组(环磷酰胺， CTX， 40mg/kg)、化合物1组(40mg/ kg)。分组当日开始给药，化合物1组和模型对照组按10ml/kg灌胃给予相应受试物或混悬剂，每日1次，连续14d；阳性对照组皮下注射给予CTX生理盐水溶液，隔日1次，共7次。第15d 脱颈椎处死动物，剥离肿瘤，称重，测量体积，计算抑瘤率(1给药组平均肿瘤重量。

46、/模型说明书 14/15 页 17 CN 106117304 A 17 对照组平均肿瘤重量)100)和肿瘤生长抑制率(1给药组平均肿瘤体积/模型对照组平均肿瘤体积)100)，结果见表3。 0098表3化合物1对荷SMMC-7721小鼠的影响(N8,) 0099 0100 与模型对照组比较， *P0.05， *P0.01。 0101 实验结果表明，化合物1按40mg/kg灌胃给予，可抑制人源性肿瘤SMMC-7721在裸鼠体内的生长，显示较好的抗肿瘤活性。说明书 15/15 页 18 CN 106117304 A 18 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 19 CN 106117304 A 19 图4 说明书附图 2/2 页 20 CN 106117304 A 20 。

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