技术领域
本发明属于超氧化物歧化酶制备技术领域，具体涉及一种用于表达人源铜锌超氧化物歧 化酶的重组载体、重组菌株及制备方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金 属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基。SOD在防辐射、 抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、 化妆品等领域得到越来越多的应用。
到目前为止，已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物 等生物体内分离得到SOD。根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类： 铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在 于原核细胞和少数植物细胞中，而Cu/Zn-SOD则主要存在于包括人类在内的真核生物细胞 的细胞质中。因此，最适合人体使用的SOD为Cu/Zn-SOD。
国内Cu/Zn-SOD的研究主要侧重于动植物的提取和纯化。其中动物来源的，由于存在 原材料有限及卫生安全性等问题，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险大；而植 物来源的与人自身的有一定差异，存在免疫原性等问题。因此，利用基因工程生产人源铜 锌超氧化物歧化酶是解决原料来源、获得无免疫原性、高活性Cu/Zn-SOD的有效途径。目 前已有通过基因工程技术生产人源铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)的先例，但仍存在许多 问题，主要包括：(1)目的蛋白表达量不高，由于异源表达系统影响目的蛋白表达量；(2) 纯化过程复杂，不带纯化标签的需要经过离子交换、分子排阻和/或等一系列的层析手段进 行纯化，而带纯化标签的以包涵体形式存在，又需要经过变性、复性等繁琐的工艺获得活 性形式。
发明内容
本发明的目的在于为了解决以上现有技术的不足而提供一种用于表达人源铜锌超氧化物 歧化酶的重组载体、重组菌株及制备方法，将该重组菌株应用与制备人源铜锌超氧化物歧化 酶，可以提高目的蛋白的表达量，提高酶的比活力，简化制备过程。
本发明的技术方案如下：
一种用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，通过将SEQ ID NO.2所示的序列 插入原始载体，构建而成，其中SEQ ID NO.2所示序列为在人源铜锌超氧化物歧化酶N末 端添加了His-TEV标签。
所述的用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，原始载体为真核表达载体或原 核表达载体，优选原始载体为pET28a。
所述的用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体的构建方法，将SEQ ID NO.2的 序列以人工合成的方式插入原始载体中，构建重组载体；具体为将pET28a固定在载体上， 经过脱保护、偶联、加帽、氧化等一系列化学合成过程直接把目的基因按序列顺序一个一 个地连接在原始载体的多克隆位点处，构建重组载体。
一种重组菌株，通过以上所述的重组载体导入表达菌株得到。
所述的重组菌株，表达菌株为大肠杆菌，优选大肠杆菌Codonplus。
所述的重组菌株的制备方法，首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后将重组载体转化大 肠杆菌感受态细胞得到重组菌株。
所述的重组菌株的制备方法，制备大肠杆菌感受态细胞为通过CaCl2化学法制备。
本发明提供了一种用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，将目的基因插入原始 载体构建而成。目的基因根据密码子偏爱性设计目的基因序列，在N末端添加His-TEV标签， 得到目的基因序列SEQ ID NO.2，既避免了表达异源性，又避免了动物或人来源的安全性风险； 所述重组载体构建方法通过人工合成的方式将目的基因合成到质粒载体上，省去酶切、连接、 胶回收等步骤，使得操作更容易且可以选择性的去除载体多克隆位点中各酶切位点基因序列、 操纵子与目的基因之间的可表达的基因序列；以上重组载体用于制备重组菌株，该重组菌株 能够制备人源铜锌超氧化物歧化酶。其中目的蛋白表达的起始点即以上目的基因的起始密码 子，使得目的氨基酸序列不会包含设计外的氨基酸序列，以避免其对蛋白结构的影响；目的 基因序列中设计添加了His纯化标签和标签切除TEV识别位点，既有利于纯化，也便于切除His 标签以达到药用蛋白的要求。所述重组菌株表达出的hSOD1为可溶性表达，并且添加 Cu2+&Zn2+诱导时，表达量明显增加，满足规模化生产的要求。
本发明使用人工合成的方式连接目的基因，合成时优化去除了pET-28a载体多克隆位点 中各酶切位点基因序列、操纵子与目的基因之间的可表达的基因序列等。
本发明使用氯化钙转化法将重组载体pET-28a-N-His-TEV-hSOD1导入表达菌株中。
本发明制备方法中，纯化带标签的N-His-TEV-hSOD1的方法包括亲和层析和脱盐，亲 和层析优选使用Ni Sepharose层析柱，脱盐优选使用Sephadex G25层析柱。纯化的步骤包 括：
(1)粗提目的蛋白，用破碎缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)重 悬菌体，之后用高压均质机破碎菌体，离心收集上清液；
(2)亲和层析，先用缓冲液A(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)平衡的 Ni Sepharose层析柱；之后用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，500mM 咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液；
(3)脱盐，将亲和洗脱液进行脱盐处理，先用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，500mM咪唑，pH 8.0)平衡Desalting层析柱；之后用脱盐缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液，得纯的带标签的蛋白溶液。
本发明纯化不带标签的hSOD1的方法包括酶解、亲和层析去标签纯化和凝胶过滤浓缩， 亲和层析优选使用Ni Sepharose层析柱，浓缩优选使用Superdex 75层析柱。纯化的步骤 包括：
(1)酶解，将纯化的带标签的N-His-TEV-hSOD1的蛋白溶液，添加TEV蛋白酶，2～8℃ 下酶解过夜；
(2)亲和层析去标签纯化，先用Buffer A平衡Ni Sepharose层析柱，然后上样酶解液， 并用Buffer A淋洗，收集流传液，之后用4％～60％Buffer B冲洗亲和在层析柱上的His标签， 恢复层析柱亲和能力；
(3)浓缩，将亲和流穿液进行浓缩处理，先用凝胶过滤缓冲液(50mM Tris,pH8.0,500mM NaCl)平衡Superdex 75层析柱，然后上样亲和流穿液，并用凝胶过滤缓冲液淋洗，收集目的 蛋白峰溶液，得纯的带标签的蛋白溶液。
本发明中经密码子偏爱性优化的目的基因序列，可以在大肠杆菌表达菌株中表达，且表 达菌株表达出的目的蛋白绝大部分存在于菌体破碎后的上清液中。同时，本发明通过在重 组菌培养过程中同时加入铜离子和锌离子诱导，表达量明显提高。再者，目的基因设计时 在N末端添加His-TEV标签，使得纯化和His标签切除简便、高效。此外，本发明方法中 重组载体通过人工合成的方式构建，选择性的去除了对目的蛋白有影响的基因序列，并且 构建方法十分简单，适用于工业化。本发明的方法适用于在工业上大规模地制备具有高比 活力的hSOD1。
附图说明
图1为实施例1中所述重组载体pET-28a-N-His-TEV-hSOD1的物理图谱；
图2为实施例2中重组大肠杆菌生产hSOD1筛选的电泳图。其中，M为蛋白质分子量标准； 泳道1为全细胞；泳道2为破碎的全细胞；泳道3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose 纯化后样品；A、B、C、D为挑选的4个重组单菌落
图3为实施例3中诱导生产hSOD1的电泳图，其中(a)为IPTG诱导生产hSOD1的电泳 图；
(a)中，M为蛋白质分子量标准；泳道1为全细胞；泳道；2为破碎的全细胞；泳道 3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样品；
(b)为IPTG和Cu2+&Zn2+诱导生产hSOD1的电泳图，(b)中，M为蛋白质分子量标 准；泳道1为全细胞；泳道2为破碎上清；泳道3为被Ni Sepharose纯化后样品；
图4为实施例5中诱导和纯化过程中的电泳图，其中，M为蛋白质分子量标准；泳道1为 对比空载体；泳道2为未诱导载体；泳道3为诱导载体沉淀；泳道4为诱导载体上清；泳 道5为富集纯化后pET-28a-N-His-TEV-hSOD1；泳道6为TEV酶切后hSOD1；
图5为实施例5中pET-28a-N-His-TEV-hSOD1和hSOD1的质谱图。
具体实施方式：
实施例1
本发明所述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段可以通过PCR扩增、人工合成 等方法获得。对于人工合成目的基因，本领域技术人员知晓通过Emboss等软件分析密码子 偏爱性，设计目的基因序列等技术。不同生物体对编码同一氨基酸的密码子有一定的偏爱 性，通过密码子使用偏好性的分析，针对这些最优密码子设计可以提高目的基因的表达量。 本发明优选通过密码子偏爱性设计人工合成包含hSOD1基因编码序列的核苷酸片段。
本发明所用的原始载体可为原核表达载体和真核表达载体。原核表达系统具有遗传背 景清楚、表达量高、表达产物分离纯化相对简单以及适于工业化生产的优点。优选地，所 述原始载体为原核表达载体，如pET系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体、pMAL 系列载体等。在原核表达载体中，本发明优选pET系列载体，特别是pET-28a。
本发明采用在培养过程中添加铜、锌离子来提高hSOD1的表达量。因Cu2+&Zn2+是 hSOD1活性中心结构的重要组成部分，并且与hSOD1是否形成正确的折叠结构密切相关， 而不能正确折叠肽链的特异性错误积累是导致包涵体形成的主要原因。因此除了降低诱导 表达时的培养温度，在培养基中添加Cu2+&Zn2+达到使hSOD1可溶性表达的目的，以提高 表达量。
本发明所述实施例中超氧化物歧化酶酶活检测的方法如下：
超氧化物歧化酶酶活定义为，25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50％时所需的酶量为一 个酶活力单位(U)。
配制如下试剂：
A液：pH 8.20 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(内含1mmol/L ED TA·2Na)。称取1.2114g Tris和37.2mg EDTA·2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸 馏水定容至100mL。
B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量10mmol/L 盐酸溶液，并定容至100mL。
邻苯三酚自氧化速率测定在25℃时，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸馏 水2.00mL，B液0.15mL。加入B液立即混合并倾入比色皿中，分别测定在325nm波长条 件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。
SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按上述步骤加入一定量酶液使抑制邻苯三酚自 氧化速率约为1/2ΔA325(min-1)。
按照如下公式计算待测溶液中超氧化物歧化酶的活力(U/mL)：
上述公式中，ΔA325为邻苯三酚自氧化速率；ΔA’325为待测酶液抑制邻苯三酚自氧化速 率；V为待测酶液体积，单位为mL；4.5为反应体系总体积，单位为mL；D为稀释倍数。 实施例1：重组表达载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1的构建
1)目的基因的获得，以hSOD1的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为模板，根据大肠杆菌 密码子偏爱性(如表1所示)，将表达氨基酸序列SEQ ID NO.1对应的密码子转化为大肠杆 菌使用频率高的密码子，并调整基因序列GC的百分比，完成基因序列的设计，并且在N 末端添加His-TEV标签，得到目的基因序列SEQ ID NO.2。
表1密码子偏好性
注：密码子后面括弧中的数字表示每1000个密码子中出现对应密码子的频率
2)重组表达载体的构建，通过人工合成的方式，将步骤1)的DNA片段直接合成在 原始载体pET28a的多克隆位点处，将pET28a固定在载体上，经过脱保护、偶联、加帽、 氧化等一系列化学合成过程直接把目的基因按序列顺序一个一个地连接在pET28a载体的 多克隆位点处，构建重组载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1，其物理图谱如图1所示。经测序 证实，原始载体pET28a多克隆位点处连入SEQ ID NO.2所示的序列。
实施例2：重组大肠杆菌的构建
1)大肠杆菌感受态细胞的制备
用CaCl2化学法制备大肠杆菌感受态细胞，步骤包括：取1ml已活化的大肠杆菌菌液接 种至100ml LB培养基中；37℃振荡培养至OD600＝0.35-0.5时；在4℃下以4000g离心收集 菌体；加入40ml预冷的0.1MCaCl2重悬细胞，冰浴10分钟；在4℃下以4000g离心收集菌 体；加入2ml预冷的0.1M CaCl2重悬细胞；加入终浓度15％～20％的甘油；分装成每管50μL； 且4℃保存24小时后转到-80℃冰箱中冻存。
2)重组载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1转化大肠杆菌感受态细胞
将重组载体pET28a-N-His-TEV-hSOD1 2μL(含量不超过50ng)与大肠杆菌感受态细胞 200μL混合；冰浴30分钟，42℃热激90秒，随后冰浴3～5分钟；每管加入1mL LB培养基， 37℃培养45-60分钟(≤220rpm)，使细菌恢复正常生长状态；然后将上述菌液摇匀涂布于 含抗生素(卡那霉素和氯霉素)的LB平板，37℃倒置培养过夜。
3)重组hSOD1的表达筛选
从平板上挑取单菌落接种到5mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃培养4.5h作为种 子液。取0.9ml种子转接到2ml含抗生素的LB液体培养基中，并添加0.3mM IPTG，37℃ 诱导2小时。离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，分析hSOD1的表达情况。将剩余种子液 加入终浓度15％～20％的甘油分装，4℃保存24小时后转到-80℃冰箱中冻存。
图2为重组大肠杆菌生产hSOD1的筛选。如图所示，M为蛋白质分子量标准；泳道1 为全细胞；泳道2为破碎的全细胞；泳道3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样 品；A、B、C、D为挑选的4个重组单菌落。可见hSOD1在重组菌株均有表达，且为可溶 性表达。
实施例3：重组菌株生产hSOD1
1)重组菌株经IPTG诱导生产hSOD1
取实施例2中甘油保存管中菌液20μL接种到200ml含抗生素的LB液体培养基中， 37℃，140rpm培养至OD600达0.4～0.6。按2.5％接种量转接到1000ml含抗生素的LB液 体培养基中。当37℃振荡培养至OD600达0.4～1.0时，添加IPTG至终浓度为0.3mM，30℃ 诱导4小时。离心收集菌体。进行SDS-PAGE检测，分析hSOD1的表达情况及酶活性情况。
图3中(a)为IPTG诱导生产hSOD1。如图所示，M为蛋白质分子量标准；泳道1为 全细胞；泳道；2为破碎的全细胞；泳道3为破碎上清；泳道4为被Ni Sepharose纯化后样 品。
2)重组菌株经IPTG和Cu2+&Zn2+诱导生产hSOD1
取实施例2中甘油保存管中菌液20μL接种到200ml含抗生素的LB液体培养基中， 37℃，140rpm培养至OD600达0.4～0.6。按2.5％接种量转接到1000ml含抗生素的LB液 体培养基中。当37℃振荡培养至OD600达0.4～1.0时，添加IPTG至终浓度为0.3mM，同 时添加0～500μM Cu2+&Zn2+，30℃诱导4小时。离心收集菌体。进行SDS-PAGE检测，分 析hSOD1的表达情况及酶活性情况。
图3中(b)为IPTG和Cu2+&Zn2+诱导生产hSOD1。如图所示，M为蛋白质分子量标 准；泳道1为全细胞；泳道2为破碎上清；泳道3为被Ni Sepharose纯化后样品。
如图3所示，同时添加Cu2+&Zn2+诱导hSOD1的表达量明显优于比单独用IPTG诱导 的。
实施例3方法的酶活性对比情况，结果如表2所示。
表2
实施例4：带标签N-His-TEV-hSOD1的纯化
(1)粗提目的蛋白，用破碎缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)重 悬菌体，之后用高压均质机破碎菌体，离心收集上清液；
(2)亲和层析，先用缓冲液A(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)平衡的 Ni Sepharose层析柱；之后用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，500mM 咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液；
(3)脱盐，将亲和洗脱液进行脱盐处理，先用4％～60％缓冲液B(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，500mM咪唑，pH 8.0)平衡Desalting层析柱；之后用脱盐缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液，得纯的带标签的蛋白溶液。 实施例5：不带标签hSOD1的纯化
(1)酶解，将纯化的带标签的N-His-TEV-hSOD1的蛋白溶液，添加TEV蛋白酶，4℃ 下酶解过夜；
(2)亲和层析去标签纯化，先用Buffer A平衡Ni Sepharose层析柱，然后上样酶解液， 并用Buffer A淋洗，收集流传液，之后用4％～60％Buffer B冲洗亲和在层析柱上的His标签， 恢复层析柱亲和能力；
(3)浓缩，将亲和流穿液进行浓缩处理，先用凝胶过滤缓冲液(50mM Tris,pH8.0,500mM NaCl)平衡Superdex 75层析柱，然后上样亲和流穿液，并用凝胶过滤缓冲液淋洗，收集 目的蛋白峰溶液，得纯的带标签的蛋白溶液。
如图4所示，根据SDS-PAGE电泳显示pET28a-N-His-TEV-SOD1在大肠杆菌表达株中有明 显可溶性表达，能被Ni亲和柱很好富集。TEV酶切实验显示pET28a-N-His-TEV-SOD1可被切 除标签形成hSOD1。如图5所示，根据LC-MS数据显示大肠杆菌表达的人源重组SOD1蛋白分 子量与理论分子量相符合，是目的蛋白。
序列表
<110> 朱艳娟
<120> 一种用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体、重组菌株及制备方法
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 154
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(hSOD1)
<400> 1
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
35 40 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
85 90 95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln
145 150
<210> 2
<211> 515
<212> DNA
<213> 人工序列(N-His-TEV-hSOD1)
<400> 2
ccatgcatca tcatcatcat cacgaaaact tgtatttcca gggcatggca accaaagcag 60
tttgtgttct gaaaggtgat ggtccggttc agggtattat taattttgaa cagaaggaaa 120
gcaacggtcc tggggtagca ggttaaagtt ttaaaggtct gaccgaaggt ctgcatggtt 180
ttcatgttca tgaatttggt cagcgcaggt gataataccg caggttgtac ccgcatttta 240
atccgctgag ccgtaaacat ggtggtccga aagatgaaga acgtcatgtt ggtgatctgg 300
gtaatgttac cgcagataaa gatggtgttg cagatgttag cattgaagat agcgttatta 360
gcctgagcgg tgatcattgt attattggtc gtaccctggt ccaaaaccgg aaagcagatg 420
atctgggtaa aggtggtaat gaagaaagca tgttcatgaa taatgcaggt agccgtctgg 480
catgtggtgt tattggtatt gcacagtaac tcgag 515