技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种用于筛选重组G-CSF(15-75)多肽表达的巴斯德毕赤酵母培养基。
背景技术
粒细胞刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的主要作用是刺激中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化，增加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能。重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)于1991年首先在美国上市，迄今广泛应用于临床预防和治疗多因素引起的中性粒细胞减少症及其并发症(如发热、感染等)。G-CSF主要作用于中性粒细胞系造血细胞的分化、增殖和活化。化疗后肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。在体外，G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞功能，如促进ADCC、超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。
蛋白多肽分子量相对较小，稳定性好，穿透力强，避免宿主免疫应答，易于吸收等特点受到广泛关注。Facchiano研究发现bFGF的48-58个氨基酸的肽段(PHIKLQLQAE)对于bFGF本身的二聚化具有重要作用，可以抑制bFGF介导的血管新生。成熟的人G-CSF有174个氨基酸，分子量为19.6KD，PI为6.1，对酸碱(pH2-10)、热及变性剂稳定，有5个半胱氨酸残基，Cys36与Cys42，Cys74与Cys64间形成二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于蛋白活性有重要作用。John F.Reidhaar-Olson研究认为G-CSF的Leu15、Glu19、Lys34、lys40、Val48、Leu49对于G-CSFR的二聚化，维持细胞活性具有重要作用。本发明人选取人G-CSF多肽(15-75)进行研究，发现其具有G-CSF同样的生物学活性，促进NFS-60细胞增殖。
巴斯德毕赤酵母是一种单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作，应用也最为广泛。Invitrogen公司开发了成熟的载体系统和培养基体系用于基因工程重组蛋白的酵母表达。采用BMGY/BMMY培养基系统，可高效的表达大多数的重组蛋白，BMGY和BMMY培养基主要成分有酵母提取物，蛋白胨，无氨基酵母氮源等，富含氨基酸、核苷酸、糖类、 维生素和多肽，为酵母的生长提供碳源和氮源，但其中含有多种蛋白成分，特别是在电泳时在6.5KD左右电泳条带明显，重组表达蛋白和培养基蛋白无法区分。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种改良型BMG/BMM培养基，所述培养基有效的解决了传统的BMGY和BMMY培养基中的酵母粉和蛋白胨对于蛋白表达鉴定的影响。
本发明所述的培养基含有以下组份：
改良BMG培养基：1.34％～1.5％YNB，4×10-5％～5×10-5％生物素，0.5％～5％甘油，0.05～0.2M钾盐，0.5％～1％PTM1微量元素溶液；
改良BMM培养基：1.34％～1.5％YNB，4×10-5％～5×10-5％生物素，0.5％～1％甲醇，0.05～0.2M钾盐，0.5％～1％PTM1微量元素溶液；
PTM1微量元素溶液：五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，硫酸锌20.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸0.09M/L。
优选地，所述培养基含有以下组份：
改良BMG培养基：1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液；
改良BMM培养基：1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液；
PTM1微量元素溶液：五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，硫酸锌20.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸0.09M/L。
所述的巴斯德毕赤酵母可以是野生型菌株或者是经过改造的含有外源基因的重组工程菌株。
所述的巴斯德毕赤酵母是保藏号为CGMCC NO：10713的菌株，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年4月13日，分类命名：Pichia pastoris。
本发明提供的巴斯德毕赤酵母培养基，不含酵母粉和蛋白胨，但是含有微量元素和钾盐，消除了酵母粉和蛋白胨在6.5KD的重组G-CSF(15-75)多肽的tricine-SDS-PAGE电泳时的影响；避免了BMGY培养基和BMMY培养基中的胰蛋白胨和酵母粉对分子量为6.5KD 的G-CSF(15-75)多肽表达鉴定的影响；易于G-CSF(15-75)多肽的鉴定和纯化。所属培养基不仅仅用于表达分子量为6.5KD的G-CSF(15-75)多肽，对于大分子量的重组蛋白，该培养基也能较好的表达，能消除培养基中酵母粉和蛋白胨对重组蛋白表达和纯化的影响。
附图说明
图1、G-CSF(15-75)多肽在1～5号培养基中的表达
pPIC9K-GS115和pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在不同培养基中的表达情况，第1泳道表示pPIC9K-GS115在1号培养基中的表达情况，没有条带。第2泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在1号培养基中的表达情况，无条带。第3泳道表示pPIC9K-GS115在2号培养基中的表达情况，有浅条带。第4泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在2号培养基中的表达情况，有浅条带。第5泳道表示pPIC9K-GS115在3号培养基中的表达情况，有深条带。第6泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在3号培养基中的表达情况，有深条带。第7泳道表示pPIC9K-GS115在4号培养基中的表达情况，有深条带。第8泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在4号培养基中的表达情况，有深条带。第9泳道表示pPIC9K-GS115在5号培养基中的表达情况，有深条带。第10泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在5号培养基中的表达情况，有深条带。
图2、G-CSF多肽在6～9号培养基中的表达
第1泳道表示pPIC9K-GS115在6号培养基中的表达情况，有浅条带。第2泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在6号培养基中的表达情况，有深条带。第3泳道表示pPIC9K-GS115在7号培养基中的表达情况，有深条带。第4泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在7号培养基中的表达情况，有深条带。第5泳道是Sigma低分子量蛋白Marker。第6泳道未加样。第7泳道表示pPIC9K-GS115在8号培养基中的表达情况，无条带。第8泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在8号培养基中的表达情况，有深条带。第9泳道表示pPIC9K-GS115在9号培养基中的表达情况，无条带。第10泳道表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在9号培养基中的表达情况，无条带。
图3、Western Blot鉴定pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在1～9号培养基中的表达
1～9泳道分别表示pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在1～9号培养基中的表达情况，pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在4、5、6、7、8号培养基中有清晰的条带，蛋白有表达。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明做进一步的详述，但具体实施例并不对本发明做任何限制。
本发明所涉及的酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115为本公司自行构建，已经保藏，其保藏号为CGMCC NO:10713的菌株。可表达分子量为6.5KD的G-CSF(15-75)多肽片段。人G-CSF多肽(15-75)的基因序列如下：
5′-CTGAAGTGTTTGGAACAAGTTCGTAAGATTCAAGGTGATGGAGCTGCTCTGCAAGAAAAACTTTGTGCTACTTACAAGTTGTGTCACCCAGAAGAATTGGTTCTGCTTGGTCACAGTCTGGGTATCCCTTGGGCTCCACTGAGTAGTTGTCCAAGTCAAGCTCTGCAATTGGCAGGTTGTTTG-3′(183bp)
氨基酸序列如下：
LeμLeμLysCysLeμGlμGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeμGlnGlμLysLeμCysAlaThrTyrLysLeμCysHisProGlμGlμLeμValLeμLeμGlyHisSerLeμGlyIleProTrpAlaProLeμSerSerCysProSerGlnAlaLeμGlnLeμAlaGly Cys
本发明涉及的PTM1微量元素溶液含有五水合硫酸铜6.0g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰3.0g/L，钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，氯化钴0.5g/L，硫酸锌20.0g/L，七水硫酸亚铁65.0g/L，生物素0.2g/L，硫酸0.09M/L，过滤除菌，室温保存。钾盐溶液含有0.132M/L的磷酸氢二钾，0.868M/L的磷酸二氢钾，用磷酸或氢氧化钾调pH至6.0，121℃灭菌30分钟。
实施例1、重组G-CSF(15-75)多肽毕赤酵母菌株种子培养与重组蛋白诱导表达
从YPD平板上的挑取pPIC9K-GS115、pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115单克隆接种至含有0.5mg/ml G418的5ml YPD培养基中，30℃，220rpm培养7小时，按照10％的接菌量接种至1～9号培养基中的种子培养基，30℃，220rpm过夜培养，6000rpm，离心5min收集菌体，接种至1～9号培养基中的诱导培养基，28℃，220rpm诱导表达，间隔24小时补加1％的甲醇，诱导72小时，停止培养，取菌液离心，收取上清，TCA沉淀，tricine-SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达。蛋白表达情况见表1和图1、图2。pPIC9K-GS115作为空白对照，在目的蛋白处本应该没有条带，但在1～9号培养基中的2～7号培养基中都有条带，位置在6.5KD左右，和我们目的蛋白条带位置相近。pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115在1～9号培养基中的2～8号培养基处都有目的带，很难区分示重组蛋白表达还是酵母粉和胰蛋白胨的干扰，只有8号培养基既有蛋白的表达，同时培养基中又不含有酵母粉和胰蛋白胨。
9种不同培养基的配方：
1号培养基：
种子培养基1(1.34％YNB，0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基1(1.34％YNB，0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
2号培养基：
种子培养基2(1％酵母提取物，1.34％YNB,0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基2(1％酵母提取物，1.34％YNB,0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
3号培养基：
种子培养基3(2％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基3(2％胰蛋白胨，1.34％YNB,0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
4号培养基：
BMGY(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甘油)；
BMMY(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
5号培养基：
种子培养基4(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基4(1％酵母提取物，％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
6号培养基：
种子培养基5(1％酵母提取物，1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基5(1％酵母提取物，1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
7号培养基：
种子培养基6(2％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基6(2％胰蛋白胨，1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
8号培养基：
种子培养基7(1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素， 1％甘油)；
诱导培养基7(1.34％YNB，0.1M钾盐，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
9号培养基：
种子培养基8(1.34％YNB，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甘油)；
诱导培养基8(1.34％YNB，0.5％PTM1微量元素溶液，4×10-5％生物素，1％甲醇)。
实施例2Western Blot鉴定重组蛋白表达
将诱导表达重组G-CSF(15-75)多肽的毕赤酵母离心，收集上清，TCA沉淀，0.2M NaOH重新溶解，加还原型缓冲液，Tricine-SDS-PAGE电泳。将电泳胶转膜醋酸纤维素膜，TTBS洗涤3次，每次10分钟，10％胎牛血清封闭，37℃，2小时，加兔抗人G-CSF多抗(1:2000)，37℃，2小时，TTBS洗涤3次，每次10分钟。加HRP标记的羊抗兔多抗(1:20000)，37℃，2小时，DAB显色。显色结果见图3，在4～8号培养基中都有目的蛋白表达。
表1、G-CSF多肽在9种不同培养基中的表达情况
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。