用作造影剂的双环多氮杂大环膦酸、它的配合物和共轭物及其它们的制备方法.pdf

本发明涉及在磁共振成像中（MRI）用作造影剂的双环多氮杂大环膦酸类（bicyclopolyazamacrocyclophosphonic  acids）及其配合物和共轭物。一些配合体和配合物可用来作为口服剂（Oral  Care  agents）和水处理系统中的水垢抑制剂。
    为更好地了解本发明，下面提供了MRI的简要背景。

    MRI是非介入诊断技术，它可产生清晰的动物体内，特别是人体内软组织的断面图像。

    该技术根据某种原子核（如水质子）的性质，它具有在作用的磁场内成一直线的磁矩[由数学方程定义，见G.M.Barrow物理化学（Physical  Chemistry），第3版，McGraw-Hill，NY（1973）]，一旦成一直线，该平衡态可由作用的一外无线电濒率（RF）脉冲波引起质子倾斜，与磁场不成一直线而被搅乱。当RF脉冲波终止时，核转向它的平衡态。用于该发生过程所要求的时间称为松驰时间。松驰时间由称为自旋晶格（T1）松驰和自旋-自旋（T2）松弛的两个参数组成。它是松弛的度量，可给出分子组织以及质子与周围介质相互作用的数据。

    由于活组织中水的含量是大量的并且在各种组织中的含量和周围介质也是变化的，生物体诊断图象反映出质子密度和松弛时间。出现在被监测组织中的松弛时间（T1和T2）差异越大，获得图象上的对比度也越大。[磁共振杂志（J.Magnetic  Resonance）33，83-106（1979）]。

    众所周知，具有对称电子基态的顺磁螯合物可显著地影响并置水质子的T1和T2松弛率以及同许多产生磁矩的未配对的电子部分有关的在这方面的螯合物的有效性[磁共振年报（Magnetic  Resonance  Annual），231-266，Reven  Press，NY（1985）]。它也表明，将该类型顺磁螯合物配到活动物上，它对各种组织的T1和T2的作用可直接在磁共振图像中观察到，在螯合定位区域内观察的对比度提高。因此，已提出将稳定的、无毒顺磁螯合物配到动物体中以便用MRI增加获得诊断的信息[生物工程前沿（Frontiers  of  Biol  Energetics）I，752-759（1978）;核医学杂志（J.Nucl，Med）.25，506-513（1984）;核磁共振对称成象进展（Proc.of  NMR  Imaging  Symp）（十月，26-27，1980）;F.A.Cotton等人著“高等无机化学”（Adu.Inorg  Chem），634-639（1966）]。在该方法中使用的顺磁金属螯合物被称为造影增强剂或造影剂。

    在进行MRI造影剂设计时，有许多可供考虑的顺磁金属离子。然而，在实际中，最有用的顺磁金属离子是钆（Gd³），铁（Fe⁺³），锰（Mn⁺²）和（Mn⁺³）和铬（Cr³），因为可依靠它们的大磁矩在水质子中产生最大的作用。在非配合型（如GdCl₃）这些顺磁离子对动物是有毒的，所以排除它们用于纯态盐中。因此有机螯合剂（也称为配合物）的重要作用是提供对动物无毒的顺磁金属而保存它的所希望的环绕水质子的T1和T2松弛率的作用。

    MRI领域中的技术是非常广泛的，这里不打算详尽描述，下面只是摘要，仅提供该领域中和其它类似结构化合物的研究。美国专利4，899，755公开了在动物肝或动物胆汁管中使用Fe⁺³-乙烯-双（2-羟苯基甘氨酸）配合物和它的衍生物的交变质子NMR松弛时间的方法并建议使用吡啶大环亚甲基羧酸的各种其它化合物。美国专利4，880，008（美国专利4，899，755的CIP）公开了更多的老鼠肺组织的图像资料，但没有公开任何另外的配合物。美国专利4，980，148公开了用于MRI的非环化合物的钆配合物。C.J.Broan等人在J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1739-1741（1990）上描述了双官能大环膦酸化合物。C.J.Broan等人在J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1738-1739（1990）上描述了三氮杂双环化合物。I.K.Adzamli等人在J.Med.Chem，32，139-144（1989）上描述了用于NMR成像的钆配合物的无环膦酸衍生物。

    目前在美国市场上能得到的造影剂仅仅是钆和二乙烯三胺五乙酸的配合物（DTPA-Gd⁺³-MAGNEVIST^TMby Schering AG）。MAGNEVIST^TM被看作非特效/灌注剂，因为它游离地分布在细胞外的流体中，接着由肾脏系统有效地排出。MAGNEVIST^TM已被证明对于诊断脑损伤特别有价值，因为伴随着破坏血液/大脑栓塞物的同时，使灌注的造影剂进入作用区。除MAGNEVIST^TM外，目前在欧洲市场上应用仅为Guerbet大环灌注剂（DOTAREM^TM），许多其它有潜在性的造影剂在不同程度的发展。

    令人惊奇的是，现已发现各种双环多氮杂大环膦酸配合体可用作造影剂。进一步来说，这些配合体可带有它的变型电荷，即通过配合基和被选择金属的结构可作用它的较多位置特异性的能力，特别是，本发明直接给出新配合基，其结构式如下的双环多氮杂大环膦酸化合物：

    

    其中：

    

    其中，X和Y是独立在H、OH、C₁-C₃的烷基或COOH;n是1、2或3的整数;

    但须，当n是2时，X和Y地总数必须是2或更多的H;当n是3时，X和Y的总数必须是3或更多的H;

    T是H、C₁-C₁₈的烷基、COOH、OH、SO₃H、

    

    其中：R¹是OH、C₁-C₅的烷基或-O-（C₁-C₅烷基）;R⁴是H、NO₂，NH₂异硫氰酸根，脲氨基，氨基硫脲（thiosemicarbazido），马来酰亚胺基（maleimido），溴乙酰氨基（bromoacetamido）或羧基;

    R²是H或OH，但须，当R²是OH，则含R²的R项中必须所有X和Y是H;

    但须，至少一个T必须是P（O）R¹OH，并且也必须当T是

    时，则R项中的一个X或Y可以是COOH;其它所有R项中X和Y必须是H;

    A是CH、N、C-Br、C-Cl、C-OR³、C-OR⁸、N⁺-R⁵X^-、;R³是H、C₁-C₅烷基，苄基或至少被一个R⁴取代的苄基;

    R⁴如上定义;

    R⁵是C₁-C₁₆烷基、苄基或至少被一个R⁴取代的苄基;

    R⁸是C₁-C₁₆的烷氨基;

    X^-是Cl^-、Br^-、I^-或H₃CCO-₂;

    Q和Z是独立的CH、N、N⁺-R⁵X^-、C-CH₂-OR³或C-C（O）-R⁶;

    R⁵如上所定义;

    R⁶是-O-（C₁-C₃烷基）、OH或NHR⁷;

    R⁷是C₁-C₅烷基或生物活性物质;

    X如上定义，或其成药允许的盐类;

    但须：a）当Q、A或Z有一个是N或N⁺-R⁵X^-，则其它两个的基团必须是CH;

    b）当A是C-Br、C-Cl、C-OR³或C-OR⁸时，则Q和Z都必须是CH;

    c）R⁴、R⁷和R⁸项出现时，其总数不能超过1;并且

    d）只有一个Q或Z可以是C-（CO）-R⁶，并当Q或Z中一个是C-C（O）-R⁶则A必须是CH。

    当如上结构式（Ⅰ）的配合基中至少二个R项的T为PO₃H₂[P（O）R¹OH其中R¹是OH]并且第三个T为H、COOH或C₁-C₁₈烷基;A、Q和Z是CH;n是1;并且X和Y是独立的H或C₁-C₃烷基;则该配合基适于口服（Orol Cerre）。特别优选是这些配合体，三个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH;n是1;并且X和Y是H。这些配合基的使用在其它共同未决申请中已讨论并提出了权利要求。

    如上结构式（Ⅰ）代表的配合基含：

    R项中至少2个T为P（O）R¹OH，其中R¹是OH，并在其它的R项中T是COOH或P（O）R¹OH，并且n、R¹、X、Y、A、Q和Z如上定义;

    至少一个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，而其它的二个R项中T是COOH或P（O）R¹OH，并且n、R¹、X、Y、A、Q和Z如上定义;或

    R项中三个T是P（O）R¹OH，其中R¹是C₁-C₅的烷基或-O-（C₁-C₅烷基），并且n、R¹、X、Y、A、Q和Z如上定义;

    这些配合基可用作造影剂。

    特别优选结构式（Ⅰ）的配合基中：

    X和Y是H;

    n是1;或

    A、Q和Z是CH。

    为制备本发明的共轭物，结构式（Ⅰ）配合基应为双官能配合基。

    这样的配合基必须含：

    一个R项中的T部分是

    

    其中R²和R⁴如上定义，尤其是二个R项中不含R⁴项，二个T项是P（O）R¹OH，其中R¹如上定义或二个R项中不含R⁴项，一个T项是COOH而另一个T项是P（O）R¹OH，其中R¹如上定义;优选以上T项部分，其中X或Y的一个是COOH;并也优选这样一些配合基，其中n是1和/或保留的X和Y项是H;或A是C-OR³或C-OR⁸，其中R³和R⁸如上定义或

    

    其中R⁴如上定义;或

    A是CH，Q或Z中一个是CH而另一个是C-C（O）-R⁶，其中R⁶如上定义;特别是这些配合基，其中R⁶为NHR⁷，其中R⁷是生物活性物质。

    结构式（Ⅰ）的配合基可以和多种金属离子配合，如钆（Gd⁺³），铁（Fe⁺³）和锰（Mn⁺²），优选和Gd⁺³的配合。这样形成配合物可直接使用或通过共价键合到如葡聚糖、多肽或包括抗体或其碎片的生物活性分子这样的大分子上而获得并可用于诊断目的。这些共轭物和配合物可用作造影剂。

    本发明的配合物和共轭物可以设计成带有特定的全电荷，该电荷可良好作用于体内的生物定位和成像对比。如，当金属离子为+3时可得到以下物质：

    （A）-2或-2以上的总电荷，三个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，n是1;或

    二个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，第三个R项中T是COOH，n是1或

    二个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，第三个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹中C₁-C₅烷基，n是1;或

    二个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，第三个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是-O-（C₁-C₅烷基），n是1或

    （B）总电荷为-1

    一个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，其它二个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是-O-（C₁-C₅烷基），n是1;或

    一个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，其它二个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是C₁-C₅烷基，n是1;或

    一个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是OH，另二个R项中T是COOH，n是1;或

    （C）整体为总中性-当

    三个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是-O-（C₁-C₅烷基），n是1;或

    三个R项中T是P（O）R¹OH，其中R¹是C₁-C₅烷基，n是1;或

    （D）总电荷为+1-当

    A、Q或Z中一个是N⁺-R⁵X^-，其中R⁵和X^-如上定义;一个R项中T部分是P（O）R¹OH，其中R¹是C₁-C₅烷基或-O-（C₁-C₅烷基）;另二个R相中，T部分是COOH或P（O）R¹OH，其中R¹是C₁-C₅烷基，-O-（C₁-C₅烷基）;并且所有X和Y项是H。

    可以按配方制备配合物和共轭物，以成药允许形态使用到动物上。

    用带有其它金属离子的结构式（Ⅰ）的配合基用作诊断如癌症的疾病是可能的。在另外的共同未决的申请中讨论了使用这些配合物和共轭物。

    为命名编号的结构式（Ⅰ）的化合物如下：

    

    本发明的一个方面涉及含合成改进为顺磁螯合物造影剂，使该造影剂位点特异性地传递到所希望组织上的研究。根据组织亲和力与由非特异性的灌注产生的对比度相反，其优点是提高了在所注意区域内的对比度。上述的非特异性的灌注能或不能与细胞外试剂显示。结构式（Ⅰ）的特异性可通过调节总电荷的配合物的亲油性来控制。配合物电荷的总范围是从-3到+1。如，对含2个或2个以上的PO₃H₂基团的配合物，总电荷是高负电性并期望骨架吸收，而配合物总电荷为0（也就是中性）时，该配合物有穿过脑血栓的能力并且正常脑组织可吸收。

    可以通过螯合物的离子或共价键连接到自然存在或合成分子上可了解组织的特异性，上述分子具有所希望目标组织的特异性。该方法一可能的应用是通过螯合物被共轭到单克隆抗体的使用，上述单克隆抗体将运送顺磁螯合物到致病组织上能由MRI产生显示。另外，相对于未结合的螯合物，顺磁螯合物连接到大环分子上可以进一步提高造影剂的有效性以得到改进的对比度。由Lauffer最近的研究（美国专利4，880，008和4，899，755）证明改变亲油性可产生特异性组织试剂，并提高了亲油特性促使非共价键与血红蛋白的相互作用而导致松弛增强。

    另外，特别优选电荷呈中性的结构式（Ⅰ）的造影剂形成本发明的共轭物，因为不希望螯合物和蛋白质之间的离子相互作用达到最小，这样，保持了抗体的免疫反应性。同样该中性配合物相对于DTPA-Gd⁺³来说渗透性降低，这可以减轻注射时的不舒适感。

    在理论上不希望被限制，认为当生成本发明的带电的配合物（如对于骨架带-2或-3，对于肝脏带-1，或对于心脏带+1），改变螯合物的离子电荷影响生物定位。因此，对于同样的位置，如果抗体或其它直接部分也是特异性的，则共轭物呈现二部分以帮助位置特异性的传递。

    在结构式（Ⅰ）中使用的术语定义如下。“C₁-C₃烷基”，“C₁-C₅烷基”，“C₁-C₁₈烷基”包括直链和支链烷基二种。“动物”包括热血哺乳动物，最好是人类。

    “生物活性物质”是指葡聚糖，肽或对受体有特异性亲和力的分子，优选抗体或抗体碎片。

    “抗体”是指一些多克隆，单克隆，嵌合抗体或异种抗体，优选单克隆抗体;“抗体碎片”包括Fab碎片和F（ab¹）₂碎片和对于所希望的单个或多个抗原决定基有特异性的抗体的任意部分。当用术语“放射性金属螯合物/抗体共轭物”或“共轭物”时，“抗体”是指包括所有抗体和/或抗体碎片，包括半合成或其遗传工程设计的变体。允许的抗体为1116-NS-19-9（抗-着色癌（Coloretal  Carcinoma）），1116-NS-3d（抗-CEA），703D4（抗-人肺癌），704A1（抗人肺癌），CC49（抗-TAG-72），CC83（抗-TAG-72）和B72.3。杂细胞系（hybridoma  cell  lines）1116-NS-19-9，1116-NS-3d，703D4，704A1，CC49，CC83和B72.3保存在美国式培养物收集库（the  American  Type  Culture  Collection），注册号分别为ATCC  HB  8059，ATCC  CRL8019，ATCC  HB8301，ATCC  HB8302，ATCC  HB9459，ATCC  HB9453和ATCC  HB8108。

    这里，“配合物”是指与金属离子配合的结构式（Ⅰ）的化合物的配合物，这里至少一个金属原子被螯合或被多价螯合;“共轭物”是指金属离子螯合物，是以共价键连接到抗体或抗体碎片上。术语“双官能连接成分”，“双官能螯合剂”和“官能螯合剂”可相互间代替使用，所指的化合物有一部分螯合剂能螯合到金属离子上，有一部分共价地键合到螯合部分上，该化合物可作为共价地连接到抗体或抗体碎片的手段。

    这里所用的“成药允许的盐类”是指结构式（Ⅰ）的化合物的盐类的任何盐或混合物。它们在用于治疗和诊断动物尤其是哺乳动物时完全没有毒性。因此，本发明这些盐很有用。通过来自有机物的或无机物的标准反应形成这些盐的典型例包括如正硫酸的，氯化氢的，磷酸的，乙酸的，琥珀酸的，柠檬酸的，乳酸的，马来酸的，富马酸的，棕榈酸的，胆酸的，Palmoic，粘液酸的，谷氨酸的，葡糖酸的，d-樟脑酸的，戊二酸的，甘醇的，苯二酸的，含酒石酸的，甲蚁酸的，月桂酸的，Steric，水杨酸的，甲基磺酸的，苯磺酸的，山梨酸的（Sorbic），苦味酸的，苯甲酸的，肉桂酸的和其它合适的酸的。还包括由标准无机物的反应或有机物的反应形成的盐如铵或1-脱氧-1-（甲氨基）-D-葡聚糖醇（glucitol），碱金属离子，碱土金属离子和其它类似的离子。特别优选的是结构式（Ⅰ）化合物盐类是钾盐，钠盐和铵盐。也包括以上盐的混合物。

    由各种方法制备结构式（Ⅰ）的化合物，典型合成的这些方法由下面给出的反应方案提供。

    在方案1中，制备结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，该方案也适用），T＝PO₃H₂，以及Q、A和Z＝CH。

    

    方案2制备结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，该方案也适用），

    

    其中R¹＝-O-（C₁-C₅烷基）;Q、A和Z＝CH。

    

    方案3制备结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，该方案也适用），

    

    其中R¹＝C₁-C₅烷基;Q、A和Z＝CH。

    

    方案4制备结构式（Ⅰ）化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），

    

    其中R¹＝-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;A＝C-Br，Q和Z＝CH。

    

    

    方案5制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3也适用），

    

    其中R¹＝-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;

    

    R⁴＝H、NO₂，NH₂或SCN;Q和Z＝CH。

    

    

    

    方案6制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3也适用），

    

    其中R¹＝-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;A＝C-OR⁸，其中R⁸＝C₁-C₅烷氨基;Q和Z＝CH。

    

    

    〉

    

    

    方案7制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），

    

    其中R¹＝-OH，-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;Z＝C-C（O）-R⁶，其中R⁶＝OH;Q和A＝CH。

    

    

    方案8制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），

    

    其中R¹＝-OH，-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;Z＝C-CH₂-R³，其中R³＝苄基;Q和A＝CH。

    

    

    

    

    方案9制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），

    

    其中R¹＝-OH，-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;A＝N或N-R⁵;R⁵＝C₁-C₁₆烷基卤;Q和Z＝CH。

    

    

    

    方案10制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），

    

    其中R¹＝-OH、-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;Q＝N-R⁵;R⁵＝C₁-C₁₆烷基卤;A和Z＝CH。

    

    

    方案11制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3也适用），

    

    其中R¹＝-OH、-O-（C₁-C₅烷基）或C₁-C₅烷基;Q＝N或N-R⁵;R⁵＝C₁-C₁₆烷基卤;A和Z＝CH。

    

    

    方案12制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），R在3位上有

    

    其中R¹＝-OH或-O-（C₁-C₅烷基）;其它二个R项有T＝COOH;并且A、Q和Z＝CH。

    

    方案13制备结构式（Ⅰ）化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），R在3位和6位有

    

    其中R¹＝OH或-O-（C₁-C₅烷基）;其它R项在9位有T＝COOH;并且A、Q和Z＝CH。

    

    方案14制备结构式（Ⅰ）化合物，其中X和Y＝H，n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），R在3位和9位有

    

    其中R¹＝-OH或-O-（C₁-C₅烷基）;并且其它R项在6位有T＝COOH;并且A、Q和Z＝CH。

    

    方案15制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用），R项在3位和9位有

    

    其中R¹＝-OH或-O-（C₁-C₅烷基）;并且X和Y＝H;R项在6位有T＝，其中R⁴＝NO₂或NH₂;并X或Y中一个＝H而另一个＝COOH;并且A、Q和Z＝CH。

    

    

    

    方案16制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中n＝1（但相应于试剂的变化，如果n＝2或3，也适用）R项在3位和6位有

    

    其中R¹＝-OH或-O-（C₁-C₅烷基）;并且X和Y＝H;R项在9位有，

    其中R⁴＝NO₂或NH₂;并且X和Y中一个＝H，而另一个＝COOH，A、Q和Z＝CH。

    

    

    方案17制备的结构式（Ⅰ）的化合物，其中n＝1（但相应于试剂的变化如果n＝2或3也可以），R项在6位有

    

    其中R¹＝-OH;并且X和Y＝H;

    R项在3位和9位有T＝COOH;并且A、Q和Z＝CH。

    

    在上述方案中，一般方法的描述说明可被采用的特定步骤，以实现所希望的反应步骤。这些方法步骤描述如下。

    合成方案1以商购的双-吡啶醇（1）用亚硫酰氯的卤化作用开始。用于转变醇成为亲电子作用物相类似的方法，如用甲苯磺酰氯、HBr或HCl处理的类似方法，也会生成类似地反应产物，该产物在后来的闭环反应中良好。大环化方法在文献中是很多的，要得到四氮杂环（3）可按照Stetter等人发表在Tetrahedron37，767-772（1981）上的方法制备。自从使用适度的条件得到高收率类大环产物的较普通方法公布以来[A.D.Sherry等人在J.Org  Chem，54，2990-2992（1989）]。中间体大环[（3）得到（4）]的脱甲苯磺酰作用（Detosylation）是在酸性条件下以高收率完成的。还原脱甲苯磺酰作用（Detosylation）的方法在文献中也是周知的并可采用本反应程序。生成三-氨基磷酸衍生物的膦酰基甲基作用是在普通Mannich碱性条件下用亚磷酸和甲醛进行的。

    除了膦酸衍生物之外，膦酸脂[如结构式（6）]也可以在醇或对质子惰性溶剂中（如乙腈、苯、甲苯、四氢呋喃）的有机物条件下用所希望的二烷基亚膦酸盐作为亲核物（见方案2）制备。基于胺的反应性，这些反应可以在温度为约-10到约100℃之间进行。另外，三烷基亚磷酸盐可在类似Mannich条件下经由氧化三价磷到五价磷形成膦酸酯，并同时脱去一摩尔醇（Arbuzov反应）。该反应可在有或无溶剂存在下进行。当醇作为溶剂用于二烷基或三烷基亚磷酸盐反应时，用醇更有利，这样在膦酸酯形成的同时避免酯基转移作用形成另一种产物。这一类酯也可由在溶剂中的α-卤化二烷基膦酸N-烷基取代作用制备，所说的溶剂如乙腈，氯仿，二甲基甲脒、四氢呋喃或1，4-二噁烷并带有或不带有在室温或室温以上温度加入的非亲核碱如碳酸钾。生成的过酸脂中间物在碱性条件下（含水氢氧化物，pH＝8-14，30-110℃）立即被水解以得到相应的半酸衍生物。

    在方案3中，大环甲基膦酸（10或11）在类似于方案2所述条件下制备。用亲核物二乙氧甲膦（diethoxymethylphosphine）和仲甲醛在溶剂中进行缩合，上述溶剂如四氢呋喃二甲基甲酰胺，二噁烷，乙腈或醇。生成的磷酸酯在酸性（6N  HCl，80-100℃）或碱性（化学计算量碱，40-100℃）条件下水解生成相应的甲膦酸。同样，由A.D.Sherry等人发明的方法（Inorg.Chem，于1991提出）用原处生成的乙膦酸可得到亲油性增加的亚磷酸盐衍生物。

    方案4说明结合官能度成为12-节的四氮杂大环吡啶单元的方法。这样白屈氨酸（Sigma  Chemical  Company;12）可以被转变成具有在吡啶4位上有合适取代的双-卤甲基衍生物（13）。通常转换成这种中间体一般是自然地，其制备由Takalo等人公布在[Acta  Chemica  Scandinavica  B  42，373-377（1988）]上。接着用带中间体（15）的大环化作用可通过在100℃和钠代三甲苯磺酸盐三胺的标准DMF反应实现，或在室温与三甲苯磺酸盐自由碱和碳酸钾，碳酸钠或碳酸铈作为碱生成与前述相类似的产品。产生膦半酸和膦酸官能度的后续反应是与前述方案中的转化和条件完全相同。

    在方案4中，4-卤代吡啶取代大环（16）是由方案5描述的在4位取代得到的。因此，有机金属Pd（Ⅱ）配合物可用来促进苯乙炔的苯乙炔衍生物和吡啶大环之间的偶合反应。该转变的一般反应条件是在无水条件下，用三乙胺作溶剂，反应温度在约10到约30℃之间以得到最隹收率。相同产物也可用Cu（Ⅰ）苯乙炔化合物在无水吡啶中于温度约为80到约110℃之间得到。另外，标准阴离子烷基化作用的方法可用来作用于吡啶核上的取代的，如在DMF中或二噁烷中于80到约100℃使用碳酸钾或氢氧化钠碱的钠代醇盐（Sodioalkoxides）。用该方法衍生的大环四氮杂大环（24、25、26、27、28）与生成类似的膦酸螯合物的前述方案的转变相一致。

    在方案6中描述了不同的4-吡啶取代，利用此，4-羟基吡啶部分（29）可用产生连结腈（31）的中间脂的溴烷基腈烷基化，上述腈（31）可进一步连到大环结构上。该类型烷基化方法在无水条件下于如四氢呋喃（THF）的对质子惰性的溶剂中并用如氢化钠或丁基钾的非亲核性碱于-30到约-80℃之间完成得很好。对于非环形的类似物，该方法的主要部分已由Chaubet等人发表在[Tetrahedron  Letters  31（40），5729-5732（1990）]上。用本方法制备的大环腈可用标准方法还原成伯胺（36），接着由2-（叔-丁氧羰基氧代亚胺）-2-苯乙腈（BOC-ON;37）保护伯胺。接下来，大环仲胺（38、39、40、41、42、43）的官能作用可以通过如方案6描述的用三氟乙酸除去保护基团的附加要求讨论的方法完成。

    官能作用还可以如方案7所示那样在大环结构的吡啶环上3位实现。Newkome等人在[Tetrahedron  39（12），2001-2008（1983）]上已公开了前述的在本合成路线中作为初始原料的乙基2，6-卤代甲基尼古丁（halomethylnicotinate）（45）的合成。因此，三-甲苯磺酸化大环中间体（46）可在酸性条件（HBr/AcOH  25-115℃）去甲苯磺酸化并同时水解产生尼古丁酸衍生物（48），或在去甲苯磺酸作用前回流乙醇中还原脂而生成3-羟甲基中间产物（47）。取代尼古丁酸大环成为一般方法以用于仲胺官能作用而生成不同类型的结构式（Ⅰ）的膦酸螯合物（49、50、51、52、53）。

    相对地，在大环胺官能作用前3-羟甲基类被保护是有利的。方案8中给出保护基团苄基（B₂），因为它必须抵抗去甲苯磺酸作用步骤中所遇到的强酸性条件。当用前面描述的方法完成了仲胺适当官能作用后，苄基在适度催化氢化条件下（58）被除去。

    大环衍生物也可用12-14方案制备，其中羧酸盐和膦酸盐螯合官能作用了出现在同一分子中。因此，可以在用溴乙酸的一般含水烷基化过程引入不同程度羧化官能度。接着，保留的胺可以用前面方案中讨论过的使用甲醛和亚磷酸、二烷基膦酸盐或三烷基亚膦酸盐被膦酰甲基化。

    方案15和16描述在一大环氮位上引入一芳香硝苄基取代的合成方法。代表性的，大环胺在如乙腈或DMF有机溶剂中，在室温用非亲核碱如碳酸钾进行单-N-官能作用。保留在氮位的另外的官能作用是用前面描述的方法和条件实现的。引入所希望的螯合部分后，硝基团用氧化铂和在水中的氢还原。在该形式中，螯合剂与能连接较大合成分子或天然分子的共轭技术相一致。

    方案17描述了大环化合物（4）的合成，其中在3位和9位的胺至少与两摩尔羟甲磺酸钠盐在pH约9的水中反应，产生相应的3位和9位是甲磺酸钠盐（119）的大环化合物。之后，磺酸基用氰化钠取代形成相应氰代甲烷衍生物（120）。氰基被水解成羧酸;同时加入亚磷酸和甲醛;或同亚磷酸衍生物和甲醛连续反应以形成在6位（121）的膦酸，接着升高温度，对氰基和任意存在的亚磷酸衍生物进行酸水解。生成的化合物带有在3位和9位的二个羧酸基团和在6位的一膦酸基团的大环化合物。膦甲基作用也可以通过上述方法实现。

    用于形成本发明配合物的金属离子是Gd⁺³，Mn⁺²，Fe⁺³并可商购到，例如来自Aldrich化学公司。所含阴离子是卤素离子，优选氯或游离盐（金属氧化物）。

    本发明的“顺磁核素”指的是金属离子所表现的自旋角动量和/或轨道角动量。这二种类型动量相结合给出以很大程度取决于载有未配对电子的原子的方法观察到的顺磁矩，而该方法较少程度取决于这些原子的周围环境。发现用于本发明的顺磁核素是钆（Gd⁺³）、铁（Fe⁺³）和锰（Mn⁺²），并优选Gd⁺³。

    配合物用周知的方法制备。如参见“螯合剂和金属螯合物”Dwyer  &  Meller，Acadenlic  press（1964）第7章。也可参见“氨基酸合成制造和应用”中的制造氨基酸的方法（methods  for  making  amino  acids  in  Synthetic  Production  and  Utilization  of  Amino  Acids）（由Kameko等人出版）John  Wiley  &  Sons（1974）。一配合物的制备实例包括双环多氮杂大环膦酸和金属离子在pH＝5～7的含水条件下反应。由化学键形成配合物并生成一个顺磁核组合物，即从配合体上顺磁核素稳定地分解。

    本发明配合物中配合体与金属的摩尔数比至少约1∶1，优选从1∶1到3∶1，更优选1∶1到15∶1。配合体超过量是不希望的，因为未配合的配合体可能对动物有毒或致使心脏骤停或低血钙症（hypocalcemic）痉挛。

    这里所说的可用于共轭物的抗体或抗体碎片可用公知技术制备。高特异性单克隆抗体可以用公知的杂交技术得到，见例Kohler和Milstein的[Natare，256，495-497（1975）;和Eur.J.Immunol.，6，511-519（1976）]。这种抗体通常有高特异性反应。在抗体目标共轭物中，可使用抗任何希望的抗原或辅助抗原的抗体。优选在共轭物中使用的抗体是单克隆抗体或具有其对所希望的抗原决定基高特异性的碎片。本发明所用的抗体可以抗如肿瘤、细菌、真菌、病毒、寄生物、支原菌属，分化的和其它的细胞膜抗原，病原体表面抗原，毒素、酶，变应原，药物和任何生物活性分子。抗体或抗体碎片的一些例是1116-NS-19-9、1116-NS-3d、703D4、704A1、CC49、CC83和B72.3。所有这些抗体存放在ATCC中。更完整的抗原系列可在美国专利4，193，983中找到。本发明的共轭物特别适合于诊断各种癌症。

    本发明是与生理上可接受的载体，赋形剂或赋形药（Vehicle）一起使用的。制备这些配方的方法是公知的。这些配方可以是悬浮状，可注射的溶液或其它合适的配方。含或不含佐药功能的生理上可接受的悬浮媒体可以使用，配方的“有效剂量”被用于诊断。给量依据动物疾病和身体的参数变化，如体重。使用本发明配方进行体内诊断要仔细考虑。

    本发明的一些螯合剂的其它用途包括从体内除去不希望有的金属（例如铁），连接聚合载体以用于不同目的，例如作诊断剂，和通过选择性萃取除去金属离子。结构式（Ⅰ）的配合体至少有二个R项中T为P（O）R¹OH，可被用作为污垢抑制剂（Scale inhibitors）以控制金属离子。一些配合体可以少于化学计算的量使用。在美国专利2，609，390;3，331，773;3，336，221和3，434，969公开了化合物已知的类似的用途。

    通过下面的典型实例以进一步了解本发明。

    在下面实例中使用的一些术语定义如下：

    LC＝用装有人工装填Q-Sepharose^TM阴离子交换柱

    （23×2cm）的Dionex  2010i系统在低压下进行液相色谱提纯。

    DMF＝二甲基甲酰胺（dimethylformamide）。

    AcOH＝乙酸。

    ICP＝电感偶合等离子体。

    g＝克。

    mg＝毫克。

    kg＝千克。

    ml＝毫升。

    μl＝微升。

    pH稳定性一般方法

    通过在0.1N HCl中加入2μL，3×10^-4M¹⁵⁹GdCl₃成为2ml3×10^-4M GdCl₃载体液以制备¹⁵⁹GdCl₃贮存液，之后在去离子水中制备合适的配合体溶液。之后通过结合配合体（溶解在100～500μl去离子水中）和2ml¹⁵⁹GdCl₃贮存液制备1∶1配合体/金属的配合物，接着混合得到酸性溶液（pH＝2）。用0.1N NaOH使溶液的pH值上升到7.0，通过Sephadex^TMG-50柱用配合物溶液试样测定金属在配合物中的百分比，用4∶1盐水（85%NaCl/NH₄OH）洗提并收集2×3ml成分，把在结合洗提中放射性量和留在树脂中（留在树脂上未配合的金属）放射性量相比较。通过1M NaOH或1M HCl调节配合物溶液的等分试样的pH值并用如上所述的离子交换方法测定金属存在于配合物中的百分比而得到pH稳定性分布型。

    开始原料（Starting  Materials）

    实例A

    制备2，6-二（氯甲基）吡啶

    将24g（0.17mol）的2，6-双（羟甲基）吡啶加入到（冰浴）冷却的100ml亚硫酰氯中。30分钟后，反应混合物被暖到室温，之后回流1.5小时，在反应混合物冷却到室温后，过滤形成固体，用苯洗涤，真空干燥。然后固体用饱和NaHCO₃中和，过滤，干燥，得到23.1克（71.5%）标题产物为灰白色晶体。mp（熔点）为74.5～75.5℃，进一步的特征是：

     ¹H NMR（CDCl₃）

    δ4.88（s，4H），7.25～7.95（m，3H）。

    实例B

    制备3，6，9-三（对甲苯磺酰基）-3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯。

    搅拌6.9g（11.4mmol）1，4，7-三（对甲苯磺酰基）二乙烯三胺二钠盐的DMF溶液并在氮气下加热到100℃。将含2g（11.4mmol）2，6-二（氯甲基）吡啶（用实例A的方法制备）的37ml  DMF用45分钟滴加入到该溶液中。当加入完成，在40℃搅拌反应混合物达12小时。之后将50～75ml水加入到反应混合物中，生成即刻分离的NaCl。接着标题产物沉淀。然后过滤生成的浆状物，用水洗涤固体，真空干燥，得到标题产物为淡棕黄色粉末6.5g（86%），mp168-170℃，进一步的特性为：

     ¹H NMR（CDCl₃）

    δ2.40（s，3H），2.44（s，6H），2.75（m，4H），3.30（m，4H），4.28（s，4H），7.27（d，2H），7.34（d，4H），7.43（d，2H），7.65（d，4H），7.75（t，1H）;和

     ¹³C NMR

    δ21.48，47.29，50.37，54.86，124.19，127.00，127.11，129.73，135.04，135.74，138.95，143.42，143.73，155.15.

    实例C

    制备3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯

    混合以64∶35之比的48%HBr和冰乙酸（glacial  AcOH）制备HBr和AcOH溶液。在112ml  HBr/AcOH混合物中加入5.5g（8.2mmol）3，6，9-三（对甲苯磺酰基）-3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯（用实例B的方法制备），适度回流并不断搅拌加热反应混合物72小时，然后将反应混合物冷却到室温，浓缩到原体积约十分之一，用力搅拌剩余的液体并加入15～20ml二乙醚。过滤形成的灰白色固体，用二乙醚洗涤，真空干燥。然后把干的四氢溴酸盐（tetrahydrobromide  Salt）溶解在10ml水中，用NaOH（50%W/W）调节pH到9.5，用氯仿连续萃取4小时，在干燥全部无水硫酸钠后，蒸出氯仿得到浅棕色油状物，在室温放置逐渐结晶，生成1.2g（71%）标题产品。mp86～88℃。进一步的特征是：

     ¹H NMR（CDCl₃）

    δ2.21（m，4H），2.59（m，4H），3.06（s，3H），3.85（s，4H），6.89（d，2H），7.44（t，1H）;和

     ¹³C NMR

    δ48.73，49.01，53.63，119.67，136.29，159.54。

    实例D

    制备3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13，-三烯-二亚甲基磺酸（dimethylene  sulfonic  acid）。将500mg（2.4mmol）的3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯（按实例C的方法制备）浆状物置于6ml水中搅拌并用6M盐酸调节pH到3。在混合物中加入682mg（5.1mmol）羟基甲磺酸钠盐（hydroxymathanesulfonic  acid  sodium  salt），用50%含水氢氧化钠调节pH到9，在室温下搅拌3小时后，¹³C NMR显示完全转变成标题的二亚甲基磺酸产物。

    实例E

    制备3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13，-三烯-3，9-二亚甲基腈（dimethylenenitrile）。

    在来自实例D的含3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯-3，9-二亚甲基磺酸反应混合物中加入47mg（9.6mmol）氰化钠。在室温下搅拌反应混合物24小时。¹³C NMR显示完全转变成双腈化物。过滤反应混合物，用氯仿萃取3×25ml，干燥全部无水硫酸镁，浓缩得到粘油。之后将该油溶解在氯仿中，用环己烷研制，浓缩得到白色粉末530mg（78%）标题二亚甲基腈产品。

    最终产物

    实例1

    制备3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯-3，6，9-三亚甲基膦酸（PCTMP）

    加热2.06g（10mmol）3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯（用实例C的方法制备），11.3g（138mmol）磷酸和15g（152mmol）浓缩盐酸的混合物达到缓慢回流（103℃），不断搅拌，随后滴加（2ml/分钟）入12.2g（150mmol，5ml）含水甲醛（37%）。完全加入后，在回流处搅拌反应混合物16小时，冷却到室温，浓缩成厚厚的粘液。然后产品用LC阴离子交换色谱法（0～30%甲酸，3ml/min，保留时间32分钟）提纯，冷冻-干燥结合部分得到4.8g（99%）标题产品为白色固体，mp275～285℃，进一步的特征是：

     ¹H NMR（D₂O）

    δ2.83（m，6H），3.46（m，10H），7.28（d，2H），7.78（t，1H）;and

     ¹³C NMR

    δ53.61，53.81，55.27，57.93，62.20，125.48，143.08，152.31;和

     ³¹P NMR

    δ8.12（2P），19.81（1P）.

    实例2

    制备¹⁵⁹Gd-3，6，9，15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1（15），11，13-三烯-3，6，9-三亚甲基膦酸（¹⁵⁹Gd-PCTMP）。

    通过溶解3.8mg配合体/0.517ml去离子水（pH＝2）制备实例1的配合体溶液。然后，通过结合40μl配合体溶液和2ml含指示剂¹⁵⁹GdCl₃的含水GdCl₃·H₂O（在0.01N HCl中为3×10^-4）制备成1∶1配合体/金属配合物，混合后，通过Sephadex^TM柱用配合物溶液试样测定金属在配合物中的百分数，用4∶1盐水（0.85%NaCl/NH₄OH）洗提并收集2×3ml分离物，比较在结合的洗脱中与留在树脂上的放射性量。在这样条件下，用洗脱液除去配合物，非配合的金属留在树脂上。用这种方法测定配位达98%，使用通过树脂的溶液试样用于pH研究，然后用上述的一般方法测定pH的稳定性。

    生物分布

    一般方法

    让Sprague  Dawley鼠适应环境5天，然后经尾部静脉管注射100ml配合物溶液。在注射时，对老鼠称重在150～200g之间，30分钟后，用颈脱和切断杀死老鼠，通过偶合到多通道分析仪上的NaI闪烁计数器计算测定每个组织上的放射性量，计数与100μL标准计算比较以测定在每个组织或器官中的剂量百分数。

    假定血液是驱体重量的7%，估算在血液中剂量的百分数，用25乘股骨中剂量百分数估算骨中百分数剂量。假定肌肉是驱体重量的43%，估算肌肉中的百分数剂量。

    除了器官的生物分布外，因为磷酸盐粘合到羟基磷灰石的能力是已知的，可以估算出对于骨定位供给量的结构式（Ⅰ）化合物的螯合物。

    实例Ⅰ

    在表Ⅰ中给出几种组织实例2（¹⁵⁹Gd-PCTMP）配合物注射剂量的百分数。每个数字表示3只老鼠每数据点的最小平均量。

    表1

    对¹⁵⁹Gd-PCTMP在几种组织中注射剂量%组织平均骨头34.87肝0.99肾1.42脾0.07肌肉4.77血液6.27

    成像实验

    通过在2ml去离子水中溶解适量的每种配合物第一次制备（0.5M）的注射溶液。按需用1M  HCl或NaOH调节溶液的pH到7.4。用ICP分析法测定每种溶液中总Gd含量。

    一被麻醉的Sprague  Dawley鼠用肌肉注射上述的几种金属液中的一种，剂量为0.05～0.1mmol  Gd/kg体重。然后在不同的时间间隔成像并与在0时间非注射控制相比较。

    实例Ⅱ

    Gd-PCTMP配合物（按实例2制备）表明肾脏增加以及在肩，脊骨和胸骨的骨定位测定。

    从本文公开的本发明的说明书和实施例中可以了解到，对于本领域的专业人员，本发明的其它实施例将是显而易见地，它仅仅是作为一种典型的可供考虑的说明和实例，本发明的真正范围和精神通过下面的权利要求书表明。