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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710302876.5 (22)申请日 2017.05.03 (71)申请人 上海海洋大学 地址 201306 上海市浦东新区沪城环路999 号 (72)发明人 刘东张远远唐文乔 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人 曹莉 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 一种隆头鱼类群线粒体基因组测定的方法 (57)摘要 本发明涉及鱼类的分子生物学技术领域， 具 体地说， 是一种隆头鱼类群线粒体基因组测定。
2、的 方法。 本发明提供的方法， 包括以下步骤： (1)获 得16SrRNA、 CO1和Cytb基因的部分序列； (2)获 得16SrRNA至CO1的间隔区序列、 tRNA-Leu至 Cytb的间隔区序列和Cytb至16SrRNA的间隔区 序列； (3)获得CO1至tRNA-Leu间隔区的序列； (4) 对步骤(1)、 (2)和(3)中获得的序列进行拼接， 获 得隆头鱼mtDNA基因组全序列。 本发明的有益效 果是高效简洁的隆头鱼类群线粒体全基因组序 列测定的方法。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图1页 CN 106967818 A 2017.07.21 CN 106967818 A。
3、 1.一种隆头鱼类群线粒体基因组测定的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)获得16S rRNA、 CO1和Cytb基因的部分序列： 选择鱼类mtDNA的3个基因16S rRNA、 CO1和Cytb的序列， 相应的各自设计1对引物， 名称分别为16S、 CO1和Cytb， 以隆头鱼DNA为模 板， 进行PCR扩增， 扩增产物直接测序， 分别获得16S rRNA、 CO1和Cytb基因的部分序列； (2)获得16S rRNA至CO1的间隔区序列、 tRNA-Leu至Cytb的间隔区序列和Cytb至16S rRNA的间隔区序列： 将步骤(1)中获得的16S rRNA、 CO1和Cytb基因的。
4、部分序列， 以及公布的 mtDNA的tRNA-Leu的序列设计引物， 实现引物对SC扩增16S rRNA至CO1的间隔区序列； 引物 对LY扩增tRNA-Leu至Cytb的间隔区序列； 引物对YS扩增Cytb至16S rRNA的间隔区序列； (3)获得CO1至tRNA-Leu间隔区的序列： 根据步骤(1)中获得的CO1基因的部分序列和步 骤(2)中获得的tRNA-Leu至Cytb的间隔区的序列， 设计引物对CL， 实现扩增CO1至tRNA-Leu 间隔区的序列； (4)对步骤(1)、 (2)和(3)中获得的序列进行拼接， 获得隆头鱼mtDNA基因组全序列。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特。
5、征在于， 步骤(1)中所述16S的上游引物如SEQ ID NO.1所示、 16S的下游引物如SEQ ID NO.2所示； 所述CO1的上游引物如SEQ ID NO.3所示、 CO1的下游引物如SEQ ID NO.4所示； 所述Cytb的上游引物如SEQ ID NO.5所示、 Cytb的下游 引物如SEQ ID NO.6所示。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述SC的上游引物如SEQ ID NO.7所示、 SC的下游引物如SEQ ID NO.8所示； 所述LY的上游引物如SEQ ID NO.9所示、 LY的 下游引物如SEQ ID NO.10所示； 所述YS的上游引物。
6、如SEQ ID NO.11所示、 YS的下游引物如 SEQ ID NO.12所示。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述CL的上游引物如SEQ ID NO.13所示、 CL的上游引物如SEQ ID NO.14所示。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中的每个扩增反应总体积为 20ul， 其中模板基因组DNA100ng， 每种dNTP， 每种引物各0.5ul； 其中步骤(1)中的扩增反应 为TaqDNA聚合酶0.25U， 94预变性3min， 94变性30sec， 58退火30sec， 72延伸1min， 共35个循环， 最后在72延伸10mi。
7、n。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)和(3)中的每个扩增反应总体 积为20ul， 其中模板基因组DNA100ng， 每种dNTP， 每种引物各0.5ul； 步骤(2)和步骤(3)中的 扩增反应为Long-TaqDNA聚合酶， 94预变性3min， 94变性30sec， 60退火30sec， 72延 伸10min， 共35个循环， 最后在72延伸10min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106967818 A 2 一种隆头鱼类群线粒体基因组测定的方法 技术领域 0001 本发明涉及鱼类的分子生物学技术领域， 具体地说， 是一种隆头鱼类群线粒体基 因组测定的方法。
8、。 背景技术 0002 线粒体是具有独特DNA分子和完整遗传信息传递和表达的半自主性细胞器， 也是 细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所， 在细胞生命活动中具有重要的意义。 真核生物 的线粒体DNA(简称mtDNA)多为共价闭合的双链环状结构， 具有以串联形式排列的多个基 因， 无内含子， 可编码tRNA、 rRNA和一些蛋白质。 由于mtDNA表面缺乏组蛋白的保护， 其序列 易发生突变且不易修复， 这一遗传的特殊性， 已广泛应用于遗传学和系统发育学等方面的 研究。 自第一例人类线粒体基因组的全部序列公布以来， 迄今已报道了上万物种的mtDNA序 列。 0003 隶属于隆头鱼目(Labrifo。
9、rmes)的隆头鱼科(Labridae)是海洋鱼类中仅次于虾虎 鱼科(Gobiidae)的第二大科一级类群， 分布于热带和亚热带海洋， 全世界记载有539种。 我 国自20世纪50年代中期， 陆续开展了黄渤海、 东海、 南海、 南海诸岛海域和北部湾等大规模 的海洋鱼类区系普查。 我国大陆到20世纪80年代中期记录了隆头鱼99种， 台湾至2012年收 录了130种， 目前有名录可查的有157种。 然而， 查询国际公共数据库， 已公布mtDNA全序列的 隆头鱼物种仅有几种(10种)。 这可能与几种常规的mtDNA测序方法不太适用于该类群有 关。 0004 目前， 基于DNA片段差异作为分子标记的主。
10、要有5种： (1)Sanger测序法。 使用物理 或酶切的方法， 使线粒体分割成测序有效长度内的短片段， 克隆至噬菌体或质料载体， 然后 利用Sanger法测序。 该方法步骤繁琐， 费用高。 (2)常规PCR方法。 原理是根据已知的近缘物 种的mtDNA序列作为参考， 设计出能够覆盖mtDNA的引物， 然后应用PCR技术扩增出线粒体基 因组， 测序获得mtDNA的序列。 该方法需要大量的引物和繁琐的实验操作， 但无法得到长DNA 片段。 (3)对常规PCR进行改良后， 提出了Long PCR方法。 该法能够扩增5kb以上的DNA片段， 2 对或更多的引物对扩增出相互重叠的DNA长片段， 分离纯。
11、化后作为模板直接进行测序。 该方 法成功的关键在于设计和筛选出通用的mtDNA引物对长片段进行有效扩增。 (4)滚环扩增技 术。 该技术通过随机六聚体引物和靶序列杂交并进行恒温持续延伸， 形成一条长度是模板 长度数千倍、 具有大量的串联重复且与mtDNA完全互补的线状单链。 然后由第2条引物， 在第 1条引物扩增产物的基础上， 与产物的部分序列互补， 经杂化和延伸， 获得mtDNA克隆， 可作 为PCR反应的模板进行扩增和测序。 这一技术较少应用于mtDNA的测序。 (5)下一代高通量测 序(NGS)技术。 NGS的最大优势在于每次能对多达几百万条DNA分子进行测序， 高效、 快速的 获得大量。
12、DNA序列。 NGS用于mtDNA测序， 需要有mtDNA的参考序列， 且不易发现序列组装的错 误， 并可能有核基因污染， 限制了NGS技术的普遍应用。 0005 针对海洋隆头鱼类群的鱼类线粒体全基因组测序的方法非常稀少， 对于常见的三 带颈鳍鱼(Iniistius trivittatus)的线粒体基因组全序列的测定还未见研究报道。 说明书 1/4 页 3 CN 106967818 A 3 发明内容 0006 本发明针对当前技术存在缺点和不足， 提供一种隆头鱼类群线粒体全基因组序列 测定的方法。 0007 本发明提供的高效简洁的隆头鱼类群线粒体基因组测定的方法， 包括以下步骤： 0008 (1。
13、)获得16S rRNA、 CO1和Cytb基因的部分序列： 选择公开鱼类mtDNA的3个基因16S rRNA、 CO1和Cytb的序列， 相应的各自设计1对引物， 名称分别为16S、 CO1和Cytb， 以隆头鱼 DNA为模板， 进行PCR扩增， 扩增产物直接测序， 分别获得16S rRNA、 CO1和Cytb基因的部分序 列； 0009 (2)获得16S rRNA至CO1的间隔区序列、 tRNA-Leu至Cytb的间隔区序列和Cytb至 16S rRNA的间隔区序列： 将步骤(1)中获得的16S rRNA、 CO1和Cytb基因的部分序列， 以及公 布的mtDNA的tRNA-Leu(CUN)。
14、的序列设计引物， 实现引物对SC扩增16S rRNA至CO1的间隔区 序列； 引物对LY扩增tRNA-Leu(CUN)至Cytb的间隔区序列； 引物对YS扩增Cytb至16S rRNA的 间隔区序列； 0010 (3)获得CO1至tRNA-Leu间隔区的序列： 根据步骤(1)中获得的CO1基因的部分序列 和步骤(2)中获得的tRNA-Leu(CUN)至Cytb的间隔区的序列， 设计引物对CL， 实现扩增CO1至 tRNA-Leu(CUN)间隔区的序列； 0011 (4)对步骤(1)、 (2)和(3)中获得的序列进行拼接， 获得隆头鱼mtDNA基因组全序 列。 0012 其中， 步骤(1)中所述。
15、16S的上游引物如SEQ ID NO.1所示、 16S的下游引物如SEQ ID NO.2所示； 所述CO1的上游引物如SEQ ID NO.3所示、 CO1的下游引物如SEQ ID NO.4所 示； 所述Cytb的上游引物如SEQ ID NO.5所示、 Cytb的下游引物如SEQ ID NO.6所示。 0013 其中， 步骤(2)中所述SC的上游引物如SEQ ID NO.7所示、 SC的下游引物如SEQ ID NO.8所示； 所述LY的上游引物如SEQ ID NO.9所示、 LY的下游引物如SEQ ID NO.10所示； 所 述YS的上游引物如SEQ ID NO.11所示、 YS的下游引物如SE。
16、Q ID NO.12所示。 0014 其中， 步骤(3)中所述CL的上游引物如SEQ ID NO.13所示、 CL的下游引物如SEQ ID NO.14所示。 0015 其中， 所述步骤(1)中的每个扩增反应总体积为20ul， 其中模板基因组DNA100ng， 每种dNTP， 每种引物各0.5ul； 其中步骤(1)中的扩增反应为TaqDNA聚合酶0.25U， 94预变 性3min， 94变性30sec， 58退火30sec， 72延伸1min， 共35个循环， 最后在72延伸 10min。 0016 其中， 所述步骤(2)和(3)中的每个扩增反应总体积为20ul， 其中模板基因组 DNA100n。
17、g， 每种dNTP， 每种引物各0.5ul； 步骤(2)和步骤(3)中的扩增反应为Long-TaqDNA聚 合酶， 94预变性3min， 94变性30sec， 60退火30sec， 72延伸10min， 共35个循环， 最后 在72延伸10min。 0017 本发明的有益效果是可以快速、 简洁、 准确和高效地测定隆头鱼mtDNA基因组全序 列。 附图说明 说明书 2/4 页 4 CN 106967818 A 4 0018 图1是3步引物设计和PCR扩增隆头鱼mtDNA基因组全序列的方法所使用的引物位 置， 及扩增方向。 具体实施方式 0019 下面结合实施例， 对本发明作进一步说明： 0020。
18、 实施例1 0021 实验材料 0022 隆头鱼类群选择三带颈鳍鱼作为代表种， 样本采自广州沿海。 0023 基因组DNA提取 0024 样本基因组DNA的提取， 按照上海Sangon的UNIQ10柱式基因组DNA提取试剂盒说 明书操作， 提取的DNA用紫外分光光度计检测其质量和浓度， 20保存备用。 0025 引物设计 0026 结合附图， 详述本发明的引物设计和PCR扩增在隆头鱼mtDNA基因组全序列测定方 面的应用。 第一步， 根据公布的鱼类mtDNA相对保守的基因16SrRNA、 CO1和Cytb的序列， 用 PrimerPremier6.0软件和Jellyfish1.4软件， 设计基。
19、因特异引物， 进行PCR扩增和测序。 第 二步， 依据已测序的序列和其他鱼类公布的mtDNA的tRNA-Leu(CUN)的序列， 用 PrimerPremier6.0软件和Jellyfish1.4软件， 设计特异引物扩增基因间隔区的序列， 进行 PCR扩增和测序。 第三步， 根据已测序的序列， 设计特异引物扩增基因间隔区的序列， 进行 PCR扩增和测序。 0027 所述PCR扩增的引物序列分别是： 0028 16S的上游引物： AGAGAAAGTACCGCAAGGGAAAGC(SEQ ID NO.1)； 0029 16S的下游引物： TCCTGATCCAACATCGAGGTCGTA(SEQ I。
20、D NO.2)； 0030 CO1的上游引物： GGCTACAACCCACCGCTTAAACC(SEQ ID NO.3)； 0031 CO1的下游引物： AGTCTGAGTATCGTCGAGGCATTCC(SEQ ID NO.4)； 0032 Cytb的上游引物： ACCACCGTTGTTATTCAACTACAAGAAC(SEQ ID NO.5)； 0033 Cytb的下游引物： CCGACTTCCGGATTACAAGACCG(SEQ ID NO.6)。 0034 SC的上游引物： AAGCAGATATGTTAATCACCTCCTACAGAG(SEQ ID NO.7) 0035 SC的下游引物。
21、： GCCGAAGAATCAGAATAAGTGTTGGTAG(SEQ ID NO.8) 0036 LY的上游引物： ACAGCTCATCCGTTGGTCTTAGG(SEQ ID NO.9) 0037 LY的下游引物： GAGGTGTAGTGTATGGCGAGGAA(SEQ ID NO.10) 0038 YS的上游引物： CCTCAGTCCTGTACTTCTTCCTCTTC(SEQ ID NO.11) 0039 YS的下游引物： CGATAGGTCTGTCACCGCTACTC(SEQ ID NO.12) 0040 CL的上游引物： TTTCAAGCCAACCACATAAC(SEQ ID NO.1。
22、3) 0041 CL的下游引物： CGACCCCTTCCCAGCCAATA(SEQ ID NO.14) 0042 PCR扩增和测序 0043PCR扩增反应在德国Eppendorf公司生产的ep gradient热循环仪 上进行， 每个扩增反应总体积为20ul， 其中模板基因组DNA10Ong， 每种dNTP， 每种引物各 0.5ul， TaqDNA聚合酶0.25U， 16S、 COI和Cytb引物的PCR反应液在94预变性3min， 94变性 30sec， 58退火30sec， 72延伸1min， 共35个循环， 最后在72延伸10min。 PCR产物在 说明书 3/4 页 5 CN 1069。
23、67818 A 5 1.5琼脂糖凝胶电泳中分离， 用上海Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段， 纯化 方法参照产品手册进行， 将回收的DNA片段直接送测序公司上机测序。 引物对SC、 LY、 YS和CL 采用Long-PCR法进行扩增， 具体是PCR反应体系与前述一样， 仅是TaqDNA聚合酶替换成 Long-TaqDNA聚合酶， 反应程序： 94预变性3min， 94变性30sec， 60退火30sec， 72延 伸10min， 共35个循环， 最后在72延伸10min。 PCR产物在1.5琼脂糖凝胶电泳中分离， 胶 回收目的片段， 送测序公司上机测序。 0044 序列拼接和分析 。
24、0045 PCR产物经回收测序后， 利用序列两端的重叠序列， 采用Jellyfish软件进行序列 拼接， 获得隆头鱼中的三带颈鳍鱼(Iniistius trivittatus)的完整的mtDNA基因组序列， 全长16820bp， 经Blastn软件在NCBI数据库中进行核苷酸序列相似性分析， 与隆头鱼中的远 东拟隆头鱼(Pseudolabrus eoethinus)的mtDNA基因组(登陆号:EU560728)全序列的相似 性为73.5， 确认本方法获得了一个新的、 有效的隆头鱼mtDNA基因组。 0046 以上所述为本发明的较佳实施例而已， 但本发明不应该局限于该实施例所公开的 内容。 所以。
25、凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改， 都落入本发明保护的范 围。 说明书 4/4 页 6 CN 106967818 A 6 SEQUENCE LISTING 上海海洋大学 一种高效简洁的隆头鱼类群线粒体基因组测定的方法 14 PatentIn version 3.3 1 24 DNA 人工序列 1 agagaaagta ccgcaaggga aagc 24 2 24 DNA 人工序列 2 tcctgatcca acatcgaggt cgta 24 3 23 DNA 人工序列 3 ggctacaacc caccgcttaa acc 23 4 25 DNA 人工序列 4 agtctga。
26、gta tcgtcgaggc attcc 25 5 28 DNA 人工序列 5 accaccgttg ttattcaact acaagaac 28 6 23 序列表 1/3 页 7 CN 106967818 A 7 DNA 人工序列 6 ccgacttccg gattacaaga ccg 23 7 30 DNA 人工序列 7 aagcagatat gttaatcacc tcctacagag 30 8 28 DNA 人工序列 8 gccgaagaat cagaataagt gttggtag 28 9 23 DNA 人工序列 9 acagctcatc cgttggtctt agg 23 10 23。
27、 DNA 人工序列 10 gaggtgtagt gtatggcgag gaa 23 11 26 DNA 人工序列 11 cctcagtcct gtacttcttc ctcttc 26 12 23 DNA 人工序列 12 序列表 2/3 页 8 CN 106967818 A 8 cgataggtct gtcaccgcta ctc 23 13 20 DNA 人工序列 13 tttcaagcca accacataac 20 14 20 DNA 人工序列 14 cgaccccttc ccagccaata 20 序列表 3/3 页 9 CN 106967818 A 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 106967818 A 10 。