技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种ERK1/2蛋白 抑制多肽、其制备方法及应用。
背景技术
Ras蛋白是一种小G蛋白，RAS信号途径是一种很常见且重要 的细胞分子信号传导途径。其信号途径为：Ras→Raf(MAPKKK) →MAPKK(MEK)→MAPK(ERK1/2)→进入细胞核→转录因子 →基因表达。RAS通路与炎症，肿瘤等密切相关。因此成为治疗炎 症，肿瘤的作用靶点。
目前针对Ras通路的多个环节开发出了多种抑制剂。但是目前 尚没有特异性针对ERK1/2的抑制剂，因而目前仅能通过抑制其上 游蛋白——如MEK蛋白等——来间接实现抑制ERK1/2活性的目的。 由于细胞信号转导最重要的特征之一是构成复杂的信号网络系统， 具有高度的非线性特点，因而细胞内不同信号通路间普遍存在着信 号对答(cross-talking)的现象，而Ras信号通路作为细胞内部最重 要的信号通路之一，ERK1/2的上游蛋白通常也是其他信号通路的传 导节点，所以对其上游蛋白进行抑制会对细胞内部的活动造成广泛 的影响，进而无法特异性地针对ERK1/2蛋白进行研究，这大大地 限制了ERK1/2蛋白的相关研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ERK1/2蛋白抑制多肽，所述多肽 可特异性地抑制ERK1/2的磷酸化，从而发挥ERK1/2抑制剂的功 能。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种ERK1/2蛋白抑制多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
果糖-1，6-二磷酸酶(Fructose-1，6-bisphosphatase1，FBP1) 是糖异生中的关键限速酶之一，在糖代谢中起重要作用。哺乳动物 存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1，6-二磷酸酶同工酶，分别由Fbp1 和Fbp2基因编码。
本申请中记载的ERK1/2蛋白抑制多肽为FBP1中的一部分序 列，该段序列在不同物种间高度保守，由27个氨基酸构成。
IQGAP1(IQmotifcontainingGTPaseactivatingproteins)是近 年来新发现的一个蛋白家族，其序列中含有类似于RasGAPs催化域 的广泛序列和位于N端的4个可与钙调蛋白相互作用的IQ模体， 在哺乳动物中有三个同源物IQGAP1～3。不同于IQGAP2和IQGAP3 限制性地表达于肝和肠道等器官，IQGAP1呈现出一种全身性地表 达。有研究表明，IQGAP1可通过其WW结构域调节ERK的磷酸 化(如图1所示)。发明人在实验中偶然发现FBP1能与ERK一样 结合IQGAP1的WW结构域，在进一步的研究中，发明人将FBP1 分成七段，发现只有第四段能与IQGAP1进而抑制ERK的磷酸化， 为了描述方便，发明人将这第四段多肽命名为FBPe4，其即为本申 请所述的ERK1/2蛋白抑制多肽。由于FBPe4具有上述特性，因而 可作为ERK1/2蛋白的竞争性抑制剂来使用。
FBPe4可以特异性抑制ERK1/2的活性，可更精确地用于 ERK1/2功能的相关研究与应用。并且它来源于生物体内固有的蛋白 质，相比人工合成的化合物抑制剂更加安全。
优选的，如上所述的ERK1/2蛋白抑制多肽，所述多肽的氨基 酸序列为SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经添加一个或几个氨基酸， 得到的编码相同活性蛋白质的氨基酸序列。
进一步优选的，所述多肽为FBP1蛋白的氨基酸序列。
本领域技术人员应可根据本发明公开ERK1/2蛋白抑制多肽序 列对其进行改造，将SEQIDNo:1所示的氨基酸序列经取代、缺失 和/或添加一个或几个氨基酸，得到的编码相同活性蛋白质的氨基酸 序列，如天然蛋白FBP1即为实例之一，通过过表达FBP1也可抑 制ERK1/2蛋白活性。
编码如上所述的ERK1/2蛋白抑制多肽的基因，所述基因的核 苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
编码如上所述的ERK1/2蛋白抑制多肽的基因，所述基因的核 苷酸序列为SEQIDNo:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加 一个或几个核苷酸，编码相同活性蛋白质的核苷酸序列，得到的编 码相同活性蛋白质的核苷酸序列。
应当理解，本领域人员可根据本发明公开的ERK1/2蛋白抑制 多肽的基因的核苷酸序列(SEQIDNO:2)，在保证其活性的前提下， 取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得到该基因的突变序列。
例如简并密码子直接的互相替换：
aaagatgctctgcaaccaggccggaacctggtggcagccggctacgcact gtatggcagtgccaccatgctggtccttgcc也能编码出SEQIDNo:1所示蛋白。
SEQIDNO:2所示的核苷酸序列是由81个核苷酸组成的基因。
此外，可将FBP1全长序列中缺失SEQIDNO:2所示的核苷酸 序列得到缺失突变体，所述缺失突变体可用于FBP1的功能研究或 者基于FBP1功能的相关疾病的研究，特别是在FBP1与IQGAP1 相互作用研究中的应用。
含有如上所述基因的重组质粒。
进一步优选的，所述重组质粒为将SEQIDNo:2所示的核苷酸 序列插入到pcDNA3.1/V5-His-TOPO中得到。
含有如上所述重组质粒的宿主细胞。
进一步优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌、PANC-1或MIA PaCa-2中的一种。
根据如上所述的重组质粒在PANC-1细胞中表达制备ERK1/2 蛋白抑制多肽的方法，包括以下步骤：
将核苷酸序列为SEQIDNo:2的基因片段定向克隆到 pcDNA3.1/V5-His-TOPO表达载体中，将得到的重组表达质粒转染 PANC-1细胞并培养，表达重组蛋白；将表达后的蛋白经初步分离、 纯化后制得重组蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本申请首次提供了一种ERK1/2蛋白特异性的竞争性抑制 剂。
2)、ERK1/2蛋白抑制多肽仅有21个氨基酸，无论是人工合成 该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行，利于大规模推 广利用。
3)、ERK1/2蛋白抑制多肽来源于生物体内固有的蛋白质，用 于动物实验不会造成免疫排除，通常大多数抑制剂均为人工合成的 化合物，相比之下本申请提供的蛋白多肽对细胞毒性更小，也更为 特异。
4)、由于为生物体内固有的蛋白质，还可通过慢病毒等手段将 编码该多肽的基因片段转染至细胞内进行稳定表达，操作方便，更 利于在体研究；更一步的，也可将包含该基因片段的病毒注射入实 验动物体内，并结合动物行为学等实验手段，在整体水平上对 ERK1/2及其所在信号通路进行更深入的研究，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以 下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为FBPe4抑制ERK1/2的原理示意图：正常情况下， IQGAP1可通过其WW结构域协助MEK进行ERK1/2的磷酸化(图 左部分)；在FBPe4存在时，会竞争性地与WW结构域结合进而抑 制ERK1/2的磷酸化；
图2～4为本申请实施例1中FBPe4与IQGAP1的相互作用验证 及初步功能验证；
图2为寻找IQGAP1与FBP1相结合的蛋白区段的GST试验 pulldown实验；A为IQGAP1结构域及IQGAP1的6段含有GST 标签的截断体的示意图；B为GSTpulldown实验验证IQGAP1WW 结构域可以与FBP1互相结合(IP：GST，IB：FBP1)；
图3为寻找FBP1与IQGAP1相结合的蛋白区段的GST试验 pulldown实验；A为FBP1结构域及FBP1的7段含有GST标签的 截断体的示意图；B为GSTpulldown实验验证FBP1的e4结构域 可以与IQGAP1互相结合(IP：GST，IB：IQGAP1)；
图4为FBPe4的初步功能验证；A为RNA干扰实验验证FBP1 特异性地干扰ERK2与IQGAP1的结合(shNT：乱序小干扰RNA， IP：IQGAP1)；B为FBP1e4段蛋白在不同物种中的氨基酸序列；C 为免疫共沉淀实验验证FBPe4可特异性地干扰ERK2与IQGAP1的 互相结合；
图5为本申请实施例3中FBPe4的功能验证；A为FBP1G260R 及FBP1ΔFBPe4突变蛋白的结构示意图；B为免疫共沉淀实验验证 FBPe4特异性地抑制ERK1/2的磷酸化(IP：Flag)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件 或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1含有FBPe4与IQGAP1的相互作用验证及初步功能 验证
S11、主要实验材料：
1)、细胞
本试验选择胰腺癌细胞系PANC-1。胰腺癌细胞系为K-ras突变 型细胞系，能在正常情况下检测到pERK1/2，因此能观察到经过 FBPe4处理后，pERK1/2的变化情况，便于观察实验效果。
PANC-1购自ATCC(AmericanTypeCultureCollection， Manassay，VA，USA)公司。PANC-1细胞使用DMEM培养基 (CORNING，Manassa，VA，USA)，含10％胎牛血清(Life Technologies)、100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Life Technologies)。细胞培养箱中培养，培养条件为5％CO2，37℃，95％ 湿度。
2)、质粒
Flag-FBP1，FBPe4和FBPΔE4装入pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen,460083)载体，该载体含有Flag标签。GST-FBP1， IQGAP1突变体装入pGEX-4T-1载体。
3)、抗体
FBP1(Abcam，ab109732，稀释浓度1:1000)；
ERK2(SantaCruzBiotechnology，SC-1647，稀释浓度1:5000)；
FLAGM2(Sigma-Aldrich，F-3165，稀释浓度1:3000)；
IQGAP1(SantaCruzBiotechnology，H-109，稀释浓度1:5000)。
4)、shRNA序列购自Sigma-Aldrich(St.Lois，MO)公司：
5′-CCGGCCTTGATGGATCTTCCAACATCTCGAGATGTTGG AAGATCCATCAAGGTTTTTG-3′(shFBP1)
S21、IQGAP1蛋白的结构域如图2A所示，根据IQGAP1结构 域，将IQGAP1分成6段，并合成从P1到P6的6段含有GST标 签的截断体。
利用GSTpulldown实验，将IQGAP1的6段GST截断体与 FBP1蛋白共同孵育。
GSTpulldown实验步骤：PANC-1细胞使用细胞裂解缓冲液 (20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，0.1％NonidetP40，1mM DTT(dithiothreitol)，10％glycerol，1mMEDTA，2.5mMMgCl2及1μg/mlleupeptin)4℃裂解30分钟。GST融合蛋白结合到GST珠 子上(GEHealthcareLifescience)。细胞裂解产物与GST珠子4℃共 同敷育4h。珠子用细胞裂解缓冲液清洗5次，每次清洗后，离心， 去除上清。加入RIPA缓冲液与loadingbuffer(NOREX)，DTT的 混合液60μL，100℃煮5分钟。然后利用10％SDS-polyacrylamide 胶电泳后分离蛋白，然后转入硝化纤维膜，与1抗4℃共同敷育过夜。 次日用1×TBST清洗后，与二抗室温敷育1小时。蛋白随后用化学 发法检测。
WesternBlotting法检测结果(图2B)显示P3段即IQGAP1WW 结构域可以与FBP1互相结合。
S22、对FBP1蛋白结构域进行分析(图3A)并设计7段含有 GST标签的截断体。同样利用GSTpulldown实验，将FBP1的7 段GST截断体与IQGAP1蛋白共同孵育。
WesternBlotting法检测结果(图3B)显示e4段结构域可以与 IQGAP1互相结合。
S23、利用RNA干扰技术敲除FBP1。使用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)转染进PANC-1细胞，48小时后收样并提取蛋 白，使用IQGAP抗体做作免疫共沉淀及WesternBlotting检测。
免疫共沉淀：回收细胞，使用细胞裂解缓冲液(50mMTris-HCl， pH7.5，150mMNaCl，1％NonidetP-40，0.5％sodiumdeoxycholate 和1％proteaseinhibitorcocktails，Sigma-Aldrich)裂解细胞。细胞 裂解产物离心，取上清，与protein-G珠子(LifeTechnologies)4℃ 共同敷育过夜。次日，珠子用细胞裂解缓冲液清洗5次，每次清洗 后，离心，去除上清。加入RIPA缓冲液与LoadingBuffer(NOREX)， DTT的混合液60μL，100℃煮5分钟
WesternBlotting：细胞回收后，使用RIPA缓冲液[1×PBS， 1％NonidetP-40，0.1％sodiumdodecylsulfateandproteaseinhibitor cocktail(Sigma-Aldrich，St.Lous，MO)]裂解细胞。使用BCAassay (ThermoFisherScientific)检测裂解后得到蛋白的蛋白浓度。然后 加入LoadingBuffer(NOREX)，DTT混合后100℃煮5分钟。将上 述煮后的样品，利用10％SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离蛋白后， 然后转入硝化纤维膜，与1抗4℃共同敷育过夜。次日用1×TBST 清洗后，与二抗室温敷育1小时。蛋白随后用化学发法检测。
WesternBlotting结果显示，未敲除FBP1时，ERK2与IQGAP1 结合较弱(图4A第2泳道IP，IB：ERK2)，而敲除FBP1后，ERK2 与IQGAP1结合增强(图4A第3泳道IP，IB：ERK2)；但敲除FBP1 与否并不影响ERK2上游的C-Raf、MEK2与IQGAP1的结合(图 4A第2、3泳道IP，IB：C-Raf、IB：MEK2)，因此可说明FBP1 特异性地干扰ERK2与IQGAP1的结合。进一步的，本申请比对了 不同物种中e4段蛋白的氨基酸序列，发现其序列高度保守(图4B)。
S24、利用氨基酸的保守序列，合成含有FBPe4的重组质粒 pcDNA3.1/V5-His-TOPO-FBPe4(见实施例2)，利用该重组质粒表 达不含这段氨基酸序列的FBP1ΔFBPe4质粒：
FBP1ΔFBPe4(缺失E4段质粒)构建的引物：
上游引物：5’-GCCATCGGGGAGTTCATTTTGGT-3’；
下游引物：5’-CGGTAGCCCCTCAAGTAAAACCAC-3’。
将FBP1ΔFBPe4质粒转入细胞，使用IQGAP抗体做作免疫共 沉淀，结果显示，FBPe4蛋白能干扰ERK2结合，但是FBP1ΔFBPe4 不能干扰结合(图4C)，这进一步验证了本申请提供的ERK1/2蛋 白抑制多肽FBPe4可抑制ERK与IQGAP1的结合。
实施例2含有FBPe4的重组质粒的构建及FBPe4的表达
根据SEQIDNo:2所示的碱基序列，将这段序列克隆到表达载 体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(含Fag标签，可用Flag抗体检测)。
S21、PCR扩增目标DNA，电泳回收目标DNA
利用FBP1质粒(序列如SEQIDNo:3所示)为模板扩增得到 FBPe4的基因序列(即SEQIDNo:2)，PCR扩增反应体系为：
其中，FBPe4上游引物为：
5-CGGATATCAAGGATGCTCTGCAACCAGGCCGG-3’；
FBPe4下游引物：
5’-CGCTCGAGGGCAAGGACCAGCATGGTGGCACT-3’。
PCR反应程序为：
完成后将扩增产物进行琼脂糖电泳，切取100bp左右的目标条 带，利用胶回收试剂盒回收DNA。
S22、选择酶切位点EcoRV和Xhol进行对目标条带和表达载 体pcDNA3.1/V5-His-TOPO进行双酶切
酶切体系为：
37℃水浴过夜。
其中，EcoRV和Xhol的酶切位点为：
EcoRV(GATATC)；
Xhol(CTCGAG)。
S23、连接
酶切产物琼脂糖电泳，利用胶回收试剂盒回收DNA。
连接体系：
16℃连接过夜。
连接后得到pcDNA3.1/V5-His-TOPO-FBPe4重组质粒。
S24、Top10感受态细菌转化
-80℃取出Top10感受态细菌，置于冰上，加入连接产物(10μL)。 冰上放置30分钟，42℃孵育90秒，冰上放置10分钟，加入LB培 养基200μL。37℃摇床，180转/min，一小时后细菌涂氨苄西林LB 板。24小时后挑取单克隆，扩增后质粒回收试剂盒回收质粒。按S22 的酶切体系，酶切后琼脂糖电泳鉴定，选取阳性克隆(电泳可见 100bp条带)测序。
S25、细胞内表达
将已克隆的FBPe4质粒lipo2000转染PANC-1细胞，Western Blotting鉴定蛋白表达。将表达后的蛋白经初步分离、纯化后制得 重组蛋白。
实施例3FBPe4抑制ERK1/2的磷酸化
S31、利用pcDNA3.1/V5-His-TOPO-FBPe4重组质粒构建 FBP1G260R质粒。
FBP1G260R(第260位甘氨酸换为精氨酸)构建的引物：
上游引物：
5’-CATCGCACTCTGGTCTACAGAGGGATATTTCTGTAC-3’
下游引物：
5’-AACATCAGCCACCATGGAGCCCACATACCGGGCCC-3’
FBP1G260R失去了合成糖原的酶活性。
FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4突变蛋白的结构如图3A所示。
S32、将FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4质粒转入PANC-1细胞并 表达，收取细胞裂解液并用Flag抗体做免疫共沉淀实验 (FBP1G260R及FBP1ΔFBPe4质粒表达的重组蛋白均带有Flag标 签)。
实验结果显示，FBP1，FBP1G260R，FBPe4均能抑制ERK1/2 的磷酸化，但FBP1ΔFBPe4不能抑制，这说明FBPe4多肽片段具有 抑制ERK1/2的磷酸化的作用，且该作用的实现与FBP1的合成糖 原的酶活性无关。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到， 在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和 修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的 所有这些变化和修改。