《一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103667302 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667302 A (21)申请号 201310534813.4 (22)申请日 2013.11.04 C12N 15/12(2006.01) C07K 14/825(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 内蒙古科技大学 地址 014010 内蒙古自治区包头市昆区阿尔 丁大街 7 号 (72)发明人 杜志强 李新苍 任乾 (74)专利代理机构 包头市专利事务所 15101 代理人 庄英菊 (54) 发明名称 一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、 其编 码。
2、的氨基酸序列以及克隆方法 (57) 摘要 本发明涉及一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT、 其编码的氨基酸序列以及克隆方法。通过 模板制备、 引物设计、 PCR 扩增、 公司测序等过程， 获得了该基因的完整 cDNA 序列， 其核苷酸序列具 有 177bp， 编码的氨基酸序列具有 58 个氨基酸残 基。研究淡水小龙虾的金属硫蛋白基因有助于进 一步了解无脊椎动物对抗重金属离子胁迫的机 制， 以及解决目前水体环境重金属污染带来的养 殖问题。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10。
3、)申请公布号 CN 103667302 A CN 103667302 A 1/1 页 2 1.一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT， 其特征在于， 其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 2.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT， 其特征在于， 淡水小 龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码的蛋白质对应的氨基酸序列为 SEQ ID NO.2。 3.一种权利要求1所述的淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 选用淡水小龙虾作为实验材料， 利用动物总 RNA 提取试剂盒提取各组织总 RNA， 获 得淡水小龙虾各个组织的总 RNA。
4、 样品 ； （2） 以步骤 （1） 获得的总 RNA 样品作为模板， 利用一步法 RT-PCR 扩增试剂盒进行 cDNA 的反转录合成， 获得淡水小龙虾各个组织的 cDNA 样品 ； （3）设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码区的前后引物 Pc-MT-F 和 Pc-MT-R ： Pc-MT-F ： 5 -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3 Pc-MT-R ： 5 -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3 以步骤 （2） 中的淡水小龙虾各个组织的 cDNA 样品作为模板， 进行 PCR 扩增反应， 反应 的程序为 ： 94。
5、预变性3min， 94变性30s， 53退火30s， 72延伸30s， 循环35圈， 后延伸 5min， 获得 PCR 反应产物 ； （4） 将步骤 （3） 获得的 PCR 反应产物进行回收、 纯化， 之后进行 EcoR 核酸内切酶和 Xho 核酸内切酶的双酶切处理， 并且与经过 EcoR 核酸内切酶和 Xho 核酸内切酶双 酶切处理的 pET-28a 大肠杆菌质粒载体连接， 转化大肠杆菌 DH5 克隆菌株感受态细胞之 后， 进行菌落 PCR 筛选， 将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定， 获得淡水小龙 虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 基因序列。 （5）将步骤 （4）获得的基因序列， 利。
6、用分子生物学 Expasy 在线软件 （http:/ au.expasy.org） 进行氨基酸序列的翻译， 获得对应蛋白质的氨基酸序列。 权 利 要 求 书 CN 103667302 A 2 1/5 页 3 一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT、 其编码的氨基酸 序列以及克隆方法 技术领域 0001 本发明涉及一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT、 其编码的氨基酸序列以及克 隆方法， 属于分子生物学技术领域。 背景技术 0002 无脊椎动物的免疫系统与脊椎动物的获得性免疫系统不同， 被称为先天免疫系 统。因此， 无脊椎动物防御病原微生物入侵的免疫系统， 都是源于自身遗传继承的固定的 免。
7、疫模式， 主要包括物理屏障、 细胞免疫和体液免疫。当病原微生物入侵的时候， 无脊椎动 物首先是通过自己的体表以及消化道来进行物理防御， 通过一个天然的物理屏障来阻挡病 原微生物的侵染， 但是， 当特异的病原微生物通过这层物理屏障之后， 进入到宿主体内的时 候， 就会激发宿主自身的细胞免疫与体液免疫作用， 而且， 这两种免疫形式几乎是同时发挥 功能的。 如果入侵的病原微生物体积较小， 那么， 宿主会通过细胞免疫中的吞噬作用来将其 吞噬， 从而达到清除的目的。 当入侵的病原微生物体积较小， 但是， 数目较多的情况下， 宿主 就会通过细胞免疫中结节的形成以及包囊作用， 将其大规模清除。当入侵的病原微。
8、生物体 积较大的时候， 宿主就会启动体液免疫相关的黑化作用， 将其固定并且瓦解， 从而达到清除 的目的。此外， 体液免疫还包括宿主细胞表面存在的模式受体介导的信号传导途径关联的 抗菌肽的产生。 通过物理屏障、 细胞免疫和体液免疫三种形式的免疫作用， 无脊椎动物防范 着病原微生物的入侵。 0003 除了病原微生物的侵染是无脊椎动物生存环境中需要面对的强大危险源之外， 水 产类的无脊椎动物 （以十足目中的甲壳类动物为例） 生存环境中的重金属离子也是一个较 为危险的刺激源。 重金属离子对于甲壳类动物的胁迫作用主要是通过重金属离子在宿主体 内的多个器官的积累， 造成器官功能的丧失， 从而使宿主死亡。同。
9、样， 在这样的环境中生存 的甲壳类动物体内也存在着一些可以对抗这样的刺激的基因与蛋白质， 研究表明金属硫蛋 白基因就是小龙虾体内存在的一个可以对抗重金属胁迫的免疫基因。 金属硫蛋白基因是一 类结构较为保守的基因， 广泛存在于低等的无脊椎动物体内， 其表达的产物是金属硫蛋白 分子， 这一类蛋白质的显著特点就是分子中富含半胱氨酸残基， 这样就造成了对于金属离 子具有较为强烈的亲和性， 因此， 金属硫蛋白分子的作用就是可以结合宿主体内的金属与 重金属离子， 从而达到清除金属与重金属离子的作用。目前， 相关的体外试验研究结果显 示， 金属硫蛋白具有抗辐射、 抗衰老、 抗重金属中毒、 清除自由基、 提高。
10、机体的免疫能力、 提 高机体的应急能力、 调节机体微量元素平衡的作用。 0004 淡水小龙虾是我国主要的水产养殖品种之一， 随着工业现代化发展的加快， 出现 了水体 环境被频繁污染的情况， 淡水小龙虾体内积累超量的金属离子甚至重金属离子， 一 方面会造成淡水小龙虾养殖业在经济方面的损失， 另一方面会给相关消费者带了身体健康 方面的隐患。因此， 研究淡水小龙虾的金属硫蛋白基因有助于进一步了解无脊椎动物对抗 重金属离子胁迫的机制， 以及解决目前水体环境重金属污染带来的养殖问题。 说 明 书 CN 103667302 A 3 2/5 页 4 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种淡水小龙虾金属。
11、硫蛋白基因 Pc-MT 的核苷酸序列， 其 核苷酸序列为 SEQ ID NO.1， 具有 177bp。 0006 本发明的另一个目的在于提供一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码的氨 基酸序列， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.2， 具有 58 个氨基酸残基。 0007 同时， 本发明还提供该淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 的克隆方法。 0008 本发明所提供的金属硫蛋白基因 Pc-MT 来源于淡水小龙虾 （Procambarus clarkii） ， 命名为 Pc-MT 基因， 其核苷酸序列为 SEQ ID NO.1， 具有 177bp。 0009 上述金属硫蛋白基因 Pc。
12、-MT 编码的蛋白质来源于淡水小龙虾 （Procambarus clarkii） ， 命名为 Pc-MT 蛋白质， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.2， 具有 58 个氨基酸残基。 0010 上述淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 的克隆方法， 包括如下步骤 ： 0011 （1）选用淡水小龙虾作为实验材料， 利用动物总 RNA 提取试剂盒提取各组织总 RNA， 获得淡水小龙虾各个组织的总 RNA 样品 ； 0012 （2） 以步骤 （1） 获得的总 RNA 样品作为模板， 利用一步法 RT-PCR 扩增试剂盒进行 cDNA 的反转录合成， 获得淡水小龙虾各个组织的 cDNA 样品 ； 0。
13、013 （3） 设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码区的前后引物 Pc-MT-F 和 Pc-MT-R ： 0014 Pc-MT-F ： 5 -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3 0015 Pc-MT-R ： 5 -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3 0016 以步骤 （2） 中的淡水小龙虾各个组织的 cDNA 样品作为模板， 进行 PCR 扩增反应， 反应的程序为 ： 94预变性3min， 94变性30s， 53退火30s， 72延伸30s， 循环35圈， 后 延伸 5min， 获得 PCR 反应产物 ； 0017 。
14、（4） 将步骤 （3） 获得的 PCR 反应产物进行回收、 纯化， 之后进行 EcoR 和 Xho 核酸内切酶双酶切， 并且与经过 EcoR 和 Xho 核酸内切酶双酶切处理的 pET-28a 载体 连接， 转化大肠杆菌 DH5 克隆菌株感受态细胞之后， 进行菌落 PCR 筛选， 将筛选得到的阳 性克隆子送测序公司进行序列测定， 获得淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 的基因序列。 0018 （5）将步骤 （4）获得的基因序列， 利用分子生物学 Expasy 在线软件 （http:/ au.expasy.org） 进行氨基酸序列的翻译， 获得对应蛋白质的氨基酸序列。 0019 本发明的优点 。
15、： 0020 本发明涉及一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT、 其编码的氨基酸序列以及克 隆方法。 该基因在淡水小龙虾体内过量表达可以提高淡水小龙虾先天免疫系统中金属硫蛋 白的表达量， 从而可以提高淡水小龙虾对抗生存的水体环境中重金属离子的能力， 提高繁 殖与生存能力。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述 0022 实施例 1 淡水小龙虾肝胰腺组织中金属硫蛋白基因 Pc-MT 的克隆 0023 （1） 选用淡水小龙虾肝胰腺组织作为实验材料， 利用上海生工生物工程有限公司 说 明 书 CN 103667302 A 4 3/5 页 5 提供的 Total RN。
16、A Extractor（Trizol） 动物总 RNA 快速抽提试剂盒进行总 RNA 的提取， 获 得淡水小龙虾肝胰腺组织的总 RNA 样品 ； 0024 （2） 以步骤 （1） 获得的淡水小龙虾肝胰腺组织的总 RNA 样品作为模板， 利用上海生 工生物工程有限公司提供的一步法 RT-PCR 扩增试剂盒进行 cDNA 的反转录合成， 获得淡水 小龙虾肝胰腺组织的 cDNA 样品 ； 0025 （3） 设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码区的前后引物 Pc-MT-F 和 Pc-MT-R ： 0026 Pc-MT-F ： 5 -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTT。
17、GTA-3 0027 Pc-MT-R ： 5 -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3 0028 以步骤 （2） 中的淡水小龙虾肝胰腺组织的cDNA样品作为模板， 进行PCR扩增反应， 反应的程序为 ： 94预变性3min， 94变性30s， 53退火30s， 72延伸30s， 循环35圈， 后 延伸 5min， 获得 PCR 反应产物 ； 0029 （4） 将步骤 （3） 获得的 PCR 反应产物进行回收、 纯化， 之后进行 EcoR 和 Xho 核酸内切酶双酶切， 并且与经过 EcoR 和 Xho 核酸内切酶双酶切处理的 pET-28a 载体 连接， 转化大肠杆。
18、菌 DH5 克隆菌株感受态细胞之后， 进行菌落 PCR 筛选， 将筛选得到的阳 性克隆子送测序公司进行序列测定， 获得淡水小龙虾肝胰腺组织中金属硫蛋白基因 Pc-MT 的基因序列。 0030 （5）将步骤 （4）获得的基因序列， 利用分子生物学 Expasy 在线软件 （http:/ au.expasy.org） 进行氨基酸序列的翻译， 获得对应蛋白质的氨基酸序列。 0031 实施例 2 淡水小龙虾血淋巴组织中金属硫蛋白基因 Pc-MT 的克隆 0032 （1） 选用淡水小龙虾作为实验材料， 利用淡水小龙虾血淋巴抗凝剂作为佐剂， 使用 医用 注射器从淡水小龙虾腹节中部抽取血淋巴组织液， 利用上。
19、海生工生物工程有限公司 提供的 Total RNA Extractor（Trizol） 动物总 RNA 快速抽提试剂盒进行总 RNA 的提取， 获 得淡水小龙虾血淋巴组织的总 RNA 样品 ； 0033 （2） 以步骤 （1） 获得的淡水小龙虾血淋巴组织的总 RNA 样品作为模板， 利用上海生 工生物工程有限公司提供的一步法 RT-PCR 扩增试剂盒进行 cDNA 的反转录合成， 获得淡水 小龙虾血淋巴组织的 cDNA 样品 ； 0034 （3） 设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码区的前后引物 Pc-MT-F 和 Pc-MT-R ： 0035 Pc-MT-F ： 5 -TACT。
20、CAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3 0036 Pc-MT-R ： 5 -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3 0037 以步骤 （2） 中的淡水小龙虾血淋巴组织的cDNA样品作为模板， 进行PCR扩增反应， 反应的程序为 ： 94预变性3min， 94变性30s， 53退火30s， 72延伸30s， 循环35圈， 后 延伸 5min， 获得 PCR 反应产物 ； 0038 （4） 将步骤 （3） 获得的 PCR 反应产物进行回收、 纯化， 之后进行 EcoR 核酸内切酶 和 Xho 核酸内切酶的双酶切处理， 并且与经过 EcoR 核酸内切酶。
21、和 Xho 核酸内切酶 双酶切处理的pET-28a载体连接， 转化大肠杆菌DH5克隆菌株感受态细胞之后， 进行菌落 PCR 筛选， 将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定， 获得淡水小龙虾血淋巴组织 中金属硫蛋白基因 Pc-MT 的基因序列。 说 明 书 CN 103667302 A 5 4/5 页 6 0039 （5）将步骤 （4）获得的基因序列， 利用分子生物学 Expasy 在线软件 （http:/ au.expasy.org） 进行氨基酸序列的翻译， 获得对应蛋白质的氨基酸序列。 0040 实施例 3 淡水小龙虾腮组织中金属硫蛋白基因 Pc-MT 的克隆 0041 （1） 选用淡。
22、水小龙虾腮组织作为实验材料， 利用上海生工生物工程有限公司提供 的 Total RNA Extractor（Trizol） 动物总 RNA 快速抽提试剂盒进行总 RNA 的提取， 获得淡 水小龙虾腮组织的总 RNA 样品 ； 0042 （2） 以步骤 （1） 获得的淡水小龙虾腮组织的总 RNA 样品作为模板， 利用上海生工生 物工程有限公司提供的一步法 RT-PCR 扩增试剂盒进行 cDNA 的反转录合成， 获得淡水小龙 虾腮组织的 cDNA 样品 ； 0043 （3） 设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT 编码区的前后引物 Pc-MT-F 和 Pc-MT-R ： 0044 Pc-MT。
23、-F ： 5 -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3 0045 Pc-MT-R ： 5 -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3 0046 以步骤 （2） 中的淡水小龙虾腮组织的 cDNA 样品作为模板， 进行 PCR 扩增反应， 反 应的程序为 ： 94预变性3min， 94变性30s， 53退火30s， 72延伸30s， 循环35圈， 后延 伸 5min， 获得 PCR 反应产物 ； 0047 （4） 将步骤 （3） 获得的 PCR 反应产物进行回收、 纯化， 之后进行 EcoR 核酸内切酶 和 Xho 核酸内切酶的双酶切处理， 并。
24、且与经过 EcoR 核酸内切酶和 Xho 核酸内切酶 双酶切处理的pET-28a载体连接， 转化大肠杆菌DH5克隆菌株感受态细胞之后， 进行菌落 PCR 筛选， 将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定， 获得淡水小龙虾腮组织中金 属硫蛋白基因 Pc-MT 的基因序列。 0048 （5）将步骤 （4）获得的基因序列， 利用分子生物学 Expasy 在线软件 （http:/ au.expasy.org） 进行氨基酸序列的翻译， 获得对应蛋白质的氨基酸序列。 0049 序列表 0050 SEQ ID NO.1 0051 内蒙古科技大学 0052 一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因 Pc-MT、 其编。
25、码的氨基酸序列以及克隆方法 0053 2013-10-22 0054 2 0055 1 0056 177 0057 cDNA 0058 淡水小龙虾 0059 淡水小龙虾金属硫蛋白基因 0060 (1)(177) 0061 atgccgggtccctgttgtaaagacaagtgcgagtgtgccgagggcgggtgcaagactggc 60 0062 tgtgtgtgcacctcatgccgctgtgcacgctgcgacaagtgtacgtcgcggtgcaagtgt 120 0063 ccatccagggaggagtgtgccgagacctgctccaagccctgcaagtgctgtccctag 177 0064 SEQ ID NO.2 说 明 书 CN 103667302 A 6 5/5 页 7 0065 2 0066 58 0067 PRT 0068 淡水小龙虾金属硫蛋白 0069 (1)(58) 0070 MPGPCCKDVCECAEGGCKTQCVCTSCRCAP 0071 151015202530 0072 CDKCTSGCKCPSKEECAKTCSKPCRCCP 0073 31354045505558 。 说 明 书 CN 103667302 A 7 。