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1、(10)授权公告号 CN 101497675 B (45)授权公告日 2011.05.18 CN 101497675 B *CN101497675B* (21)申请号 200910044914.7 (22)申请日 2009.01.06 C08F 220/06(2006.01) C08F 220/12(2006.01) C08F 220/56(2006.01) C08F 220/34(2006.01) C08F 265/00(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (73)专利权人 华东理工大学 地址 200237 上海市梅陇路 130 号 (72)发明人 曹学君 王海霞 (74。
2、)专利代理机构 上海智信专利代理有限公司 31002 代理人 王洁 CN 1900128 A,2007.01.24, 实施例 1. CN 1693325 A,2005.11.09, 实施例 1. 李志菊等.具有温度和pH敏感性微凝胶的制 备与表征 .合成橡胶工业 .2008, 第 31 卷 ( 第 1 期 ),46-49. (54) 发明名称 一种 pH 敏感溶解可逆聚合物、 其制备方法及 用途 (57) 摘要 本发明涉及一种 pH 敏感溶解可逆聚合物， 粘 均分子量为 60000 70000， 由式 (1)、 式 (2)、 式 (3)和式(4)所示单体化合物经无规共聚而得到， 质量比为 9 。
3、4 5 1， R1、 R2、 R3、 R4、 R5分别选自 H或C1C6的烷基 ； R6、 R7分别选自H或C1C6的 羟烷基， 还提供了上述 pH 敏感溶解可逆聚合物的 制备方法， 及形成的聚合物 - 配基复合物， 本发明 的pH敏感溶解可逆聚合物对pH敏感可逆溶解， 通 过连接特异性亲和配基， 能够用于大分子亲和沉 淀， 聚合物可以高效回收， 大大降低了使用成本， 且回收简便， 并可以保持生物质活性与稳定性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李小童 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 6 页 CN 101497675 B1/。
4、2 页 2 1. 一种 pH 敏感溶解可逆聚合物， 其特征在于， 所述 pH 敏感溶解可逆聚合物的粘均分 子量为6000070000， 由式(1)所示单体化合物、 式(2)所示单体化合物、 式(3)所示单体 化合物和式(4)所示单体化合物经无规共聚而得到， 其中所述式(1)所示单体化合物、 所述 式 (2) 所示单体化合物、 所述式 (3) 所示单体化合物和所述式 (4) 所示单体化合物的质量 比为 8 9 4 5 8 1， 其中， R1、 R2、 R4、 R5分别选自 H 或 C1 C6的烷基 ； R3选自 C1-C6烷基 ； R6、 R7分别选自 H 或 C1 C6的羟烷基。 2. 根据权。
5、利要求 1 所述的 pH 敏感溶解可逆聚合物， 其特征在于， 所述 R1、 所述 R2、 所述 R4、 所述 R5分别选自 H 或 C1 C3的烷基 ； 所述 R3选自 C1 C3的烷基 ； 所述 R6、 所述 R7分别 选自 H 或 C1 C3的羟烷基。 3. 根据权利要求 2 所述的 pH 敏感溶解可逆聚合物， 其特征在于， 所述 R1、 所述 R2、 所述 R3、 所述 R4、 所述 R5为甲基 ； 所述 R6为 H ； 所述 R7为羟甲基。 4. 根据权利要求 1 所述的 pH 敏感溶解可逆聚合物， 其特征在于， 所述式 (1) 所示单体 化合物、 所述式 (2) 所示单体化合物、 所。
6、述式 (3) 所示单体化合物和所述式 (4) 所示单体化 合物的质量比为 8 4 8 1 或 9 4 5 1。 5. 一种制备权利要求 1 所述的 pH 敏感溶解可逆聚合物的方法， 其特征在于， 将所述式 (1) 所示单体化合物、 所述式 (2) 所示单体化合物、 所述式 (3) 所示单体化合物和所述式 (4) 所示单体化合物按质量比为 8 9 4 5 8 1 加入无水乙醇中， 以偶氮二异丁腈 为引发剂， 在惰性气体存在下， 于5080进行聚合反应得到所述pH敏感溶解可逆聚合 物。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 还包括步骤 ： 分别用无水乙醇和丙酮洗涤 权 利 要 求 书。
7、 CN 101497675 B2/2 页 3 所述pH敏感溶解可逆聚合物， 然后真空干燥， 干燥后用pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解， 调节等 电点沉淀， 干燥， 得到所述 pH 敏感溶解可逆聚合物的纯品。 7. 一种聚合物 - 配基复合物， 其特征在于， 由权利要求 1 4 任一所述的或权利要求 56任一所述的方法制备的pH敏感溶解可逆聚合物经环氧氯丙烷活化后与对氨基苯甲脒 共价结合而成， 或者由权利要求 1 4 任一所述的或权利要求 5 6 任一所述的方法制备 的 pH 敏感溶解可逆聚合物与 Cibacron Blue F3GA 直接共价结合而成。 8. 根据权利要求 7 所述的聚合物 - 配。
8、基复合物， 其特征在于， 在 40， 氢氧化钠水溶液 中， 加入所述环氧氯丙烷和所述 pH 敏感溶解可逆聚合物反应使所述 pH 敏感溶解可逆聚合 物上的羟基活化， 活化后用氢氧化钠调节pH至11， 加入所述对氨基苯甲脒， 于80， 反应完 全， 得到所述配基 - 聚合物复合物。 9. 根据权利要求 7 所述的聚合物 - 配基复合物， 其特征在于， 将所述 pH 敏感溶解可逆 聚合物溶于水中， 加入所述Cibacron Blue F3GA， 置于40水浴摇床， 加入氯化钠， 1小时后 加入碳酸钠， 振荡反应完全， 得到所述配基 - 聚合物复合物。 10. 权利要求 7 9 任一所述的聚合物 - 。
9、配基复合物在亲和沉淀分离生物大分子中的 应用。 权 利 要 求 书 CN 101497675 B1/6 页 4 一种 pH 敏感溶解可逆聚合物、 其制备方法及用途 技术领域 0001 本发明涉及溶解可逆聚合物技术领域， 更具体地， 涉及 pH 敏感溶解可逆聚合物技 术领域， 特别是指一种 pH 敏感溶解可逆聚合物、 其制备方法及用途。 背景技术 0002 当环境参数如 pH、 温度、 离子强度和盐度等发生改变， 或存在特定离子、 有机溶剂 以及带相反电荷的聚电解质时， 许多大分子聚合物的溶解状态会发生可逆性的改变， 这些 物质就称之为可逆溶解聚合物。亲和沉淀是在可逆溶解聚合物上连接配基， 以专。
10、一性地吸 附目标蛋白， 吸附完成后， 改变条件 (pH 值、 温度、 离子强度或加入某种试剂 )， 使该聚合物 沉淀， 与水溶液分离。然后再改变操作条件使目标蛋白从聚合物 - 配基复合物上洗脱下来， 复合物重新溶解循环使用。由于亲和沉淀作用中， 目标分子与配基的亲和作用是在水溶性 状态下进行， 传质阻力小， 吸附速度快， 因此适合在分离过程的初期使用， 有利于减少分离 步骤， 提高产率， 降低成本。然而一般能用于亲和沉淀的可逆溶解聚合物数量很少， 且存在 着难以回收再利用的问题， 增加了分离成本， 从而影响了亲和沉淀技术的应用。因此， 解决 载体循环使用问题成为研究热点。 0003 亲和沉淀的。
11、研究中， 现在主要是采用亲和配基 - 可逆溶解聚合物作为蛋白质的亲 和沉淀剂。Seusted 和 Mattiasson 在 1989 年直接用脱乙酰几丁质分离纯化小麦凝集素的 基础上将大豆胰酶抑制剂连接到脱乙酰几丁质上， 并用来从粗酶制剂中分离纯化了胰蛋白 酶(ChemicalEngineering Science， 56(2001)5681-5692)。 在这之后， 又有一些聚合物被用 于蛋白质的亲和沉淀。最近 Guoqiang 等人对 Eudragit S 和 Eudragit L(Eudragit S 的成 份同Eudragit L相同， 但它们所含的异丁烯酸与异丁烯酸甲酯的比例不同)进。
12、行了化学修 饰， 分别连接上了一种芳香族染料 (Cibacron blue 3GA)， 并用其分离纯化了肌肉乳酸脱氢 酶和酵母醇脱氢酶(Bioseperation， 7(1999)195-205)。 大豆胰蛋白酶抑制剂(ST1)与部分 水解的聚 (N- 乙烯己内酰胺 ) 共价结合成为亲和沉淀胰蛋白酶的异双功能试剂， ST1 聚合 物与胰蛋白酶结合， 升高温度即形成沉淀。 离心， 沉淀物于室温溶解， 调pH至2.5， 进行第二 次沉淀、 离心， 胰蛋白酶存在于上清液中， 而 ST1 聚合物则沉淀， 酶收率为 77， 而聚合物的 回收率为 82 (Biotechnol Techn， 6(1992)。
13、353)。 0004 溶解可逆聚合物的应用及其研究尽管已取得了许多成就， 但此项技术还没有得到 广泛重视。可逆溶解聚合物的回收条件必须与有利于生物分子稳定性及活性的保持， 且需 价格低廉， 易于得到。另外， 回收聚合物还存在回收率不高导致其循环使用的次数大大降 低。因此， 研发用于亲和沉淀生物分子、 既能保持生物大分子的稳定性及活性， 又可循环使 用的聚合物成为本领域亟待解决的问题。 发明内容 0005 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足， 提供一种 pH 敏感溶解可逆 聚合物、 其制备方法及用途， 该 pH 敏感溶解可逆聚合物对 pH 敏感可逆溶解， 通过连接特异 说 明 书 CN。
14、 101497675 B2/6 页 5 性亲和配基， 能够用于大分子亲和沉淀， 聚合物可以高效回收， 大大降低了使用成本， 且回 收简便， 并可以保持生物质活性与稳定性。 0006 为了实现上述目的， 在本发明的第一方面， 提供了一种 pH 敏感溶解可逆聚合物， 其特点是， 所述pH敏感溶解可逆聚合物的粘均分子量为6000070000， 由式(1)所示单体 化合物、 式 (2) 所示单体化合物、 式 (3) 所示单体化合物和式 (4) 所示单体化合物经无规共 聚而得到， 其中所述式 (1) 所示单体化合物、 所述式 (2) 所示单体化合物、 所述式 (3) 所示 单体化合物和所述式 (4) 所。
15、示单体化合物的质量比为 8 9 4 5 8 1， 0007 0008 其中， R1、 R2、 R3、 R4、 R5分别选自 H 或 C1 C6的烷基 ； R6、 R7分别选自 H 或 C1 C6 的羟烷基。 0009 较佳地， 所述 R1、 所述 R2、 所述 R3、 所述 R4、 所述 R5分别选自 H 或 C1 C3的烷基 ； 所 述 R6、 所述 R7分别选自 H 或 C1 C3的羟烷基。 0010 更佳地， 所述 R1、 所述 R2、 所述 R3、 所述 R4、 所述 R5为甲基 ； 所述 R6为 H ； 所述 R7为 羟甲基。 0011 较佳地， 所述式 (1) 所示单体化合物、 所。
16、述式 (2) 所示单体化合物、 所述式 (3) 所 示单体化合物和所述式 (4) 所示单体化合物的质量比为 8 4 8 1 或 9 4 5 1。 0012 在本发明的第二方面， 提供了一种制备上述的 pH 敏感溶解可逆聚合物的方法， 其 特点是， 将所述式 (1) 所示单体化合物、 所述式 (2) 所示单体化合物、 所述式 (3) 所示单体 化合物和所述式(4)所示单体化合物按质量比为894581加入无水乙醇中， 以偶氮二异丁腈为引发剂， 在惰性气体存在下， 于5080进行聚合反应得到所述pH敏 感溶解可逆聚合物。 0013 较佳地， 所述惰性气体为氮气。 说 明 书 CN 101497675。
17、 B3/6 页 6 0014 较佳地， 还包括步骤 ： 分别用无水乙醇和丙酮洗涤所述 pH 敏感溶解可逆聚合物， 然后真空干燥， 干燥后用 pH7.0 的磷酸盐缓冲液溶解， 调节等电点沉淀， 干燥， 得到所述 pH 敏感溶解可逆聚合物的纯品。无水乙醇用于洗涤去除未反应完的单体， 丙酮用于洗涤去除 丙烯酸的均聚物。 0015 在本发明的第三方面， 提供了一种聚合物 - 配基复合物， 其特点是， 由上述的或 上述方法制备的 pH 敏感溶解可逆聚合物经环氧氯丙烷活化后与对氨基苯甲脒 ( 式 (5) 所示化合物 ) 共价结合而成， 或者上述的或上述方法制备的 pH 敏感溶解可逆聚合物与 Cibacro。
18、nBlue F3GA( 式 (6) 所示化合物 ) 直接共价结合而成。 0016 0017 0018 较佳地， 在 40， 氢氧化钠水溶液中， 加入所述环氧氯丙烷和所述 pH 敏感溶解可 逆聚合物反应使所述 pH 敏感溶解可逆聚合物上的羟基活化， 活化后用氢氧化钠调节 pH 至 11， 加入所述对氨基苯甲脒， 于 80， 反应完全， 得到所述配基 - 聚合物复合物。更佳地， 氢 氧化钠水溶液为 2mol/L NaOH， 调节 pH 时用 1N NaOH 调节。 0019 较佳地， 将所述pH敏感溶解可逆聚合物溶于水中， 加入所述Cibacron Blue F3GA， 置于40水浴摇床， 加入氯。
19、化钠， 1小时后加入碳酸钠， 振荡反应完全， 得到所述配基-聚合 物复合物。更佳地， 氯化钠是 2 Nacl， 碳酸钠是 30mg/ml 的 Na2CO3。 0020 在本发明的第四方面， 提供了上述的聚合物 - 配基复合物在亲和沉淀分离生物大 分子中的应用。 0021 在本发明中 ： 式 (1) 所示单体化合物、 式 (2) 所示单体化合物、 式 (3) 所示单体化 说 明 书 CN 101497675 B4/6 页 7 合物、 式(5)所示单体化合物和式(6)所示单体化合物为市售品 ； 式(4)所示单体化合物是 由丙烯酰胺与多聚甲醛反应制得。 0022 本发明的有益效果具体为 ： 本发明的。
20、设计并合成的 pH 敏感溶解可逆聚合物为 pH 敏感可逆溶解， 在活化状态下与对氨基苯甲脒共价结合， 未经活化时与 Cibacron Blue F3GA 共价结合， 可用于亲和沉淀分离生物大分子， 可再生回收 ( 回收率高达 95以上 )， 大 大降低了使用成本 ； 其通过调节pH至等电点(约为6.50)来进行回收， 回收操作简便， 与现 有用于亲和沉淀分离系统的聚合物相比， 本发明所述的共聚物分离生物大分子， 既能保持 生物大分子的稳定性及生物活性， 又可实现循环使用。 具体实施方式 0023 为更好的理解本发明的内容， 下面结合具体实施例作进一步说明。 0024 实施例 1pH 敏感溶解可。
21、逆聚合物制备 0025 在具塞三角烧瓶中加入 4ml 甲基丙烯酸、 2ml 甲基丙烯酸甲酯、 4ml 甲基丙烯酸二 甲氨基乙酯 ( 以上三种单体均购自上海凌峰化学试剂有限公司， 化学纯 ) 和 0.5g 羟甲基丙 烯酰胺 ( 自己合成 )， 在 50ml 无水乙醇中充分溶解， 0.05gAIBN( 上海试四赫维化工有限公 司、 偶氮二异丁腈化学纯 ) 作为引发剂， 充氮气 10 15 分钟， 以充分去除氧气。塞子封住 三角烧瓶口， 60水浴摇床， 250rpm转速下， 反应24小时， 反应方程式如下所示。 反应结束， 产物直接沉淀在三角瓶底部， 沉淀物经无水乙醇洗涤三次， 再经过真空干燥至恒重。
22、， 得到最 终产物。聚合反应得率为 75 78。其粘均分子量为 6.97104。 0026 说 明 书 CN 101497675 B5/6 页 8 0027 实施例 2 聚合物 - 配基复合物制备 0028 将一定量实施例1制备的pH敏感溶解可逆聚合物溶于水中， 40水浴摇床， 2mol/ LNaOH存在条件下， 加入环氧氯丙烷(上海凌峰化学试剂有限公司、 环氧氯丙烷、 分析纯)和 pH 敏感溶解可逆聚合物反应 2 小时使聚合物上的羟基活化， 活化后用 1N NaOH 调节 pH 至 11， 加入p-amino benzamidine(对-氨基苯甲脒)(Sigma、 分析纯)， 80， 反应2。
23、4h， 调节pH 使聚合物 - 配基复合物沉淀， 即得到可应用于亲和沉淀、 不同配基密度的亲和沉淀大分子。 配基密度为 24.59 71.08mol/g。调节 pH 至等电点 6.500.02 离心收集沉淀计算所得 到的配基 - 聚合物的回收率分别为 ： 96.3、 96.5、 96.2。理论上可以使用 50 次以上。 0029 实施例 3 胰蛋白酶亲和沉淀实例 0030 以胰蛋白酶为目标蛋白， 将 1g 粗胰酶粉末溶于 100ml pH7.3 PBS 中， 磁力搅拌 30min， 4， 9000rpm 离心 15min， 以上清液作为待纯化的样品。加入一定量的实施例 2 制备 的聚合物 - 。
24、配基复合物， 即亲和沉淀剂， 150rpm， 25， 吸附 2h， 调节溶液 pH 至聚合物等电 点 6.500.02 使聚合物 - 胰蛋白酶复合物沉淀出来， 测上清液的蛋白含量和酶活力， 胰蛋 白酶的吸附率达到 90以上， 用含有 1M NaCl 的 1M 甲酸溶液洗脱， 洗脱率也高达 90， 纯 化后胰蛋白酶活回收率超过 80， 纯化因子 30 多倍。SDS-PAGE 电泳结果显示为单一条带， 表明粗胰酶粉中的胰蛋白酶经亲和沉淀后， 得到了高度纯化。 0031 实施例 4 聚合物 - 配基复合物制备 说 明 书 CN 101497675 B6/6 页 9 0032 将一定量聚合物溶于水中，。
25、 加入 3.0mg/ml 的 Cibacron Blue F3GA(Sigma， 分析 纯 )， 置于 40水浴摇床， 加入 2 NaCl， 1 小时后加入 30mg/ml 的 Na2CO3， 振荡反应 24 小时， 用去离子水及 20乙醇洗至无染料， 配基密度为 34.82umol/g。调节 pH 至等电点 6.500.02 离心收集沉淀计算所得到的配基 - 聚合物的回收率分别为 ： 96.8、 97.3、 96.8。理论上可以使用 50 次以上。 0033 实施例 5 溶菌酶亲和沉淀实例 0034 以溶菌酶为目标蛋白， 将其溶于水中， 初始浓度为 0.5mg/ml， 在 20、 pH7.5。
26、 条件 下反应 2 小时， 调节溶液 pH 至聚合物等电点 6.500.02 使聚合物 - 溶菌酶复合物沉淀出 来， 吸附率可超过 90， 在 0.5M KSCN( 中国医药 ( 集团 ) 上海化学试剂公司、 硫氰化钾、 分 析纯 )、 pH8.0 洗脱条件下， 洗脱率超过 90。从蛋清中直接用亲和沉淀分离溶菌酶， 亦可 获得电泳纯的产品。 0035 综上所述， 本发明的pH敏感溶解可逆聚合物对pH敏感可逆溶解， 通过连接特异性 亲和配基， 能够用于大分子亲和沉淀， 聚合物可以高效回收， 大大降低了使用成本， 且回收 简便， 并可以保持生物质活性与稳定性。 0036 需要说明的是， 在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考， 就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解， 以上所述的是本发明的具体实施例及所 运用的技术原理， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改而不背离本发明的精神与范围， 这些等价形式同样落在本发明的范围内。 说 明 书 。