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1、(10)申请公布号 CN 102676534 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676534 A *CN102676534A* (21)申请号 201210106698.6 (22)申请日 2012.04.12 C12N 15/16(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C07K 14/575(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (71)申请人 上海育臣生物工程技术有限公司 地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园 区蔡伦路 781 号 1304 室 (72)发明人 周亮 祝君 洪亮 (。
2、74)专利代理机构 上海信好专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 31249 代理人 贾慧琴 (54) 发明名称 一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用内含肽制备胸腺素多 肽的方法， 该方法包含步骤1， 合成胸腺素-1基 因片段 ； 步骤 2， 利用核酸内切酶、 连接酶将合成 的胸腺素 -1 基因融合入纯化标签基因和内含 肽基因中， 获得融合蛋白重组基因， 并导入宿主细 胞中 ； 步骤 3， 发酵该宿主细胞获得胸腺素融合蛋 白 ； 步骤 4， 利用纯化标签对步骤 3 所得的融合蛋 白进行纯化 ； 步骤 5， 对步骤 4 所得的融合蛋白进 行切割， 获得胸腺素28肽。
3、单体 ； 步骤6， 对该28肽 单体进行乙酰化， 获得天然结构的胸腺素 -1 ； 步骤7， 纯化所得的天然结构胸腺素-1。 本发明 提供的制备胸腺素多肽的方法， 使多肽在宿主细 胞中易于表达， 工艺简单、 成本低， 易于操作和工 业化， 且对环境无污染。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 该方法包含 ： 步骤 1， 合成胸腺素 -1 基因片段。
4、 ； 步骤 2， 利用核酸内切酶、 连接酶将合成的胸腺素 -1 基因片段融合入纯化标签基因 和内含肽基因中， 获得融合蛋白重组基因， 并导入宿主细胞中进行表达 ； 步骤 3， 发酵该宿主细胞， 使其表达目的融合蛋白从而获得胸腺素融合蛋白 ； 步骤 4， 利用所述的纯化标签对步骤 3 所得的融合蛋白进行纯化， 得到纯化后的融合蛋 白 ； 步骤 5， 利用内含肽的自剪切效应对步骤 4 所述纯化后的融合蛋白进行裂解， 获得胸腺 素 28 肽单体 ； 步骤6， 加入乙酰化试剂对步骤5所述的胸腺素28肽单体的N末端进行乙酰化修饰， 获 得天然结构的胸腺素 -1 ； 步骤 7， 纯化所得的天然结构胸腺素 。
5、-1。 2. 如权利要求 1 所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 所述的纯化 标签包含组氨酸标签、 几丁质结合域。 3.如权利要求1或2所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 所述的步 骤 2 中构建的融合蛋白重组基因的排列方式为纯化标签 - 内含肽 - 胸腺素或胸腺素 - 内含 肽 - 纯化标签 ； 所述的纯化标签、 内含肽、 胸腺素之间的连接方式为直接连接或借助蛋白连 接肽连接。 4.如权利要求3所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 步骤2所述的 表达包含直接表达以及与其他蛋白融合表达。 5.如权利要求4所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，。
6、 其特征在于， 步骤2所述的 宿主细胞， 包含原核生物宿主细胞， 以及酵母、 真菌和其他真核生物宿主细胞。 6.如权利要求5所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 步骤3所述的 发酵宿主细胞， 是指在发酵罐中接种步骤 2 所述的宿主细胞， 进行发酵培养使其表达目的 融合蛋白 ； 所述的步骤 3 还包含步骤 3.1， 在发酵培养结束后离心发酵液收集宿主细胞， 并 用缓冲液将其重悬， 超声破碎或者高压匀浆破碎宿主细胞， 离心去除不溶物， 得到上清液即 融合蛋白溶液。 7.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 步骤4所述的 对融合蛋白进行纯化， 是指将融合蛋。
7、白通过亲和层析柱， 经缓冲液洗涤去除杂质蛋白， 再通 过洗脱缓冲液洗脱出目的融合蛋白。 8.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 步骤5所述的 融合蛋白裂解获得胸腺素 28 肽单体， 是指在 pH 值为 5-7、 温度为 4 -37条件下， 内含肽 发生剪切反应将胸腺素从融合蛋白中剪切下来， 然后将所得的蛋白溶液通过亲和层析柱， 分离得到胸腺素 28 肽单体。 9.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其特征在于， 步骤6所述的 乙酰化试剂包含乙酰氯、 乙酸酐以及羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。 10. 如权利要求 1 所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其。
8、特征在于， 步骤 7 所述 的纯化所得的天然结构胸腺素 -1， 包含利用反相高效液相层析的方法进行纯化。 权 利 要 求 书 CN 102676534 A 2 1/6 页 3 一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备胸腺素多肽的方法， 具体涉及一种通过胸腺素 -1 与内含 肽融合表达、 融合蛋白在内含肽介导下断裂释放出胸腺素多肽的方法， 即利用内含肽制备 胸腺素多肽的方法。 背景技术 0002 胸腺素 alpha 1（Thymosin -1） 是由 28 个氨基酸残基组成的多肽， 等电点为 4.2， 无二级结构无二硫键， 唯一的修饰是 N- 末端乙酰化。胸腺素。
9、 -1 的氨基酸序列为 ： N -Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-L ys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C， 它是一种针对 T 淋巴细胞的免疫增强剂， 可以使 T 细胞成熟和分化， 可促使成熟的 T 细胞、 NK 细胞分泌各种淋巴因子如白介素 -2、 - 干扰素， 也可以同时促进白介素 -2 受体的生成。 0003 胸腺素 -1 作为一种免疫增强剂， 主要用于治疗免疫缺陷和免疫抑制类疾病。当 病人患癌症或感染某些病毒如 HIV、 HB。
10、V 或经过放化疗后， 其免疫系统往往会被逐渐抑制甚 至破坏， 而不能发挥对病毒或癌细胞的正常杀伤作用。胸腺素 -1 可以恢复 T 淋巴细胞的 功能， 促进成熟 T 细胞的增殖， 促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集， 促进淋巴因 子及淋巴因子受体的产生， 增强免疫细胞的作用， 提高机体对病毒和癌症的抵抗能力。 0004 胸腺素 -1 在医疗上的应用主要有以下几个方面 ： (1) 癌症的治疗， 已证实其对 恶性黑色素瘤、 肺癌、 白血病、 鳞状上皮细胞癌、 直结肠癌有效 ； (2) 病毒性肝炎 （HBV） 的治 疗 ； (3) 艾滋病病毒 (HIV) 的治疗 ；（4） 放疗和化疗病人的免疫系。
11、统恢复。胸腺素 -1 不 仅对多种恶性肿瘤、 病毒性肝炎、 HIV 等常见、 多发、 高死亡率性的疾病有良好的治疗和缓解 作用， 还在新生儿免疫、 老年人医疗保健方面具有很大的应用潜力。 0005 目前， 国内制备胸腺素 -1 常用的方法是从动物的胸腺中提取， 这种方法的缺点 是操作复杂， 提取纯度不高， 且来源受动物数量限制。国外制备胸腺素 -1 常用的方法是 化学合成法， 该方法的缺点是成本较高且容易造成环境污染。 0006 本发明的目的是利用基因工程技术， 根据胸腺素 -1 的氨基酸序列， 推导并合成 其编码核苷酸序列， 以融合的方式与纯化标签、 内含肽同时表达， 利用纯化标签快速纯化出。
12、 融合蛋白 ； 利用内含肽自切割去除纯化标签获得胸腺素多肽。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种用于制备胸腺素多肽的方法， 将胸腺素和内含肽融合表 达， 克服多肽因其分子量太小难以在常用的原核表达系统如大肠杆菌中表达， 以及即使能 够表达也因宿主内蛋白酶的水解导致多肽产物不均一的问题， 且后期纯化只需改变融合蛋 白溶液的 pH 等条件， 即能使内含肽与胸腺素断裂， 释放出胸腺素。该方法可以大量制备胸 腺素， 且成本低、 无污染， 适宜工业化大生产。 0008 为了达到上述目的， 本发明提供了一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 该方 说 明 书 CN 102676534 A 3 2/6。
13、 页 4 法包含 ： 步骤 1， 合成胸腺素 -1 基因片段 ； 步骤 2， 利用核酸内切酶、 连接酶将合成的胸腺 素 -1 基因片段融合入纯化标签基因和内含肽基因中， 获得融合蛋白重组基因， 并导入宿 主细胞中进行表达 ； 步骤 3， 发酵该宿主细胞， 使其表达目的融合蛋白， 从而获得包含胸腺 素、 纯化标签和内含肽的融合蛋白产物 ； 步骤 4， 利用所述的纯化标签对步骤 3 所得的融合 蛋白产物进行纯化， 得到纯化后的融合蛋白 ； 步骤 5， 利用内含肽的自剪切效应对步骤 4 所 述纯化后的融合蛋白进行裂解， 获得胸腺素 28 肽单体 ； 步骤 6， 加入乙酰化试剂对步骤 5 所 述的胸腺。
14、素28肽单体的N末端进行乙酰化修饰， 获得天然结构的胸腺素-1 ； 步骤7， 纯化 所得的天然结构胸腺素 -1。 0009 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 所述的纯化标签包含组氨酸标 签 His-tag、 几丁质结合域 CBD 等。用基因工程的方法来表达蛋白质， 必须经过纯化才能实 现最终目的， 将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达， 通过亲和纯化标签蛋白来 纯化目的蛋白是常用的间接手段， 当融合蛋白溶液流经亲和纯化介质时， 融合蛋白由于纯 化标签的存在会被特异亲和吸附， 杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白， 即达到使目的蛋白纯化 的目的。 0010 上述的利用内含肽制备胸腺素多。
15、肽的方法， 其中， 步骤 1 所述的胸腺素 -1 基因 为 GeneBank 公用数据库公布的人胸腺素 -1 28 肽的基因序列。 0011 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤 1 所述的胸腺素 -1 基因 是向上海生工、 英潍捷基等基因合成公司订制合成的。 0012 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 所述的步骤 2 中构建的融合蛋 白的基因排列方式为纯化标签 （Tag） - 内含肽 （Intein） - 胸腺素 （Thymosin） 或胸腺素 - 内 含肽 - 纯化标签。所述的融合蛋白的三部分即纯化标签、 内含肽、 胸腺素之间的连接方式包 含直接连接以及借助其。
16、它蛋白连接肽连接。 0013 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤2和步骤3所述的融合蛋白 的表达包含直接表达以及将其再与其他蛋白融合表达。 0014 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤 2 和步骤 3 所述的宿主细 胞， 包含原核生物宿主细胞， 以及酵母、 真菌和其他真核生物宿主细胞， 即， 可以使融合蛋白 重组基因在各种原核表达系统以及酵母、 真菌和其他真核表达系统中进行表达。 0015 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤 3 所述的发酵宿主细胞获 得胸腺素融合蛋白产物， 是指在发酵罐中接种步骤 2 所述的宿主细胞， 经适合的条件培养 并。
17、诱导宿主细胞表达目的融合蛋白 ； 所述的步骤 3 中还包含步骤 3.1， 发酵培养结束后离心 发酵液收集宿主细胞， 并用一定体积的缓冲液将其重悬， 超声破碎或者高压匀浆破碎宿主 细胞， 离心去除不溶物， 得到上清液即融合蛋白产物的溶液。 0016 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤 4 所述的对融合蛋白进行 纯化， 是指将融合蛋白通过离过亲和层析柱， 经缓冲液洗涤去除杂质蛋白， 再通过洗脱缓冲 液洗脱出目的融合蛋白， 使融合蛋白产物得以纯化， 所得蛋白纯度大于 90%。 0017 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤 5 所述的融合蛋白裂解获 得胸腺素 28 。
18、肽单体， 是指在 pH 值为 5-7、 温度为 4 -37条件下， 内含肽发生剪切反应将 胸腺素从融合蛋白中剪切下来， 然后将所得的蛋白溶液通过亲和层析柱， 胸腺素 28 肽将穿 过该柱， 纯化标签则结合在柱上， 分离得到胸腺素 28 肽单体。 说 明 书 CN 102676534 A 4 3/6 页 5 0018 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤6所述的28肽单体乙酰化， 是指将所得的胸腺素 28 肽溶液的 pH 值调成酸性， 加入乙酰化试剂对胸腺素 28 肽的 N 末端 进行乙酰化修饰， 得到天然结构的胸腺素-1。 所述的乙酰化试剂包含乙酰氯、 乙酸酐以及 羟基琥珀酰亚。
19、胺乙酸酯。 0019 上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法， 其中， 步骤 7 所述的纯化所得的天然 结构胸腺素 -1， 包含利用反相高效液相层析 （RP-HPLC） 的方法进行纯化。利用 RP-HPLC 等技术能够获得纯度达 98% 以上的天然结构胸腺素 -1。 0020 本发明提供的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法具有以下优点 ： 1. 以融合形式表达胸腺素 -1， 克服了多肽分子量较小难以在大肠杆菌中成功表达 的困难。 0021 2. 融合蛋白具有纯化标签， 能通过一步亲和层析获得较纯的目的蛋白， 工艺简单、 成本低。 0022 3. 融合蛋白中含有内含肽序列， 能够进行精确切割， 释放出。
20、胸腺素多肽， 反应条件 简单， 易于操作和工业化。 0023 4. 体外乙酰化获得天然结构的胸腺素， 且对环境无污染。 附图说明 0024 图 1 为本发明的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法的实施例 1 中用 SDS-PAGE 检 测经过 Ni-Sepharose 层析柱纯化的融合蛋白的结果示意图。 0025 图 2 为本发明的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法的实施例 1 中用 SDS-PAGE 检 测裂解融合蛋白得到的胸腺素 28 肽的结果示意图。 0026 图 3 为乙酰化胸腺素和未乙酰化胸腺素的质谱图。 0027 图 4 为本发明的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法制备的胸腺素 28 肽的纯化与。
21、 乙酰化的 RP-HPLC 结果示意图。 具体实施方式 0028 以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步地说明。 0029 本发明属于基因重组生物合成技术领域， 利用生物合成方法和体外修饰技术生产 胸腺素-1。 通过生物工程技术， 将胸腺素基因进行重组， 在宿主细胞中表达该重组基因获 得纯化标签-内含肽-胸腺素融合蛋白， 利用内含肽的自剪切效应， 使融合蛋白在体外自切 割释放出胸腺素 28 肽， 再通过体外乙酰化修饰， 获得与化学合成品结构完全一致的胸腺素 -1。 0030 首先， 按照GeneBank公用数据库公布的人胸腺素-1 28肽的基因序列合成胸腺 素 -1 基因， 其 5 端含有。
22、 Lgu 、 3 端含有 Xhol 酶切位点。再利用核酸内切酶、 连接酶 将合成的胸腺素基因融合入纯化标签基因和内含肽基因中， 获得融合蛋白重组表达载体， 并导入宿主细胞如大肠杆菌感受态细胞中。在发酵罐中接种该宿主菌， 经适合的条件培养 并诱导宿主菌表达目的融合蛋白 ； 发酵结束后离心发酵液收集菌体， 用一定体积的缓冲液 将菌体重悬， 超声破碎或者高压匀浆破碎菌体， 离心去除不溶物。离心上清过亲和层析柱， 经缓冲液洗涤去除杂质蛋白， 再通过洗脱缓冲液洗脱出目的融合蛋白， 蛋白纯度大于 90%。 说 明 书 CN 102676534 A 5 4/6 页 6 改变融合蛋白缓冲液的pH值为5-7、 。
23、4-37条件下利用内含肽的自剪切作用将胸腺素从 融合蛋白中剪切下来， 剪切反应后将蛋白溶液再过一次亲和层析柱， 胸腺素 28 肽将穿过该 柱， 纯化标签结合在柱上， 从而分离出胸腺素 28 肽。将获得的多肽溶液调成酸性， 加入乙酰 化试剂 （乙酰氯、 乙酸酐或羟基琥珀酰亚胺乙酸酯等） 对胸腺素 28 肽 N 末端进行乙酰化修 饰， 反应结束后， 利用 RP-HPLC 纯化出天然结构的胸腺素 -1。 0031 实施例 1 1.pET32a/ intein /Thymosin -1 表达质粒的构建。 0032 合成胸腺素 alpha 1（Thymosin -1） 基因， 5 端含有 Lgu 、 3。
24、 端含有 Xhol 酶切位点， 将合成好的基因克隆到 pMD18-T 载体上 （以上步骤均为基因合成公司完成） 。 0033 将得到的 pMD18-T Vector/ Thymosin-1 质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细 胞。其转化方法为 ： 取 1 L 质粒加入到 100 L 大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 于冰上放 置 30min ； 然后置于 42水浴中 90s， 再放回到冰上 3-5min ； 然后加入 800 L LB 培养基 （Luria-Bertani 培养基） ， 于 37孵育 45min ； 然后 2500rpm 离心 5min 收集菌体， 弃去 700 L 培养基， 剩。
25、余 200 L 培养基涂布于含 50L/mL 氨苄青霉素的琼脂糖平板培养过夜。挑 取平板上长出的单克隆， 于 5mL 含 50 L/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中震荡培养过夜。 0034 取2mL过夜培养菌液用质粒抽提试剂盒提取pMD18-T Vector/ Thymosin -1质 粒， PCR 扩增获得胸腺素 -1 基因， PCR 反应体系为 ： 质粒 1L ； PCR mix 10L ； 正向、 反向 引物各 1L， 加水补至 20L。扩增条件是 95变性 30s ； 54退火 30s， 72延伸 30s ； 共 35 个循环。再经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收， 得到目的基。
26、因片段为 90bp。 0035 将 pTwin-1 质粒转化到大肠杆菌 DH5 感受态细胞中进行克隆。用质粒抽提试剂 盒提取 pTwin-1 质粒， PCR 扩增获得内含肽 （intein） 基因片段， PCR 反应体系为 ： 质粒 1L ； PCR mix 10L ； 正向、 反向引物各 1L， 加水补至 20L。扩增条件是 95变性 30s ； 54退 火 30s， 72延伸 60s ； 共 30 个循环。再经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收， 得 到目的基因片段为 462bp。 0036 将PCR获得的Thymosin -1基因片段和intein基因片段按1:1混合 （2L+2L）。
27、 ， 加入 4L PCR mix 后， 于 95变性 30s ； 54退火 30s， 72延伸 60s， 循环 10 次。以此反应 产物为模板进行 PCR， 反应体系为 ： 反应产物 1L ； PCR mix 10L ； 正向、 反向引物各 1L， 加 水补至 20L。扩增条件是 95变性 30s ； 54退火 30s， 72延伸 90s ； 共 30 个循环。PCR 产物用 Nco 、 Xhol 酶切， 反应体系为 ： PCR 产物 16L， 酶切 Buffer 2L， Nco 、 Xhol 酶各 1L， 于 37反应 15min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收， 得 到 。
28、Nco 、 Xhol 酶切好的 intein/Thymosin -1 融合片段， 片段大小为 552bp。 0037 用质粒抽提试剂盒提取 pET-32a 质粒， 用 Nco 、 Xhol 酶切该质粒， 酶切反应体 系为 ： pET-32a质粒10L， 酶切Buffer 2L， Nco、 Xhol酶各1L， 加水补至20L， 于37 反应 15min。反应产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收， 得到 Nco 、 Xhol 酶切好的 pET-32a 质粒， 片段大小为 5000bp。 0038 用 T4-DNA 连接酶将上述 intein/Thymosin -1 融合片段与用 Nco 、。
29、 Xhol 酶 切的 pET32a 载体连接， 反应体系为 intein/Thymosin -1 融合片段 6L， Nco 、 Xhol 酶切好的 pET-32a 质粒 2L， T4-DNA 连接酶 1L， 连接 Buffer 1L， 于 16反应 45min 得到 pET32a/ intein /Thymosin -1表达质粒。 将连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞， 抽 说 明 书 CN 102676534 A 6 5/6 页 7 质粒测序鉴定目的序列。 0039 2. 融合蛋白的表达及产物纯化。 0040 将 pET32a/ intein /Thymosin -1 质粒转化大肠杆菌 B。
30、L21(DE3) 感受态细胞， 挑取单菌落接种至含50g/ml Amp的LB培养基中， 37、 250rpm/min振摇过夜。 过夜菌按 2% （v/v） 接种于新鲜 LB 培养基 （含 50g/ml Amp） ， 37、 200rpm/min 振摇培养至 OD600 约 为 0.60.8， 加入终浓度为 1mmol/L IPTG 诱导 6h， 离心 （6000rpm/min， 10min， 4） 收集菌 体。 0041 按每克菌体加入 7.5ml 缓冲液的比例加入裂解缓冲液 （PBS） ， 4超声破碎 （400w， 10min） ， 将裂解的菌液 12000g/min， 4离心 15min，。
31、 收集上清。上清液上样至预先用平衡缓 冲液平衡的 G25 层析柱， 用洗脱液洗脱， 收集蛋白溶液。再将收集的蛋白溶液上样至预先用 平衡缓冲液平衡的 Ni-Sepharose 层析柱， 用 5mM 咪唑洗涤缓冲液充分洗涤， 再用含 70mM 咪 唑的洗脱缓冲液洗脱， 收集蛋白峰， 用 SDS-PAGE 检测蛋白纯度， 参见图 1 所示。 0042 收集目的蛋白峰， 调整蛋白缓冲液的PH值至6.2， 在25条件下， 融合蛋白中内含 肽的自剪切作用使胸腺素 -1（28 肽） 被剪切下来。将蛋白溶液上样至预先用平衡缓冲 液平衡的DEAE Sepharose层析柱， 用洗脱液洗脱， 收集蛋白峰， 用SD。
32、S-PAGE检测蛋白纯度， 参见图 2 所示。 0043 实施例 2 1.pTwin-1/Thymosin -1 表达质粒的构建。 0044 如实施例 1 中所述， 从基因合成公司购置 pMD18-T Vector/ Thymosin-1 质粒， 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 然后用质粒抽提试剂盒提取质粒， 通过 PCR 扩增获得 Thymosin -1 基因， 所得目的基因片段为 90bp。 0045 将 pTwin-1 质粒用 Lgu 、 Pst 进行双酶切， 反应体系为 ： pMD18-T Vector/ Thymosin -1 质粒 10L， 酶切 Buffer 2L， Nco 。
33、、 Xhol 酶各 1L， 加水补至 20L， 于 37反应 15min。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用胶回收试剂盒回收， 片段大小为 7375bp。 0046 将回收好的目的基因片段和 Lgu 、 Pst 酶切的 pTwin-1 载体 （用 CIAP 处理， 去 除平末端磷酸基团） 用 T4-DNA 连接酶连接形成 pTwin-1/Thymosin -1， 将连接产物转化 大肠杆菌 TG1 感受态细胞， 抽质粒测序鉴定目的序列。 0047 2. 融合蛋白的表达及产物纯化。 0048 pTwin-1/ Thymosin -1质粒转化大肠杆菌ER2566感受态细胞， 挑取单菌落接种 至含 5。
34、0g/ml Amp 的 LB 培养基中， 37、 200rpm/min 振摇过夜。过夜菌按 2%（v/v） 接种 于新鲜LB培养基 （含50g/ml Amp） ， 37、 200rpm/min振摇培养至OD600约为0.60.8， 加 入终浓度为 1mmol/L IPTG 诱导 6h， 离心 （6000rpm/min， 10min， 4） 收集菌体。 0049 按每克菌体加入 7.5ml 缓冲液的比例加入裂解缓冲液 （PBS） ， 4超声破碎 （400w， 10min） ， 将裂解的菌液用 12000g/min， 4离心 15min， 收集上清。上清液上样至预先用平衡 缓冲液平衡的 G25 层。
35、析柱， 洗脱液洗脱层析柱， 收集蛋白峰。再将收集的蛋白溶液上样至预 先用平衡缓冲液平衡的几丁质亲和层析柱， 洗涤缓冲液充分洗涤， 然后调整几丁质柱的 PH 为 6.2， 25过夜， 利用内含肽的自剪切作用将胸腺素 -1 多肽从融合蛋白中剪切下来， 用 洗脱缓冲液将胸腺素 -1 多肽洗脱下来， 收集蛋白峰， SDS-PAGE 检测蛋白纯度。 说 明 书 CN 102676534 A 7 6/6 页 8 0050 实施例 3 ： 重组胸腺素 28 肽的体外乙酰化。 0051 胸腺素 -1 分子量为 3108Da， 未乙酰化的胸腺素分子量则比其小 42， 为 3066， 参 见图 3 所示。 005。
36、2 用乙酸将实施例 1 或实施例 2 所得的胸腺素 -1 28 肽溶液 pH 调整到 2-3， 然后 按照每10min每10mL溶液中加入2 L乙酸酐的速度加入乙酸酐， 于冰上持续搅拌反应。 利 用 RP-HPLC 监测反应， 至乙酰化胸腺素不再累积时停止反应。用 RP-HPLC 纯化出天然结构 胸腺素 -1。参见图 4 所示， 图中的、 、 、 分别代表融合蛋白裂解后、 融合蛋白裂解 后经 DEAE 纯化、 纯化后的胸腺素 28 肽经体外乙酰化反应， 和乙酰化反应后 RP-HPLC 纯化出 的胸腺素 ； 峰 1、 2、 3 则分别代表未乙酰化的胸腺素、 内含肽和乙酰化胸腺素。 0053 尽管。
37、本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍， 但应当认识到上述的 描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后， 对于本发明的 多种修改和替代都将是显而易见的。 因此， 本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。 说 明 书 CN 102676534 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 102676534 A 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102676534 A 10 2/3 页 11 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102676534 A 11 3/3 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102676534 A 12 。