抗c-Met单价抗体慢病毒快速表达及应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610253999.X	申请日：	20160423
公开号：	CN105884897A	公开日：	20160824
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C07K16/30,C12N15/13,A61P35/00	主分类号：	C07K16/30,C12N15/13,A61P35/00
申请人：	同济大学苏州研究院
发明人：	郭佳,蒋明,尹衍新,于丽华,蒋韵
地址：	215101 江苏省苏州市吴中区金枫南路198号2号楼
优先权：	CN201610253999A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明公开了一种重组抗人c‑Met单价抗体，其重链可变区核酸序列如SEQ ID:1所示，轻链可变区核酸序列如SEQ ID NO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQ ID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID:6所示，完整Knob链核酸序列如SEQ ID:7所示；其完整重链氨基酸序列如SEQ ID:8所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID:9所示，完整Knob链氨基酸序列如SEQ ID:10所示。本发明所公开的单价抗体能特异性与人c‑Met结合，并阻断HGF与c‑Met结合，在筛选阻断HGF/c‑Met信号转导通路进而抑制肿瘤生长的中和抗体药物研发方面具有重大作用。

权利要求书

1.一种重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQIDNO:1所示;其轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO:2所示。 2.一种重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。 3.一种DNA分子，编码了权利要求1或2所述的重组抗人c-Met单价抗体。 4.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met单价抗体的完整重链核酸序列如SEQIDNO:5所示；完整轻链核酸序列如SEQIDNO:6所示；完整Knob链核酸序列如SEQID:7所示。 5.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met单价抗体的完整重链氨基酸序列如SEQID:8所示，完整轻链氨基酸序列如SEQID:9所示，完整Knob链氨基酸序列如SEQID:10所示。 6.编码有权利要求1-5任一所述重组抗人c-Met单价抗体DNA的质粒。 7.编码有权利要求1-5任一所述重组抗人c-Met单价抗体的表达，包括在原核和真核细胞的表达。 8.根据权利要求1-5之一所述的重组抗人c-Met单价抗体，其特征在于其与肝细胞生长因子受体c-Met特异性结合，其能阻断HGF与c-Met结合。 9.一种如权利要求4-5所述的重组抗人c-Met单价抗体的应用，其特征在于：用于肿瘤的诊断及治疗。

说明书

技术领域

本发明属于抗体药物技术领域，具体涉及一种针对人间质表皮转化因子c-Met分子的重组单价抗体及其应用。

背景技术

人间质表皮转化因子(c-Mesenchymalepithelial transition factor, c-Met) 是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，后被证实肝细胞生长因子( hepatocytegrowth factor，HGF)是其特异性配体，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。c-Met的基本结构是由50 kD的α链和145 kD的β链组成的异二聚体，包括3个功能不同的结构域，即胞外区、跨膜区及胞内区。c-Met与其配体结合后，胞内区具有酪氨酸激酶活性，可激活多种信号通路，如PI3K-Akt、Ras-MAPK及STAT3等。引起广泛细胞应答，包括肿瘤细胞间的相互作用、基质粘附、细胞迁移、侵袭和血管生成。目前，阻断HGF/c-Met信号转导已成为抗肿瘤药物研究的一个重要策略。c-Met抑制剂的临床试验报告显示其可使非小细胞肺癌部分患者生存获益。由辉瑞公司研发的克唑替尼胶囊（crizotinib）于2011年8月份获FDA批准用于治疗存在EML4-ALK融合基因的晚期非小细胞肺癌，这是第一个获批的针对c-Met开发的小分子酪氨酸激酶抑制剂。由Exelixis公司研发的c-Met酪氨酸酶抑制剂卡博替尼（cabozantinib）于2012年11月获 FDA批准上市，用于治疗恶性局部晚期或转移性甲状腺髓样癌的治疗。目前，还没有FDA批准的抗C-Met的中和抗体药物。本发明针对目前传统中和单克隆抗体可通过c-Met二聚化进而激活肿瘤细胞信号转导这一问题，以抗c-Met的中和抗体ch3E1D7为亲本抗体，构建、表达并初步鉴定既有中和活性又能阻断c-Met二聚化的单价抗体，为后续研发阻断HGF/c-Met信号通路进而抑制肿瘤生长的治疗性抗体奠定基础。

发明内容

本发明解决问题之一是采用兼并引物法准确克隆出c-Met鼠单抗3E1D7的可变区序列。

本发明提供的重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供的重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明解决的问题之二是采用重叠延伸PCR技术，以抗c-Met的中和抗体ch3E1D7为亲本抗体，构建、表达并初步鉴定既有中和活性又能阻断c-Met二聚化的具有自主知识产权的抗人c-Met单价抗体。

本发明提供重组抗人c-Met单价抗体，其完整重链核酸序列如SEQ ID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID:6所示，完整Knob链核酸序列如SEQ ID:7所示。

本发明提供重组抗人c-Met单价抗体，其完整重链氨基酸序列如SEQ ID:8所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID:9所示，完整Knob链氨基酸序列如SEQ ID:10所示。

本发明提供的重组抗人c-Met单价抗体基因序列在哺乳动物内进行了表达，并获得了目的抗体。

以该序列为模板可以在保持特异性和亲和力的前提下进化成全人源抗体或人源化抗体以及各种具有应用前景的产品，如scFv, Fab等。

本发明所提供的重组抗人c-Met单价抗体，能特异性的与肝细胞生长因子受体c-Met结合。并能阻断HGF与c-Met结合，为后续研发阻断HGF/c-Met信号通路进而抑制肿瘤生长的治疗性抗体奠定基础。

附图说明

图1为基因工程设计单价抗体示意图，其中VH：重链可变区；CH1：重链恒定区1；VL：轻链可变区；CL：轻链恒定区；Knobs into holes：“杵臼”结构。

图2为抗人C-Met嵌合抗体ch3E1D7重链可变区、IgG1-hole的CH-hole及单价抗体完整重链基因的PCR产物电泳图，其中(a)是ch3E1D7重链可变区及IgG1-hole的CH-hole （泳道1为DL2000 Marker; 泳道2为IgG1-hole的CH-hole基因约1000bp; 泳道3为重链可变区条带339bp），(b)是重叠PCR将CH-hole与VH两片段连接，形成c-Met单价抗体的完整重链（泳道1为DL2000 Marker; 泳道2为目的基因）。

图3单价抗体的SDS-PAGE电泳图谱，其中(a)是还原性SDS-PAGE(其中泳道1是蛋白marker; 泳道2是单价抗体)，(b)是非还原性SDS-PAGE(其中泳道1是蛋白marker; 泳道2是单价抗体)。

图4是ELISA检测单价抗体与人c-Met的结合活性，其中横坐标是单价抗体浓度（ng/ml），纵坐标是为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（OD450）。

图5是竞争 ELISA检测单价抗体中和活性，其中横坐标是单价抗体浓度（ng/ml），纵坐标是为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（OD450）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所；CMV/IgG1-hole-flag、CMV/IgG1-knob-his、CMV/ch3E1D7-L、CMV/ ch3E1D7-H、pRRL-CMV等质粒及c-Met胞外区融合蛋白（参见已发表文章）为本实验室保存；大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；细胞培养基DMEM及胎牛血清购自Hyclone公司；各种限制性核酸内切酶、phusion超保真PCR试剂盒均为美国NEB公司产品；DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒、内毒素纯化中抽试剂盒和TMB显色液均购自北京天根生化科技有限公司；NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒购自上海欣百诺生物科技有限公司；兔抗Flag-HRP多克隆抗体为华安生物产品；山羊抗人HGF生物素化多克隆抗体和重组人HGF蛋白为美国R&D公司产品；链霉亲和素-HRP抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Protein A购自Amersham公司。

c-Met单价抗体结构的设计

以抗c-Met的中和抗体ch3E1D7为亲本抗体，设计单价抗体mono1H9F6。本研究设计了以下三条链：其中一侧抗体臂来源于亲本嵌合抗体ch3E1D7，即ch3E1D7的一条原始轻链不变；而ch3E1D7原始重链的CH3结构域中用三个小分子氨基酸代替三个大分子氨基酸，即T366S :L368A :Y407V，使CH3结构域上形成一个臼状结构，即“hole”；。另一侧Knob链是使人免疫球蛋白IgG1抗体的CH3结构域突出一个“knob”，即用一个大分子氨基酸Try代替一个小分子氨基酸Thr，如T366Y，形成一个杵状结构。改造后的两个CH3空间构象形成对应关系，只有含有“hole”的CH3结构域与含有“knob”的CH3结构域之间能形成稳定的异源二聚体，避免了抗体表达时出现的副产物组装，且突变后抗体具有与野生型相似的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。单价抗体结构图如图1所示。

实施例2

c-Met单价抗体三条链慢病毒表达载体构建

Mono3E1D7的轻链，即ch3E1D7原始轻链，其慢病毒表达载体CMV/ch3E1D7 -L由本实验室构建并保存。另一侧Knob链，是使IgG1的CH3结构域突出一个“knob”的杵状结构，且在其C端加入His标签，其慢病毒表达载体CMV/IgG1-knob-his由本实验室构建并保存。本实验室保存有CMV/IgG1-hole-flag质粒，其CH3结构域上形成一个“hole”臼状结构，因此单价的重链需要将ch3E1D7重链可变区与IgG1-hole-flag的恒定区通过重叠延伸PCR技术（SOE-PCR）拼接起来。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其序列如下：

P1引物序列（5’-3’）： CACCGACTCTAGAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACACC（下划线所示是AgeI酶切位点）；

P2引物序列（5’-3’）：GTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCT；

P3引物序列（5’-3’）：CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC；

P4引物序列（5’-3’）： TCCAGAGGTTGATTGTCGACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（下划线所示是SalI酶切位点，斜体是Flag标签）。

先将ch3E1D7重链可变区和IgG1-hole-flag的恒定区分别以P1/P2和P3/P4为引物进行PCR扩增，反应产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳后纯化回收。再将ch3E1D7重链可变区VH和IgG1-hole的恒定区CH-hole两个片段通过SOEPCR连接，再次电泳及PCR产物回收，PCR产物电泳图如图1所示。慢病毒表达质粒pRRL-CMV由AgeI和SalI-HF双酶切，割胶回收。将目的片段与载体用NovoRec® PCR一步定向克隆试剂盒进行同源重组连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行测序鉴定。新的单价抗体重链pRRLCMV- mono3E1D7-H用去除内毒素的质粒提取试剂盒纯化备用。

实施例3

c-Met单价抗体mono3E1D7的表达、纯化与鉴定

接种处于对数生长期的293T细胞，待细胞生长至50%~60%融合时进行转染，单价抗体组将1.8μg慢病毒包装质粒混合物和1.9μg单价抗体表达质粒（CMV/ch3E1D7 –L、pRRLCMV- mono3E1D7-H和CMV/IgG1-knob-his按照1:1:1的比例混合）用基础培养基重悬后，利用磷酸钙法将mono3E1D7三条链的慢病毒表达载体质粒转染293T细胞。以含有绿色荧光蛋白的载体p RRL-CMV-GFP转染293T细胞作为阳性对照，以未转染的293T细胞作为空白对照。慢病毒表达质粒与包装质粒混合物共转染293T细胞，24h后可包装形成慢病毒，病毒颗粒进一步感染293T细胞，将单价抗体基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到快速、持久表达目的蛋白的效果。病毒感染48h后收集293T细胞培养液，10000 rpm离心20 min，离心后上清经0.45 μm的滤膜过滤。将滤过的培养液与PBS缓冲液等体积混合，通过protein A亲和层析纯化抗体。BCA试剂盒进行浓度测定，纯化后的单价抗体分别在非还原（7.5%）和还原条件（10%）下用聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色鉴定抗体，检测其纯度和分子量大小。还原条件下SDS-PAGE，单价抗体的二硫键断裂，其三条链出现了三个条带，分别对应分子量大小约55KDa的重链、25KDa的轻链以及30KDa的Knob链。在非还原条件下，二硫键不会断裂，三条链通过二硫键形成异源二聚体，因此单价抗体呈现一条带，大小约110KDa。且由于Knobs into holes“杵臼”结构避免了抗体表达时副产物组装，呈现较为单一的条带，如图3所示。综上所述，单价抗体纯化成功，且保证了结构的正确性和完整性。

实施例4

c-Met单价抗体生物学功能的初步检测

用CBS将c-Met胞外区融合蛋白稀释至5μg/ml，4 ℃过夜包被。PBST洗涤3次，用1%BSA 37 ℃封闭2 h。将c-Met单价抗体加入酶标板中，37 ℃作用2 h，同时以PBS作为阴性对照，PBST洗涤3次。以兔抗Flag-HRP多克隆抗体作为测抗体，37℃作用1h，PBST洗涤后每孔加入100 μl TMB显色液，37 ℃避光显色10 min，终止反应后酶标仪测定A450数值。ELISA检测结果如图4所示，单价抗体可与抗原c-Met蛋白发生特异性的结合，且随着浓度的增加，信号逐渐增强，显著高于作为阴性对照的PBS组。由此证明，成功构建并表达了能与人c-Met抗原特异性结合单价抗体。

实施例5

单价抗体体外阻断c-Met与HGF结合的生物学活性

用CBS将c-Met胞外区融合蛋白稀释至5μg/ml，4 ℃过夜包被。PBST洗涤3次后，用1%BSA 37 ℃封闭2 h。将不同浓度的单价抗体加入酶标板中，37 ℃作用1.5 h，同时以PBS作为阴性对照，PBST洗涤3次。将商品化重组人HGF蛋白稀释成15ng/ml，每孔100μl加入酶标板中，37 ℃作用2 h， PBST洗涤3次后，以山羊抗人HGF生物素化多克隆抗体作为检测抗体，37℃作用1h，PBST洗涤3次后，加入工作浓度的链霉亲和素-HRP，37℃作用0.5h，PBST洗涤后每孔加入100 μl TMB显色液，37 ℃避光显色10 min，终止反应后酶标仪测定A450数值。检测单价抗体是否具有与人HGF竞争性结合c-Met蛋白的能力。ELISA结果显示，反应数值随单价抗体浓度的增加呈现下降趋势，即随单价抗体浓度的增加，显著抑制了人肝细胞生长因子与c-Met的结合活性，如图5所示。结果说明c-Met单价抗体具有中和活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 同济大学苏州研究院

<120> 抗c-Met单价抗体慢病毒快速表达及应用

<130> 2016

<160> 10

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<212> DNA

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202530

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505560

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<212> DNA

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tag723

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<211> 477

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

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151015

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115120125

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145150155160

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165170175

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260265270

Leu Met Ile Ser ArgThr Pro Glu Val Thr Cys Val ValVal Asp Val

275280285

Ser His Glu Asp Pro GluVal Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290295300

Glu Val His AsnAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu GlnTyr Asn Ser

305310315320

Thr Tyr ArgVal Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325330335

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465470475

<210> 9

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Met Val Ser Tyr Trp Asp ThrGly Val Leu Leu Cys Ala LeuLeu Ser

151015

Cys Leu Leu Leu ThrGly Ser Ser Ser Gly Asp Ile Val Ile Thr Gln

202530

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65707580

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225230235240

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245250255

His His His

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610253999.X (22)申请日 2016.04.23 (71)申请人同济大学苏州研究院地址 215101 江苏省苏州市吴中区金枫南路198号2号楼 (72)发明人郭佳蒋明尹衍新于丽华蒋韵 (51)Int.Cl. C07K 16/30(2006.01) C12N 15/13(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称抗c-Met单价抗体慢病毒快速表达及应用 (57)摘要本发明公开了一种重组抗人c-Met单价抗体，其重链。

2、可变区核酸序列如SEQID:1所示，轻链可变区核酸序列如SEQIDNO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQID:3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQID:5所示，完整轻链核酸序列如 SEQID:6所示，完整Knob链核酸序列如SEQID:7 所示；其完整重链氨基酸序列如SEQID:8所示，完整轻链氨基酸序列如SEQID:9所示，完整Knob 链氨基酸序列如SEQID:10所示。本发明所公开的单价抗体能特异性与人c-Met结合，并阻断HGF 与c-Met结合，在筛选阻断HGF/c-Met信号转导通路进而抑制肿瘤。

3、生长的中和抗体药物研发方面具有重大作用。权利要求书1页说明书4页序列表14页附图2页 CN 105884897 A 2016.08.24 CN 105884897 A 1.一种重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQIDNO:1所示;其轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO:2所示。 2.一种重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。 3.一种DNA分子，编码了权利要求1或2所述的重组抗人c-Met单价抗体。 4.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met单价抗。

4、体的完整重链核酸序列如SEQ IDNO:5所示；完整轻链核酸序列如SEQIDNO:6所示；完整Knob链核酸序列如SEQID:7所示。 5.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人c-Met单价抗体的完整重链氨基酸序列如 SEQID:8所示，完整轻链氨基酸序列如SEQID:9所示，完整Knob链氨基酸序列如SEQID:10 所示。 6.编码有权利要求1-5任一所述重组抗人c-Met单价抗体DNA的质粒。 7.编码有权利要求1-5任一所述重组抗人c-Met单价抗体的表达，包括在原核和真核细胞的表达。 8.根据权利要求1-5之一所述的重组抗人c-Met单价抗体，其特征在于其与肝细。

5、胞生长因子受体c-Met特异性结合，其能阻断HGF与c-Met结合。 9.一种如权利要求4-5所述的重组抗人c-Met单价抗体的应用，其特征在于：用于肿瘤的诊断及治疗。权利要求书 1/1 页 2 CN 105884897 A 2 抗c-Met单价抗体慢病毒快速表达及应用技术领域 0001 本发明属于抗体药物技术领域，具体涉及一种针对人间质表皮转化因子c-Met分子的重组单价抗体及其应用。背景技术 0002 人间质表皮转化因子(c-Mesenchymalepithelialtransitionfactor,c-Met) 是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，后被证实肝细胞生长。

6、因子(hepatocytegrowth factor， HGF)是其特异性配体，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。 c-Met的基本结构是由50kD的链和145kD的链组成的异二聚体，包括3个功能不同的结构域，即胞外区、跨膜区及胞内区。 c-Met与其配体结合后，胞内区具有酪氨酸激酶活性，可激活多种信号通路，如PI3K-Akt、 Ras-MAPK及STAT3等。引起广泛细胞应答，包括肿瘤细胞间的相互作用、基质粘附、细胞迁移、侵袭和血管生成。目前，阻断HGF/c-Met信号转导已成为抗肿瘤药物研究的一个重要策略。 c-Met抑制剂的临床试验报告显示其。

7、可使非小细胞肺癌部分患者生存获益。由辉瑞公司研发的克唑替尼胶囊（crizotinib）于2011年8月份获FDA批准用于治疗存在EML4-ALK融合基因的晚期非小细胞肺癌，这是第一个获批的针对c-Met开发的小分子酪氨酸激酶抑制剂。由Exelixis公司研发的c-Met酪氨酸酶抑制剂卡博替尼（cabozantinib）于2012年11月获FDA批准上市，用于治疗恶性局部晚期或转移性甲状腺髓样癌的治疗。目前，还没有FDA批准的抗C-Met的中和抗体药物。本发明针对目前传统中和单克隆抗体可通过c-Met二聚化进而激活肿瘤细胞信号转导这一问题，以抗c-Met的中和抗。

8、体ch3E1D7为亲本抗体，构建、表达并初步鉴定既有中和活性又能阻断c-Met二聚化的单价抗体，为后续研发阻断HGF/c-Met信号通路进而抑制肿瘤生长的治疗性抗体奠定基础。发明内容 0003 本发明解决问题之一是采用兼并引物法准确克隆出c-Met鼠单抗3E1D7的可变区序列。 0004 本发明提供的重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQIDNO:1 所示，其轻链可变区的核酸序列如SEQIDNO:2所示。 0005 本发明提供的重组抗人c-Met单价抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所。

9、示。 0006 本发明解决的问题之二是采用重叠延伸PCR技术，以抗c-Met的中和抗体ch3E1D7 为亲本抗体，构建、表达并初步鉴定既有中和活性又能阻断c-Met二聚化的具有自主知识产权的抗人c-Met单价抗体。 0007 本发明提供重组抗人c-Met单价抗体，其完整重链核酸序列如SEQID:5所示，完整轻链核酸序列如SEQID:6所示，完整Knob链核酸序列如SEQID:7所示。 0008 本发明提供重组抗人c-Met单价抗体，其完整重链氨基酸序列如SEQID:8所示，完整轻链氨基酸序列如SEQID:9所示，完整Knob链氨基酸序列如SEQID:10所示。说明书。

10、1/4 页 3 CN 105884897 A 3 0009 本发明提供的重组抗人c-Met单价抗体基因序列在哺乳动物内进行了表达，并获得了目的抗体。 0010 以该序列为模板可以在保持特异性和亲和力的前提下进化成全人源抗体或人源化抗体以及各种具有应用前景的产品，如scFv,Fab等。 0011 本发明所提供的重组抗人c-Met单价抗体，能特异性的与肝细胞生长因子受体c- Met结合。并能阻断HGF与c-Met结合，为后续研发阻断HGF/c-Met信号通路进而抑制肿瘤生长的治疗性抗体奠定基础。附图说明 0012 图1为基因工程设计单价抗体示意图，其中VH：重链可变区； CH。

11、1：重链恒定区1； VL：轻链可变区； CL：轻链恒定区； Knobsintoholes：“杵臼” 结构。 0013 图2为抗人C-Met嵌合抗体ch3E1D7重链可变区、 IgG1-hole的CH-hole及单价抗体完整重链基因的PCR产物电泳图，其中(a)是ch3E1D7重链可变区及IgG1-hole的CH-hole （泳道1为DL2000Marker;泳道2为IgG1-hole的CH-hole基因约1000bp;泳道3为重链可变区条带339bp）， (b)是重叠PCR将CH-hole与VH两片段连接，形成c-Met单价抗体的完整重链（泳道1为DL2000Marker;泳。

12、道2为目的基因）。 0014 图3单价抗体的SDS-PAGE电泳图谱，其中(a)是还原性SDS-PAGE(其中泳道1是蛋白 marker;泳道2是单价抗体)， (b)是非还原性SDS-PAGE(其中泳道1是蛋白marker;泳道2是单价抗体)。 0015 图4是ELISA检测单价抗体与人c-Met的结合活性，其中横坐标是单价抗体浓度（ng/ml），纵坐标是为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（OD450）。 0016 图5是竞争ELISA检测单价抗体中和活性，其中横坐标是单价抗体浓度（ng/ml），纵坐标是为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（OD450）。

13、。具体实施方式 0017 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 0018 实施例1 293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所； CMV/IgG1-hole-flag、 CMV/IgG1- knob-his、 CMV/ch3E1D7-L、 CMV/ch3E1D7-H、 pRRL-CMV等质粒及c-Met胞外区融合蛋白（参见已发表文章）为本实验室保存；大肠杆菌感受。

14、态DH5 购自北京全式金生物技术有限公司；细胞培养基DMEM及胎牛血清购自Hyclone公司；各种限制性核酸内切酶、 phusion超保真PCR 试剂盒均为美国NEB公司产品； DNA凝胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒、内毒素纯化中抽试剂盒和TMB显色液均购自北京天根生化科技有限公司； NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒购自上海欣百诺生物科技有限公司；兔抗Flag-HRP多克隆抗体为华安生物产品；山羊抗人HGF生物素化多克隆抗体和重组人HGF蛋白为美国R&D公司产品；链霉亲和素-HRP抗体购自美国CellSignalingTechnology公司； ProteinA。

15、购自Amersham公司。说明书 2/4 页 4 CN 105884897 A 4 0019 c-Met单价抗体结构的设计以抗c-Met的中和抗体ch3E1D7为亲本抗体，设计单价抗体mono1H9F6。本研究设计了以下三条链：其中一侧抗体臂来源于亲本嵌合抗体ch3E1D7，即ch3E1D7的一条原始轻链不变；而ch3E1D7原始重链的CH3结构域中用三个小分子氨基酸代替三个大分子氨基酸，即T366S :L368A:Y407V，使CH3结构域上形成一个臼状结构，即 “hole” ；。另一侧Knob链是使人免疫球蛋白IgG1抗体的CH3结构域突出一个 “knob” ，。

16、即用一个大分子氨基酸Try代替一个小分子氨基酸Thr，如T366Y，形成一个杵状结构。改造后的两个CH3空间构象形成对应关系，只有含有 “hole” 的CH3结构域与含有 “knob” 的CH3结构域之间能形成稳定的异源二聚体，避免了抗体表达时出现的副产物组装，且突变后抗体具有与野生型相似的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。单价抗体结构图如图1所示。 0020 实施例2 c-Met单价抗体三条链慢病毒表达载体构建 Mono3E1D7的轻链，即ch3E1D7原始轻链，其慢病毒表达载体CMV/ch3E1D7-L由本实验室构建并保存。另一侧Knob链，是使IgG1的C。

17、H3结构域突出一个 “knob” 的杵状结构，且在其C 端加入His标签，其慢病毒表达载体CMV/IgG1-knob-his由本实验室构建并保存。本实验室保存有CMV/IgG1-hole-flag质粒，其CH3结构域上形成一个 “hole” 臼状结构，因此单价的重链需要将ch3E1D7重链可变区与IgG1-hole-flag的恒定区通过重叠延伸PCR技术（SOE-PCR）拼接起来。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其序列如下： P1引物序列（5 -3 ）： CACCGACTCTAGAGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACACC 。

18、（下划线所示是AgeI酶切位点）； P2引物序列（5 -3 ）： GTGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCT； P3引物序列（5 -3 ）： CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC； P4引物序列（5 -3 ）： TCCAGAGGTTGATTGTCGACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（下划线所示是SalI酶切位点，斜体是Flag标签）。 0021 先将ch3E1D7重链可变区和IgG1-hole-flag的恒定区分别以P1/P2和P3/P4为引物进行PCR扩增，反应产物经过1.5%琼脂糖。

19、凝胶电泳后纯化回收。再将ch3E1D7重链可变区VH 和IgG1-hole的恒定区CH-hole两个片段通过SOEPCR连接，再次电泳及PCR产物回收， PCR产物电泳图如图1所示。慢病毒表达质粒pRRL-CMV由AgeI和SalI-HF双酶切，割胶回收。将目的片段与载体用NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒进行同源重组连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 ，筛选阳性克隆进行测序鉴定。新的单价抗体重链pRRLCMV-mono3E1D7-H 用去除内毒素的质粒提取试剂盒纯化备用。 0022 实施例3 c-Met单价抗体mono3E1D7的表达、纯化与鉴定接种处于对。

20、数生长期的293T细胞，待细胞生长至50%60%融合时进行转染，单价抗体组将1.8 g慢病毒包装质粒混合物和1.9 g单价抗体表达质粒（CMV/ch3E1D7L、 pRRLCMV- mono3E1D7-H和CMV/IgG1-knob-his按照1:1:1的比例混合）用基础培养基重悬后，利用磷酸钙法将mono3E1D7三条链的慢病毒表达载体质粒转染293T细胞。以含有绿色荧光蛋白的载体pRRL-CMV-GFP转染293T细胞作为阳性对照，以未转染的293T细胞作为空白对照。慢病毒表达质粒与包装质粒混合物共转染293T细胞， 24h后可包装形成慢病毒，病毒颗粒进一步感说。

21、明书 3/4 页 5 CN 105884897 A 5 染293T细胞，将单价抗体基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到快速、持久表达目的蛋白的效果。病毒感染48h后收集293T细胞培养液， 10000rpm离心20min，离心后上清经0.45 m的滤膜过滤。将滤过的培养液与PBS缓冲液等体积混合，通过proteinA亲和层析纯化抗体。 BCA试剂盒进行浓度测定，纯化后的单价抗体分别在非还原（7.5%）和还原条件（10%）下用聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色鉴定抗体，检测其纯度和分子量大小。还原条件下 SDS-PAGE，单价抗体的二硫键断裂，其三条链出。

22、现了三个条带，分别对应分子量大小约 55KDa的重链、 25KDa的轻链以及30KDa的Knob链。在非还原条件下，二硫键不会断裂，三条链通过二硫键形成异源二聚体，因此单价抗体呈现一条带，大小约110KDa。且由于Knobsinto holes “杵臼” 结构避免了抗体表达时副产物组装，呈现较为单一的条带，如图3所示。综上所述，单价抗体纯化成功，且保证了结构的正确性和完整性。 0023 实施例4 c-Met单价抗体生物学功能的初步检测用CBS将c-Met胞外区融合蛋白稀释至5 g/ml， 4过夜包被。 PBST洗涤3次，用1%BSA 37封闭2h。将c-Met。

23、单价抗体加入酶标板中， 37作用2h，同时以PBS作为阴性对照， PBST洗涤3次。以兔抗Flag-HRP多克隆抗体作为测抗体， 37作用1h， PBST洗涤后每孔加入 100 lTMB显色液， 37避光显色10min，终止反应后酶标仪测定A450数值。 ELISA检测结果如图4所示，单价抗体可与抗原c-Met蛋白发生特异性的结合，且随着浓度的增加，信号逐渐增强，显著高于作为阴性对照的PBS组。由此证明，成功构建并表达了能与人c-Met抗原特异性结合单价抗体。 0024 实施例5 单价抗体体外阻断c-Met与HGF结合的生物学活性用CBS将c-Met胞外区融合蛋白稀释。

24、至5 g/ml， 4过夜包被。 PBST洗涤3次后，用1%BSA 37封闭2h。将不同浓度的单价抗体加入酶标板中， 37作用1.5h，同时以PBS作为阴性对照， PBST洗涤3次。将商品化重组人HGF蛋白稀释成15ng/ml，每孔100 l加入酶标板中， 37作用2h， PBST洗涤3次后，以山羊抗人HGF生物素化多克隆抗体作为检测抗体， 37 作用1h， PBST洗涤3次后，加入工作浓度的链霉亲和素-HRP， 37作用0.5h， PBST洗涤后每孔加入100 lTMB显色液， 37避光显色10min，终止反应后酶标仪测定A450数值。检测单价抗体是否具有与人HGF竞争。

25、性结合c-Met蛋白的能力。 ELISA结果显示，反应数值随单价抗体浓度的增加呈现下降趋势，即随单价抗体浓度的增加，显著抑制了人肝细胞生长因子与 c-Met的结合活性，如图5所示。结果说明c-Met单价抗体具有中和活性。说明书 4/4 页 6 CN 105884897 A 6 SEQUENCELISTING 同济大学苏州研究院抗c-Met单价抗体慢病毒快速表达及应用 2016 10 PatentInversion3.5 1 339 DNA 人工合成 1 caggtgcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatt60 。

26、tcctgcaaggcttctggctacagcttcacaagctacaatatacactgggtgaagcagagg120 cctggacagggacttgaatggattggatggatttctcctggaagtggtaatagtaagtac180 aatgagaggttcaagggcaaggccacactgacggcagacacatcctccagcacagcctac240 atgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcactctatttctgtgcaagatcgcat300 gactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca339 2。

27、 321 DNA 人工合成 2 gacattgtgatcacacagactacatcctccctgtccgcctctctgggagacagagtcacc60 序列表 1/14 页 7 CN 105884897 A 7 atcagttgcagggcaagtcaggacatttccaattatttaaactggtttcagcagaaacca120 gatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatca180 aggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaa240。

28、 gaggatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgtttcctccgacgttcggtgga300 ggcaccaagctggaaatcaaa321 3 113 PRT 人工合成 3 GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla 151015 SerValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheThrSerTyr 202530 AsnIleHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle 354045 GlyTrpIleSerProGlySerGlyA。

29、snSerLysTyrAsnGluArgPhe 505560 LysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspThrSerSerSerThrAlaTyr 65707580 序列表 2/14 页 8 CN 105884897 A 8 MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaLeuTyrPheCys 859095 AlaArgSerHisAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSer 100105110 Ser 4 107 PRT 人工合成 4 AspIleValIleThrGlnThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeu。

30、Gly 151015 AspArgValThrIleSerCysArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyr 202530 LeuAsnTrpPheGlnGlnLysProAspGlyThrValLysLeuLeuIle 354045 TyrTyrThrSerArgLeuHisSerGlyValProSerArgPheSerGly 505560 SerGlySerGlyThrAspTyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGln 65707580 序列表 3/14 页 9 CN 105884897 A 9 GluAspIleAlaThrTyrPheCysGlnGlnGly。

31、AsnThrPheProPro 859095 ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys 100105 5 1434 DNA 人工合成 5 atggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctc60 acaggatctagttccggacaggtgcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcct120 ggggcttcagtgaagatttcctgcaaggcttctggctacagcttcacaagctacaatata180 cactgggtgaagcagaggcctggacag。

32、ggacttgaatggattggatggatttctcctgga240 agtggtaatagtaagtacaatgagaggttcaagggcaaggccacactgacggcagacaca300 tcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgcactctat360 ttctgtgcaagatcgcatgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagcc420 tccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc480 acagcag。

33、ccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg540 aactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga600 ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctac660 atctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaa720 tcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg。

34、gggggaccg780 序列表 4/14 页 10 CN 105884897 A 10 tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag840 gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtac900 gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc960 acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag102。

35、0 tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa1080 gccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctg1140 accaagaaccaggtcagcctgtcctgcgcggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcc1200 gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg1260 gactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcac。

36、cgtggacaagagcaggtggcag1320 caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag1380 aagagcctctccctgtctccgggtaaagattacaaggatgacgacgataagtag1434 6 723 DNA 人工合成 6 atggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctc60 acaggatctagttccggagacattgtgatcacacagactacatcctccctgtccgcctct120 ctggg。

37、agacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacatttccaattatttaaac180 tggtttcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagatta240 cactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcacc300 序列表 5/14 页 11 CN 105884897 A 11 attagcaacctggagcaagaggatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgttt360 cctccgacgttcggtgg。

38、aggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatct420 gtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc480 ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctc540 caatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagc600 ctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgc6。

39、60 gaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt720 tag723 7 780 DNA 人工合成 7 atggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctc60 acaggatctagttccggagacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactc120 ctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcc180 cggacccctgaggtcaca。

40、tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag240 ttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag300 cagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg360 aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaa420 accatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc48。

41、0 序列表 6/14 页 12 CN 105884897 A 12 cgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatccc540 agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg600 cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaag660 agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac720 cactacacgc。

42、agaagagcctctccctgtctccgggtaaacatcaccatcaccatcactag780 8 477 PRT 人工合成 8 MetValSerTyrTrpAspThrGlyValLeuLeuCysAlaLeuLeuSer 151015 CysLeuLeuLeuThrGlySerSerSerGlyGlnValGlnLeuGlnGln 202530 SerGlyProGluLeuValLysProGlyAlaSerValLysIleSerCys 354045 LysAlaSerGlyTyrSerPheThrSerTyrAsnIleHisTrpValLys 505560 GlnAr。

43、gProGlyGlnGlyLeuGluTrpIleGlyTrpIleSerProGly 65707580 序列表 7/14 页 13 CN 105884897 A 13 SerGlyAsnSerLysTyrAsnGluArgPheLysGlyLysAlaThrLeu 859095 ThrAlaAspThrSerSerSerThrAlaTyrMetGlnLeuSerSerLeu 100105110 ThrSerGluAspSerAlaLeuTyrPheCysAlaArgSerHisAspTyr 115120125 TrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSerSerAlaSerTh。

44、rLysGly 130135140 ProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGly 145150155160 ThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProVal 165170175 ThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPhe 180185190 ProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValVal 195200205 ThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysA。

45、snVal 210215220 AsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLys 225230235240 序列表 8/14 页 14 CN 105884897 A 14 SerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeu 245250255 LeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThr 260265270 LeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspVal 275280285 SerHisGluAspP。

46、roGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyVal 290295300 GluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSer 305310315320 ThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeu 325330335 AsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAla 340345350 ProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluPro 355360365 GlnValTyrThrLeu。

47、ProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGln 370375380 ValSerLeuSerCysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAla 385390395400 序列表 9/14 页 15 CN 105884897 A 15 ValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThr 405410415 ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeu 420425430 ThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCy。

48、sSer 435440445 ValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSer 450455460 LeuSerProGlyLysAspTyrLysAspAspAspAspLys 465470475 9 240 PRT 人工合成 9 MetValSerTyrTrpAspThrGlyValLeuLeuCysAlaLeuLeuSer 151015 CysLeuLeuLeuThrGlySerSerSerGlyAspIleValIleThrGln 202530 ThrThrSerSerLeuSerAlaSerLeuGlyAspArgValThrIleSe。

49、r 354045 序列表 10/14 页 16 CN 105884897 A 16 CysArgAlaSerGlnAspIleSerAsnTyrLeuAsnTrpPheGlnGln 505560 LysProAspGlyThrValLysLeuLeuIleTyrTyrThrSerArgLeu 65707580 HisSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAsp 859095 TyrSerLeuThrIleSerAsnLeuGluGlnGluAspIleAlaThrTyr 100105110 PheCysGlnGlnGlyAsnThrPheProProThrPheGlyGlyGlyThr 115120125 LysLeuGluIleLysArgThrValAlaAlaProSerValPheIlePhe 130135140 ProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCys 145150155160 LeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysVal 165170175 AspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGln 180185190 。

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