技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术
华法林是常用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病(如心肌梗死、缺血性发作和血栓栓塞性静脉炎等)以及心脏人工瓣膜置换术和人工血管移植术等术后抗凝治疗。目前临床常以凝血酶原时间(PT)及国际标准化比率(INR)作为其抗凝监测指标。但是华法林有效治疗窗很窄，个体差异大(不同患者所需剂量可相差20倍)，初始剂量很难掌握，如果剂量不足将无法预防血栓栓塞，剂量稍大则会导致出血的危险(引起致命性和严重出血发生率分别为1.3%和7.2%)。华法林的临床应用需要经过多次调整剂量方可达到目标INR值(范围在2.0~3.0之间最佳)，这个剂量摸索的时间常常需要数周。
近年来随着遗传药理学与药物基因组学的快速发展，研究发现影响华法林用药剂量个体差异的主要原因是遗传因素。研究表明影响华法林代谢的代谢酶细胞色素P4502C9(CYP2C9)和华法林的作用靶点环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)这两个
基因单核苷酸多态性(SNP)可解释约50%的华法林用药剂量个体差异，对指导华法林合理应用具有巨大的临床指导意义。
细胞色素P450酶系(CYP450s)是一组结构和功能相关的超家族酶系，约60％的药物是由CYP450s代谢清除的。大量研究表明，CYP450s基因多态性是造成药物代谢个体和种族差异的基础。华法林主要由细胞色素P450酶系代谢，其中CYP2C9酶对华法林的代谢最为重要。华法林有两种构象：R和S。其中S-华法林的作用占60~70％，而R-华法林只有30~40％。S-华法林主要由CYP2C9代谢成无活性的代谢产物。CYP2C9基因多态性对华法林用药剂量个体差异有显著影响。CYP2C9基因型包括CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5，其中对华法林代谢影响最重要的是*2和*3基因型。CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)突变导致CYP2C9酶活性降低，其活性仅为野生型的5％，这种突变降低了酶活性使其底物的清除率降低，血药浓度升高。因此，需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。在黄种人群中CYP2C9*2的突变率几乎为零，而CYP2C9*3基因型突变率为3%~10%。
维生素K在维生素K环氧化物还原酶复合物(VKORC)的作用下由环氧化形式转化为氢醌形式(KH2)，参与维生素K依赖的凝血因子II、VII、IX、X及抗凝蛋白C和S的活化。VKORC亚单位1(VKORC1) 是一种多成分脂蛋白酶系统，位于内质网膜上，是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶。VKORC1是华法林的作用靶点，华法林通过抑制其活性，阻碍维生素K由环氧化物形式转化成氢醌形式，从而阻断上述凝血因子的活化，达到抗凝作用。目前已经有了大量VKORC1基因多态与华法林剂量相关性的研究报道。在亚洲人群中研究结果显示，VKORCI的基因多态对华法林剂量差异的影响达到了16-30%。其中VKORC1启动子的基因多态性-1639G>A (rs9923231)是影响华法林需求剂量种族差异和个体差异的主要原因。在VKORC1-1639G>A rs9923231基因多态性中，G和A等位基因的发生频率分别为80.5%和19.5%；而与A等位基因相比，G等位基因增加了近40%的酶活性。VKORC1酶活性的增加，还原性维生素K生成和凝血因子生成也增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果。
综上CYP2C9和VKORC1基因多态性是影响华法林需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒将为华法林的临床个体化治疗起到积极的推动作用。
尽管目前用于检测华法林用药剂量相关的基因多态性的方法比较多，如聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶酶解片段长度多态性(RFLP)、实时荧光定量聚合酶链式反应、核酸序列扩增实验法、基因芯片等，这些方法比较快速、灵敏，但准确度不够，并且交叉污染问题相对比较严重。
焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
药物代谢酶CYP2C9和华法林作用靶点VKORC1基因多态性是影响华法林剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床华法林个体化用药治疗的用药基因CYP2C9（SEQ ID NO.1）和VKORC1（SEQ ID NO.2）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测华法林个体化用药相关基因SNP。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物：
（1）扩增引物：
VKORC1 -1639G>A (rs9923231)上游引物：5′-AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT-3′（SEQ ID NO.3）；
CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910) 上游引物：5′- AGC CAC ATG CCC TAC ACA G -3′（SEQ ID NO.4）；
VKORC1 -1639G>A (rs9923231)下游引物：5′-GTC AAG CAA GAG AAG ACC TG-3′（SEQ ID NO.5）；
CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)下游引物：5′- CCC GGT GAT GGT AGA GGT TTA -3′（SEQ ID NO.6）；
其中，下游引物的5′进行生物素标记；
（2）测序引物：
VKORC1 -1639G>A (rs9923231)测序引物：5′- GTG AGC CAC CGC A -3′（SEQ ID NO.7）；
CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910) 测序引物：5′- CAC GAG GTC CAG AGA TA -3′（SEQ ID NO.8）；
试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。
一种应用上述试剂盒检测华法林用药基因多态性的方法，包括如下步骤：
（1）DNA提取；
（2）聚合酶链反应：
配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 10.0μl， dNTP 3.0μl，上游引物 1.0μl， 下游引物1.0μl， rTaq1.0μl，水30.0μl，模板4.0μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95 oC 5min预变性；然后依次在95oC 30S, 52oC 30S, 65oC 30S,进行38个循环；再在72oC 保持5min，最终保持在4 oC，得扩增产物；
（3）焦磷酸测序单链样本纯化；
（4）焦磷酸测序及结果分析。
本发明的试剂盒对VKORC1 -1639G>A (rs9923231)目标序列和CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)目标序列进行分析和检测；其中，VKORC1 -1639G>A (rs9923231)目标序列包括：野生型GCACCCGGCCAATGG（SEQ ID NO.9）和突变型GCACCTGGCCAATGG（SEQ ID NO.10），扩增出的片段长度为290bp；CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)目标序列包括：野生型CATTGACCTT（SEQ ID NO.11）和突变型CCTTGACCTT（SEQ ID NO.12），扩增出的片段长为210bp。
由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对华法林个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上华法林个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
附图说明
图1为本发明VKORC1 -1639GG (rs9923231)焦磷酸测序结果；
图2为本发明VKORC1 -1639GA (rs9923231)焦磷酸测序结果；
图3为本发明VKORC1 -1639AA (rs9923231)焦磷酸测序结果；
图4为本发明CYP2C9*3 1075AA (rs1057910)焦磷酸测序结果；
图5为本发明CYP2C9*3 1075AC (rs1057910)焦磷酸测序结果；
图6为本发明CYP2C9*3 1075CC (rs1057910)焦磷酸测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。
实施例1：
VKORC1 -1639G>A (rs9923231)上游引物：5′-AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT-3′（SEQ ID NO.3）；
CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910) 上游引物：5′- AGC CAC ATG CCC TAC ACA G -3′（SEQ ID NO.4）；
VKORC1 -1639G>A (rs9923231)下游引物：5′-GTC AAG CAA GAG AAG ACC TG-3′（SEQ ID NO.5）；
CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)下游引物：5′- CCC GGT GAT GGT AGA GGT TTA -3′（SEQ ID NO.6）；
VKORC1 -1639G>A (rs9923231)测序引物：5′- GTG AGC CAC CGC A -3′（SEQ ID NO.7）；
CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910) 测序引物：5′- CAC GAG GTC CAG AGA TA -3′（SEQ ID NO.8）；
1. DNA提取
1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
(1) 检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√； (2)异丙醇（如无，可用无水乙醇替代）和75% 乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；
1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；
1.713,000rpm室温离心20秒；
1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；
1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；
1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；
1.13 移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；
1.14 移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；
1.15 13,000rpm室温离心1min；
1.16 打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
1.17 移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
1.18 13,000rpm室温离心1min；
1.19 打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
1.20 在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；
1.21 目测沉淀大小，加入50~100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22 过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解DNA。
1.23 在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24 保存核酸标本至4℃冰箱；
2.聚合酶链反应
2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系（模板添加除外），各组分及添加量如下表：
注：上游引物和下游引物各有两种，这里的1.0μl是指每种上游引物各加0.5μl，以及每种下游引物各加0.5μl。
2.2 在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加4.0μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；
2.3 在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：
2.4 设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；
2.5 点击“start”开始仪器运行。
3.焦磷酸测序单链样本纯化
3.1 纯化前试剂和仪器准备：
进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。
3.2单链样本纯化操作：
3.2.1在PSQ 96板中先加40 μlAnnealing Buffer和2~3μl测序引物(10uM)；
3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；
3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；
3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；
3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；
3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；
3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml 70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；
3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；
3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；
3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的Sepharose Beads；
3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；
3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；
3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；
3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；
3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；
3.2.16 Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads；
3.2.17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。
3.3纯化完毕后清洗：
3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；
3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；
3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；
3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；
3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。
4. 焦磷酸测序
4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；
4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；
4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。
5. 焦磷酸测序结果分析
在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测VKORC1 -1639G>A (rs9923231)和CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)基因多态性，焦磷酸检测结果如图1~6。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对VKORC1 -1639G>A (rs9923231)和CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)基因多态性进行检测和判读。图1~3提示VKORC1 -1639G>A (rs9923231)分别为野生型纯合子、突变型杂合子、突变型纯合子，图4~6提示CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)为野生型纯合子、突变型杂合子、突变型纯合子。临床医生可根据VKORC1 -1639G>A (rs9923231)和CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)基因多态性，判断出不同基因型患者使用华法林治疗时的疗效和毒副反应。
综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测VKORC1 -1639G>A (rs9923231)和CYP2C9*3 1075A>C (rs1057910)基因多态性，能够满足临床检验实际工作的要求，利于华法林的个体化使用。
SEQUENCE LISTING
<110> 周宏灏
<120> 焦磷酸测序法检测华法林个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1003
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (501)..(501)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
taagaggtcc ttcaccagcc tcctctcccg gcattatccc atctacccct ccacattcaa 60
gtttttggaa agattctaca ctcccagtct ctacttcctc acttcttcct tgctgcccac 120
gccataaact agctgctgcc tccagcattg ccctgacacc tagtggctgg tgtcaccaag 180
acgctagacc caatggttat ttatttattt atttacttat tttgagacgg agtctcactc 240
tgtcgcccag gctggagtgc agcggtgcca tctcggctca ctgcaacttc cgcctccagg 300
gttcaagtgg ttctcgtgcc tcagcctccc aagtagtttg gactacaggt gcctgccacc 360
atgtctggct aatttttgta tttttagtag agacagggtt tcaccatgtt ggccaggctt 420
gtcttaaact cctgacctca agtgatccac ccacctcggc ctcccaaaat gctaggatta 480
taggcgtgag ccaccgcacc nggccaatgg ttgtttttca ggtcttctct tgcttgactt 540
cccagaggga tcccttactg ttgcacctac ccttctggga actctcttcc tctggcgtct 600
gtgatatttc cctctcctgc tggctcctcc ctctccagat gctgtttctc acatctactc 660
tcttctagag agtgtgtggt agacagaata atggtcacca aagatgtccc tgcatgaatc 720
cctggaactt gtgaatatga taggttaaat ggccaaaagg gaattaaggt tgcagatgga 780
attaagctga ccaatctcct gattttattt tattttattt tgtttttgag gtggagtttc 840
gctcttgttg cccaactgga gtgcaatggt gtgatctcgg ctcactgcaa cctccgcctg 900
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