本发明涉及新型试剂、含有所述新型试剂的药物组合物和它们在治疗、特别是抗 微生物和抗癌治疗中的应用。特别是，本发明涉及新型肽类化合物，所述新型肽类化 合物令人惊讶地表现出对细胞、特别是细菌和癌细胞的生长和/或活力的抑制效果。 本发明的新型肽已显示对细菌和癌细胞具有细胞毒性效果和对肿瘤生长的抑制。所述 肽或其模拟物因而可用于癌症治疗或用作抗微生物剂，更特别是用作抗癌剂或抗细菌 剂。本发明还提供了包括使用本发明肽的治疗方法和非治疗方法。
癌症是其中细胞显示出不受控制的生长并侵入和破坏邻近组织的病况。在一些情 况中癌细胞转移并迁移至其他部位，形成继发性癌位点。癌症可影响所有年龄的人， 对于大多数类型的癌而言风险随年龄增长。2007年所有人类死亡中，由癌症导致的 占约13%(760万)。实际上，仅美国每年就有600,000人死于癌症。
癌症由细胞的遗传物质异常引起。这种异常可能是由于致癌物的影响造成，例如 烟草的烟雾、辐射、化学物质或传染性病原体。其他导致癌症的遗传异常可能通过 DNA复制中的错误而随机发生或遗传，并因此自出生起就存在于所有细胞中。癌症 的遗传力通常受到致癌物和宿主基因组间的复杂相互作用的影响。
已知人的免疫系统可以识别并破坏癌细胞，这主要通过受体介导的机制进行 (1–3)。然而，尽管有免疫系统监视，但癌细胞能够逃避宿主免疫控制，因此通常需 要对癌症进行外科干预或治疗。
由于对医药的研究和进展，大多数癌症可以以某些形式进行治疗，少数癌症可以 治愈，这取决于具体类型、部位和阶段。一旦诊断，通常通过外科手术、化疗和放疗 的组合对癌症进行治疗。不过，多数癌症不能通过传统方法治愈，因而需要对癌症患 者的替代性治疗。宿主免疫控制通常由宿主防御产生的细胞裂解性阳离子多肽介导， 这以及其他因素一起导致了在癌症治疗中使用抗癌肽的提议。这种肽最初因其在清除 细菌中的作用而被发现(4-7)。然而，肿瘤似乎通过尚且未知的受体介导的机制避免 了这些宿主控制机制(8-13)。
已知对癌细胞显示出抑制效果的肽("抑制性肽")可强力结合带负电的膜(4,5, 14–18)，随后发生膜的裂解(19,20)。通常许多抗癌肽是阳离子性的。癌细胞的质膜含 有少量的带负电的磷脂酰丝氨酸(3%～9%;参考文献21,22)，因此癌细胞比大多数非 恶性真核细胞带有稍多的负电。细胞膜组成的这种微小差异是否可以解释一些阳离子 性肽优选杀死癌细胞的能力还不清楚(23–25)。
表面暴露的磷脂酰丝氨酸还可以充当由先天免疫效应物(如单核细胞)将癌细胞 从血流中清除的标志物，不过是通过完全不同的(受体介导的)机制(26)。本领域中已 经提出，阳离子性肽对肿瘤细胞的实际破坏是以下两个过程之一的结果：(i)细胞质膜 破裂引起的对坏死的诱导(20,25)或(ii)肽与线粒体膜的结合触发对凋亡的诱导(9,27)。 本领域中所描述的许多抗癌肽据信可通过涉及细胞裂解的机制发挥其效应。
尽管某些这类肽在体外有有力的抗癌活性，但体内研究受到限制。目前，仅有少 数研究是利用能够破坏癌细胞膜并随后引起癌细胞死亡的肽在体内进行。这些研究包 括(i)以细胞裂解肽对实体肿瘤进行系统性治疗，但仅将所述细胞裂解肽与导航(靶向) 域缀合或将其用作前肽(12,27)，这是因为细胞裂解实体在血清中无活性和缺乏肿瘤 特异性；(ii)以爪蟾抗细菌肽及其D型氨基酸对映体治疗卵巢癌，但仅将其以高剂量 进行腹膜内注射(28)；和(iii)以抗人乳癌异种移植物的69个氨基酸的成孔肽进行肿瘤 内施用(11)。
由于有限的固有局部活性或其不能到达完整动物体内较大的转移物，所有这些治 疗对散播的转移物(27)仅有轻微影响(如果有的话)。目前，对于细胞毒性肽对癌细胞 的选择性和其对其他健康器官的毒性还没有深入研究。然而，对于一种称为D-K6L9 的肽(十五聚体D,L-氨基酸短肽)，已经显示出肿瘤内注射对原发性人前列腺癌生长的 抑制，并且不会影响邻近的非恶性细胞(13)。在小鼠中已经显示出，肽D-K6L9在系 统性施用时特异性靶向并抑制原发性肿瘤和转移性肿瘤的生长。该肽似乎通过去极化 细胞裂解机制作用于胞膜中的磷脂酰丝氨酸。
因此，虽然在抗癌肽领域已经取得一些进展，但仍需要可有效破坏或抑制癌细胞 生长并且对非癌细胞不显示细胞毒性的新型肽。
如上所述，开发抗癌肽的工作主要集中于细胞裂解性抗微生物肽，许多这种肽已 显示出针对不同类型癌细胞的体外作用。所述肽在包括昆虫、两栖动物和哺乳动物在 内的生物的先天免疫中具有核心作用。实例包括人的防御素、杀菌肽、杀菌肽-爪蟾 抗细菌肽杂合物、爪蟾抗细菌肽，以及与导航域和前肽缀合的所述肽。如上所论述， 这些肽优选结合并破坏带负电的作为细菌胞膜的主要成分的磷脂膜。
诸如细菌等微生物是导致多种传染病的原因，并每年导致大量死亡。例如，致病 菌导致结核等疾病。由于微生物引起多种传染病，并且致病菌的耐药性是现代医学面 临的严重问题，急需针对微生物的新型的替代性治疗。
本发明针对这些需要提供了新型肽类化合物，所述肽类化合物是惊人地有效的新 型抗癌剂和抗微生物剂。
因此，已经设计了新型肽，并且基于此新型肽的肽令人惊讶地显示出可有效在体 外抗击癌细胞和细菌细胞，和有效在体内抑制肿瘤生长。如以下实施例所述，基于此 新型肽序列的肽显示出针对多种癌细胞系的细胞毒性活性，同时显示出对正常细胞的 极低活性和低毒性。还显示出针对各种细菌物种的细胞毒性效应，包括革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌。此外，在癌症动物模型中观察到了强抗肿瘤效应，对肿瘤生长具有 显著明确的抑制效应。经治疗的动物与未治疗组相比具有显著的活力优势，实际上研 究表明所述动物的肿瘤可能已被治愈。因此，已经展示出惊人的抗癌或抗肿瘤效果(在 这个意义上，"抗癌"用来表示对癌细胞的负面影响，更具体来说是对癌细胞的生长和 /或活力的负面影响，更具体而言是对癌细胞的细胞毒性效应)。
本发明人最初试图基于已知肿瘤抑制蛋白的氨基酸序列来设计具有“肿瘤抑制 物”效果的肽。因此希望设计可结合肿瘤抑制物蛋白的受体并从而阻断肿瘤生长的肽。 制备了一组共96种肽，并筛选抗癌和抗微生物活性。在该筛选中鉴定出了构成本发 明基础的肽，其为仅有的三种显示出显著活性水平的肽中的一种。本发明的肽显示出 针对癌细胞和微生物细胞的出人意料的高细胞毒性活性，在癌细胞的情况中在体外和 体内均显示出所述出人意料的高细胞毒性活性。令人惊讶的是，考虑到肽库设计的基 本原理，发现所述肽具有细胞裂解活性、破坏癌细胞的胞膜并裂解细菌。此外，还惊 人地观察到了凋亡效应，表明所述肽可能触发或引起凋亡。如上所述，进一步研究表 明这种抗癌效果可能对癌细胞有选择性，使非癌细胞保持完好，这对于癌症治疗非常 有利，在癌症治疗中治疗、例如化疗的不利副作用通常较大。本发明的肽类化合物还 已经显示出根除了数种细菌菌株，并且可以提供针对多耐药性细菌的有效工具。
根据这些惊人的不可预料的结果，本发明人在此提出了基于这一新型肽序列(即， 序列SEQ ID NO.1)的肽和肽类化合物可用于治疗癌症和微生物感染，更一般而言还 可用作抗微生物剂、包括非治疗用途的抗微生物剂，例如用以抗击微生物感染或建群， 例如作为消毒剂等，其中SEQ ID NO.1为
KTLRVAKAIYKRYIE(SEQ ID NO:1)
因此，本发明的一个方面提供了寡肽化合物，所述寡肽化合物包含：
(i)SEQ ID NO.1的氨基酸序列的全部或一部分；或
(ii)与SEQ ID NO:1的序列同一性为至少85%的氨基酸序列；或
(iii)作为SEQ ID NO:1的逆序列的全部或一部分(即，SEQ ID NO:2： EIYRKYIAKAVRLTK的全部或一部分)的氨基酸序列，或者作为与SEQ ID NO:1的 序列同一性为至少85%的氨基酸序列的逆序列；
其中所述化合物具有抑制癌细胞和/或微生物细胞的生长和/或活力的活性(即，能 够或有效抑制癌细胞和/或微生物细胞的生长和/或活力)。换言之，所述化合物可能具 有抗肿瘤活性或抗微生物活性，在抗微生物活性中优选抗细菌活性。
下文中将要描述的是，本发明的寡肽化合物可以有利地具有额外的寡肽序列，该 另外的寡肽序列具有“细胞穿透”活性(如以下所进一步限定)。特别是，优选基于 HIV-TAT肽的所述细胞穿透寡肽序列。以下实施例中研究了在这一基础上设计的肽， 其表现出特别有效。
因此，在一个优选方面，本发明提供了寡肽化合物，所述寡肽化合物包含：
(i)氨基酸序列YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE(SEQ ID NO:40)的全部 或一部分；或
(ii)与SEQ ID NO:40序列的序列同一性为至少85%的氨基酸序列；或
(iii)作为SEQ ID NO:40的逆序列的全部或一部分(即，SEQ ID NO.41 EIYRKYIAKAVRLTKGRRRQRRKKRGY的全部或一部分)的氨基酸序列，或者作为 与SEQ ID NO:40序列的序列同一性为至少85%的氨基酸序列的逆序列的氨基酸序 列，
其中所述化合物具有抑制癌细胞和/或微生物细胞的生长和/或活力的活性(即，能 够或有效抑制癌细胞和/或微生物细胞的生长和/或活力)。换言之，所述化合物可能具 有抗肿瘤活性或抗微生物活性，在抗微生物活性中优选抗细菌活性。
SEQ ID NO:40的寡肽化合物对应于连接到SEQ ID NO:1的N端的SEQ ID NO:36 (见下文)的HIV-TAT序列。
本发明的寡肽化合物因此对细胞、特别是癌细胞或微生物细胞、尤其是细菌的生 长和/或活力具有抑制效果。所述化合物因此具有细胞生长抑制活性或细胞毒性活性， 优选细胞毒性活性，特别是针对癌细胞或微生物细胞、例如针对肿瘤的细胞生长抑制 活性或细胞毒性活性。在一方面，所述化合物是抑细菌剂或杀细菌剂，优选杀细菌剂。
对于细胞“抑制生长”表示降低、更特别是显著降低了细胞生长的任何方面，所 述细胞生长的任何方面包括细胞尺寸的增加或细胞成分的量和/或体积的增加，但更 优选为细胞数量的增加。术语“生长”因此明确包括细胞的复制或繁殖。可以降低细 胞生长速度，例如细胞数量增加的速度。作为代表性实例，生长(例如，细胞数量或 生长速度)可以降低至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。在某些情况中，生长 可以降低100%，即，生长停止或完全抑制。因此，细胞的复制或复制可能降低或被 抑制。因此，术语“抑制”包括任何程度的生长下降(例如，与不存在所述寡肽化合 物的情况下观察到的生长相比)。可以将复制或繁殖速度以传代时间进行评估或表示， 特别是在微生物细胞的情形中(即，微生物产生其自身的拷贝所需的时间)。对于癌细 胞，生长可以通过确定细胞数量来评估或通过评估肿瘤尺寸或其生长速度来评估。
对于细胞“抑制活力”包括降低细胞活力的任何效应，或使得细胞更不容易生存 或无法存活的任何效应。细胞的活力可以视为细胞在给定条件下生存的能力。特别地， 其包括杀死或破坏细胞，即，使细胞死亡。死亡可以通过以下因素评估：不能生长(包 括不能复制)或不能利用或同化营养；细胞或者含有所述细胞的组织(例如肿瘤)的的形 态改变，例如坏死可以作为证据。通常，如果细胞膜完整性丧失，则可认为细胞死亡。
术语“细胞生长抑制”和“细胞毒性”可以进行类似解读。
本领域中公知确定癌细胞或微生物细胞的活力或生长的方法。用许多常规测试可 确定细胞是否活着(存活)或死亡。一个选择是将细胞置于正常情况下可支持该细胞生 长的条件下，并通过适合的标准方法监测细胞的生长，例如监测细胞的尺寸、细胞的 形态、随时间变化的细胞数量、培养基中营养的消耗等。另一选择是对细胞进行细胞 死亡形态特征的评估，例如坏死或凋亡体、膜出泡、核聚缩和DNA断裂为尺寸均匀 的片段、破裂的细胞壁或膜和细胞内容物泄露到细胞外环境中。
其他方法利用了死亡细胞中细胞膜完整性的特征性丧失。通常使用不可透膜的染 料(例如台盼蓝和碘化丙啶)来评估膜的完整性。这些染料被完整细胞排斥，因此在这 些细胞中不发生染色。如果细胞膜完整性被破坏，这些染料可以进入细胞并对细胞内 组分染色。作为选择，或作为补充，使用只对具有完整膜的细胞染色的染料来指示细 胞的活力。Invitrogen Ltd的Live/Dead Assay是使用两种染料的测试，一种对死细胞 染色，另一种对活细胞染色。评估膜完整性的另一种方式是检测细胞成分例如乳酸脱 氢酶在培养基中的释放。
另一种选择是测定细胞的代谢。这通常可以以多种方式完成。例如，可以测定 ATP水平。只有具有完整膜的活细胞可以合成ATP，并且由于ATP不储存在细胞中， 细胞死亡使ATP水平迅速下降。对ATP水平的监测因此指示出细胞状态。再一种选 择是测定细胞的还原电位。代谢营养物的活细胞利用还原反应，因此通过对细胞应用 可给出是否处于还原形式或氧化形式的不同结果的标志物(例如荧光染料)，可以评估 细胞的还原电位。缺乏还原标志物的能力的细胞可被视为死亡。MTT和MTS测试是 这种测试的合适实例。
“抗肿瘤”效应或活性可被视为对肿瘤的生长和/或活力的影响。该术语包括对 肿瘤的任何负面效果或活性。肿瘤细胞可以被杀死或破坏。肿瘤的生长可以被抑制， 例如可使肿瘤不能生长，或可使肿瘤生长速度降低(例如，与以该化合物治疗前的肿 瘤相比，或与同等的或相应的未经治疗的肿瘤相比)。肿瘤尺寸可以减小，或者在有 利的情况下，肿瘤可以完全消失(即，消融或毁灭)。抗肿瘤效果在某些情况下可以包 括降低癌细胞从肿瘤扩散的效果，例如，可以降低肿瘤的代谢能力。肿瘤的其他致病 性质或行为也可以降低，例如其侵袭或浸润周围组织的能力。
参考以上定义，“抗微生物”活性表示任何杀死或毁灭微生物或抑制微生物生长 的效应，类推抗细菌活性是任何杀死或毁灭细菌或者抑制细菌生长的效应。
有利的是，本发明的寡肽化合物直接作用于细胞，即，其可直接抑制细胞的生长 和/或活力。“直接”是指化合物不用募集生理系统或机制(例如，免疫系统)来发挥其 效力(例如，其细胞毒性或细胞生长抑制效力)。相反，所述化合物直接作用于细胞。
为了辅助本发明的寡肽化合物以便发挥其效力，或促进这种效力，或者在有些情 况下使其能够发挥这种效力，可以对该化合物提供要素从而促进或改善其向细胞的运 送，或使得其能够被运送到细胞(细胞内运送)。
因此，在一个实施方式中，寡肽化合物还包含细胞穿透序列(细胞穿透肽)。在该 实施方式的优选方面，寡肽化合物包含基于HIV-TAT序列(特别是47位至58位氨基 酸)的细胞穿透序列。
因此，可以看出在所述实施方式中，本发明的寡肽化合物可以采取构建体的形式， 所述构建体包含(即，含有)本发明的寡肽化合物以及细胞穿透序列或肽。因此在这一 方面，本发明可以看作提供含有本发明的寡肽化合物以及至少一种细胞穿透肽的构建 体。在“细胞穿透肽”的语境中使用时，术语“肽”不仅限于具有肽键的肽，其还包 括下文进一步论述的其他的肽样化合物或肽类化合物，例如肽模拟结构体。换言之， “细胞穿透肽”可以包括具有细胞穿透活性的任何寡肽化合物。
因此，细胞穿透肽可以是起着将寡肽化合物输送到细胞中或跨过细胞膜(即，进 入细胞内部)的作用的序列。因此，其可以是所谓的“细胞穿透”序列(或者更具体而 言是“细胞穿透肽”)，本领域中也称为蛋白转导域(PTD)或蛋白转导序列。
因此，如上所述，本发明的优选实施方式是包含以下(i)和(ii)的构建体：(i)本文所 定义的本发明的寡肽化合物；(ii)细胞穿透序列(更具体而言是细胞穿透肽)。
细胞穿透肽(CPP)技术近年来有很大发展，现有技术中已知并描述了多种细胞穿 透肽，并且实际中许多此类肽可商购。细胞穿透肽的尺寸、序列和电荷以及事实上其 作用机制(对于一些细胞穿透肽作用机制目前未知，对于其他细胞穿透肽而言作用机 制未得到完全明晰)可以有很大不同，但均具有跨越胞膜并将所附着或关联的部分(所 谓的“被运载物”)运送到细胞的胞浆中、在某些情况下甚至运送到细胞核中的共同 能力。CPP因此是肽类运送载体。
CPP可以来源于能够跨越细胞膜的天然存在的蛋白(例如果蝇的同源框蛋白 Antennapedia(一种转录因子))、病毒蛋白(例如HIV-1转录因子TAT和来自HSV-1的 衣壳蛋白VP22)；或者CPP可以合成得到，例如由嵌合蛋白或合成多肽(如多聚精氨 酸)获得。如上所述，对于转导效果并没有单一的机制，因此CPP的设计可以基于不 同结构和序列。Jarver等对细胞穿透肽在2006Biochimica et Biophysica Acta 1758,第 260-263页中进行了综述，下表1列出了各种代表性肽。US 6,645,501还描述了可使 用的各种细胞穿透肽。
表1
基于HIV-TAT序列的序列以及HIV-TAT及其片段代表可用于本发明的一类优选 的CPP。US 5,656,122中描述了基于TAT的各种CPP。下文实施例中所用的示例性 HIV-TAT肽是YGRKKRRQRRRG(SEQ ID.No.36)，并且其构成了本发明的优选形 式，但容易理解的是可以使用更长或更短的TAT片段。HIV-TAT的氨基酸序列可以 被修饰和/或截短，或者所述肽可以进行化学修饰，或制备逆序列类似物、反式序列 类似物或逆序-反式序列类似物，同时保持其细胞穿透活性。
另一类细胞穿透肽是表1所示的基于约16氨基酸穿膜素序列的源自 Antennapedia的CPP(Antp类)，该16个氨基酸穿膜素序列对应于Antennapedia蛋白 的第三环，并且据显示其负责蛋白转位。对穿膜素作为运输载体已经进行了深入开发， 特别包括用于药物用途，已经提出并描述了多种穿膜素衍生物和修饰序列。具体可参 见WO 91/1891、WO 00/1417、WO 00/29427、WO 2004/069279和US 6,080,724。因 此，穿膜素的该16氨基酸序列可以被修饰和/或截短，或可以对该肽进行化学修饰， 或制备其逆序列类似物、反式序列类似物或逆序-反式序列类似物，同时保持其细胞 穿透活性。
如上所述，对于所用的CPP而言，没有共有的特定结构特征或序列基序。然而， 可以通过特定特征来识别各类CPP，例如具有两亲性且带净电荷为负电的肽。其他类 别的CPP可具有显示高α-螺旋含量的结构。另一类别可以是以碱性氨基酸含量高为 特征的肽。CPP因此可以是或者可包含碱性氨基酸例如精氨酸的寡聚体，例如5～20 个、6～15个或6～12个R残基，例如R7(SEQ ID NO:35)、R8(SEQ ID NO:37)或 R11(SEQ ID NO:38)或QSR8(SEQ ID NO:39)。
富含脯氨酸的两性肽是另一类CPP，并且Pujals等在2008Advanced Drug Delivery Reviews 60,473-484页中描述了特征为存在吡咯烷环的这种肽。
其他成功开发的CPP包括pVEC(Elmquist等，2003Biol.Chem 384,387-393页; Holm等，2005Febs Lett.579,5217-5222页)和源自降钙素的肽(Krauss等，2004Bioorg. Med.Chem.Lett.,14,51-54页)。
商售的CPP包括基于Pep-1肽的Chariot(Active Motif，法国)、基于protegrin肽 PG-1的Syn-B载体(Syntem,法国)和基于MPG肽的Express-si Delivery(Genospectra, 美国)。
除了可公开获得的和报道的CPP，可以根据已知的或所报道的标准来设计和合成 新型的或衍生化CPP肽(例如，已知的CPP序列或特征，例如上述的碱性氨基酸含量、 α-螺旋含量等)。另外，可以对随机涉及的肽或其他肽筛选CPP活性，例如通过将含 有报告分子(例如，可检测的标签或标记，例如荧光标记)的这种肽与所需的被运载物 (本发明的寡肽化合物)偶联或接合，并检测该构建体是否被转运跨越胞膜，例如通过 在活细胞中添加这些肽然后利用例如共聚焦显微镜来检测细胞输入来进行。
实际上，虽然通常情况是CPP可几乎穿透或进入任何细胞类型，但在一些情况 下观察到成功的或有效的运输可能取决于被运载物(例如被运载物肽序列)和/或所用 CPP的确切性质或依赖于该性质而有所变化。确定最佳的肽序列和组合等，以及检测 和/或修饰被运载物和/或CPP序列或结构等均属于本领域技术人员的常规技术。
本发明的代表性寡肽化合物(或构建体)因此可包括：
(a)第一寡肽序列，该第一寡肽序列包括：
(i)SEQ ID NO.1的氨基酸序列的全部或一部分；或
(ii)与SEQ ID NO:1序列的序列同一性为至少85%的氨基酸序列；或
(iii)作为SEQ ID NO:1的逆序列的全部或一部分(即，SEQ ID NO:2： EIYRKYIAKAVRLTK的全部或一部分)的氨基酸序列，或者作为与SEQ ID NO:1的 序列同一性为至少85%的氨基酸序列的逆序列；和
(b)第二寡肽序列，该第二寡肽序列是细胞穿透肽序列。
成分(b)可以选自上述的任何CPP，更特别是选自任何基于HIV-TAT或由其衍生 的序列。
CPP(即，上述定义的成分(b))可以附接于或设置在寡肽化合物的N端或C端， 但优选其位于N端。因此，成分(a)和(b)可以以任何顺序接合或连接，但优选顺序为 (a)-(b)。
本发明的寡肽化合物(或构建体)的成分或元件可以根据本领域公知技术以任何 合乎需要的或方便的方式来相互接合或连接。因此，所述成分或独立部分可以利用例 如已知的化学偶联技术来通过化学方式连接或缀合，或可以利用遗传工程技术(例如， 形成融合蛋白的技术)将构建体作为单一整体形成，或可以利用例如肽合成技术将它 们简单地整体合成。
可以将不同部分或成分直接相互连接，或将它们通过一个或多个连接子(或间隔 子)序列间接连接。因此，连接子序列可以将化合物的两部分(或寡肽构建体中的两个 独立成分)间隔开或分离。连接子序列的确切性质并不关键，其可具有可变的长度和/ 或序列，例如其可以具有0～15个、0～12个、0～10个、0～8个、0～6个、0～4 或0～3个残基，例如1个、2或3或更多个残基。作为代表性实例，连接子序列如 果存在则可具有1～15个、1～12个、1～10个、1～8个、1～6或1～4个残基等。 残基的性质无关紧要，其可以是例如任何氨基酸，例如中性氨基酸，或脂肪族氨基酸， 或其可以是疏水性的，或极性的或带电荷的或形成结构的，例如脯氨酸。示例性的连 接子序列因而可以包括任何单氨基酸残基，例如A、I、L、V、G、R、Q、T或W， 或由所述残基组成的二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。
当寡肽化合物含有作为SEQ ID NO:1(或者其具有至少85%序列同一性的功能等 同的变体)的逆序列的序列时，则优选CPP(例如成分(b))的序列也为逆序，并且其以 逆序接合。换言之，包含两个部分的整个化合物(或构建体)的序列是逆序。然而，不 排除只有一个部分是逆序的情况，或者两个部分均为逆序但以“非逆序”的顺序接合 的情况。
本发明的代表性优选化合物可具有如下序列：
YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE (SEQ ID NO:40)
本发明的化合物可包括含有以下组分的化合物：
(i)氨基酸序列SEQ ID NO:40的全部或一部分；或
(ii)与SEQ ID NO:40序列的序列同一性为至少85%的氨基酸序列；或
(iii)作为SEQ ID NO:40的逆序列的全部或一部分(即，SEQ ID NO.41 EIYRKYIAKAVRLTKGRRRQRRKKRGY的全部或一部分)的氨基酸序列，或者作为与 SEQ ID NO:40序列的序列同一性为至少85%的氨基酸序列的逆序列的氨基酸序列。
本发明的癌细胞可以是来自任何癌的细胞，例如任何下述癌。其可以是肿瘤细胞。 所述细胞可以是临床肿瘤或癌组织中的细胞，或来自所述组织的细胞，或来自癌细胞 系的细胞。
本文所用术语"微生物细胞"包括任何微生物。因此，所述细胞可以是任何真核或 原核细胞，并包括细菌、真菌、藻类、古细菌和原生动物。该术语因此包括通常为单 细胞的生物，但其可具有在某些条件下组织为简单协作集落或结构体的能力，如纤丝、 菌丝或菌丝体(但不是真正的组织)的能力。微生物可以来自微生物的任何纲、属或种。 原核微生物的实例包括但不限于，包括支原体在内的细菌(例如，革兰氏阳性细菌、 革兰氏阴性细菌或或革兰氏测试无反应的细菌)，以及古细菌。真核微生物包括真菌、 藻类和其他被归类或已经归类为分类学中的原生生物界或被视为是原生生物的微生 物，其包括但不限于，例如原生动物、硅藻、原生植物和真菌样霉。所述微生物可以 是需氧的或厌氧的。所述微生物可以是致病性的或非致病性的，或者是腐败微生物或 指示微生物。在特别优选的实施方式中，所述微生物具有致病性。
多重抗药性生物(MDRO)通常是不受临床剂量的典型抗生素影响的细菌。对三类 以上抗生素耐药的细菌通常称为MDRO。本发明的寡肽化合物可用于治疗或预防 MDRO感染，例如具有多重抗药性(MDR)的沙门氏菌、弯曲菌、大肠杆菌、葡萄球 菌和肠球菌。MRSA是多重抗药性细菌的实例。在本发明的一个实施方式中，微生物 细胞是多重抗药性细菌。
细菌或真菌代表了优选微生物细胞的种类，特别是细菌。
细菌属或种的实例包括但不限于：乏养菌、无色杆菌、氨基酸球菌、食酸菌、鼻 疽不动杆菌、放线杆菌、放线棒菌、马杜拉放线菌、放线菌、气球菌、气单胞菌、阿 菲波菌、土壤杆菌、产碱杆菌、差异球菌、异单胞菌、无枝酸菌、拟无枝酸菌、厌氧 螺菌、棍状厌氧菌、蛛菌、隐秘杆菌、弓形菌、节杆菌、阿托波氏菌、金杆菌、拟杆 菌、巴氏丝菌、巴尔通氏体、伯杰氏菌、双歧杆菌、嗜胆菌、疏螺旋体、博德特氏菌、 短弓螺菌、短芽孢杆菌、短杆菌、短波单胞菌、布鲁氏菌、伯克氏菌、布丘氏菌、丁 酸杆菌、鞘杆菌、弯曲杆菌、二氧化碳嗜纤维菌、心杆菌、卡托氏菌、西地西菌、纤 维单胞菌、蜈蚣菌、衣原体、鞘发菌、色杆菌、金黄杆菌、金色单胞菌、柠檬酸杆菌、 梭菌、柯林斯菌、丛毛单胞菌、棒杆菌、考克斯氏体、隐藏杆菌、戴尔福特菌、皮杆 菌、嗜皮菌、脱硫单胞菌、脱硫弧菌、戴阿里斯特菌、偶蹄形菌、狡诈球菌、狡诈菌、 爱德华氏菌、埃格特菌、埃里希氏体、艾肯菌、稳杆菌、肠杆菌、肠球菌、欧文氏菌、 丹毒丝菌、埃希氏菌、真杆菌、艾文氏菌、微小杆菌、费克蓝姆菌、产线菌、黄色单 胞菌、黄杆菌、佛朗西斯氏菌、梭杆菌、加德纳氏菌、球链菌、孪生球菌、戈登氏菌、 嗜血菌、哈夫尼菌、螺杆菌、嗜盐球菌、霍尔德曼氏菌、不活动粒菌、约翰森氏菌、 金氏菌、克雷伯氏菌、库克菌、科泽氏菌、科特氏菌、特氏科泽菌、乳杆菌、乳球菌、 劳特洛普氏菌、勒克氏菌、军团菌、勒米诺氏菌、钩端螺旋体、纤毛菌、明串珠菌、 利斯特氏菌、利斯顿氏菌、巨球型菌、甲基杆菌、微杆菌、微球菌、光岗菌、弯动杆 菌、米勒氏菌、莫拉氏菌、摩根氏菌、分歧杆菌、支原体、香味菌、奈瑟氏球菌、诺 卡氏菌、类诺卡氏菌、苍白杆菌、厄氏菌、寡源杆菌、东方体、类芽孢杆菌、泛菌、 副衣原体、片球菌、消化球菌、消化链球菌、发光杆菌、光杆状菌、邻单胞菌、卟啉 单胞菌、普雷沃氏菌、丙酸杆菌、变形菌、普罗维登斯菌、假单胞菌、假诺卡氏菌、 假支杆菌、嗜冷杆菌、拉恩氏菌、拉尔氏菌、红球菌、立克次氏体、罗卡利马氏体、 玫瑰单胞菌、罗氏菌、瘤胃球菌、沙门氏菌、月形单胞菌、小蛇菌、雷氏菌、希瓦氏 菌、志贺氏菌、芯卡体、史雷克氏菌、鞘氨醇杆菌、鞘氨醇单胞菌、螺菌、葡萄球菌、 寡养单胞菌、口腔球菌、链杆菌、链球菌、链霉菌、琥珀酸弧菌、萨特菌、萨顿氏菌、 塔特姆氏菌、替册氏菌、特拉布斯氏菌、密螺旋体、托菲利马菌(Tropheryma)、冢村 氏菌、苏黎世菌、尿支原体、漫游球菌、韦荣氏菌、弧菌、威克斯氏菌、沃林氏菌、 黄单胞菌、致病杆菌、耶尔森氏菌和预研菌；例如，革兰氏阳性菌，如结核分支杆菌、 牛分支杆菌、鼠伤寒分支杆菌(M.typhimurium)、牛分支杆菌BCG菌株、BCG亚株、 鸟分支杆菌、非洲分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、海洋分支杆菌、鸟分支杆菌副结核亚 种、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马葡萄球菌、化脓性葡萄球菌、无乳链球菌、 单核球增多性李斯特菌、伊氏利斯特菌、炭疽杆菌、枯草杆菌、星形诺卡菌、以色列 放线菌、痤疮丙酸杆菌和肠道球菌，以及革兰氏阴性菌，如破伤风梭菌、产气荚膜梭 菌、肉毒芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、溶血巴斯德氏菌、 多杀性巴斯德氏菌、嗜肺军团菌、伤寒沙门菌、流产布鲁氏菌、沙眼衣原体、鹦鹉热 衣原体、博内特科克斯菌、埃希氏大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血 杆菌、杜克氏嗜血桿菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、埃希氏大肠杆菌、希拉肠 球菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、土拉热弗朗西丝氏菌、脆弱类杆 菌、具核梭杆菌、反刍类考德里氏体。
因此，对于代表性实例，微生物细胞可以是葡萄球菌、假单胞菌、军团菌、分支 杆菌、变形菌、克雷伯氏菌、梭杆菌等菌属的细菌或其他肠道和大肠的菌。
微生物细胞还可以是真菌或来自真菌，包括例如可分类或已分类为原生生物的真 菌，例如假丝酵母属、曲霉属、肺囊虫属、青霉属和镰刀霉属等的真菌。代表性的真 菌种包括但不限于，白色假丝酵母、杜氏假丝酵母、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、 烟曲霉、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌、卡氏肺囊虫、马尔尼菲青霉菌、 链格孢菌。
微生物细胞还可以是或来自藻类，例如包括可以归类或已经归类为原生生物的海 藻。代表性的海藻种包括胶毛藻、原始小球藻、盾鞘藻、散生鞘毛藻、单核红藻 (Cyanidioschyzon merolae)、隐毛藻(Aphanochaete)、胶带藻、鞘藻、波吉卵囊藻、颤 藻、Paradoxia multisitia、席藻、色球藻、隐杆藻、脆杆藻、卵形藻、舟形藻、桥弯 藻、三角褐指藻以及蓝藻(蓝绿藻)和硅藻，例如谷皮菱形藻。
微生物细胞可以是原生动物，例如阿米巴变形虫、孢子虫、纤毛虫和鞭毛虫类群 的成员。代表性原生动物包括弓形虫种，例如刚地弓形虫；疟原虫种，例如恶性疟原 虫、间日疟原虫、三日疟原虫；锥形虫种，例如布氏锥形虫、克氏锥形虫；利士曼原 虫种，例如硕大利士曼原虫；和内阿米巴虫种，例如痢疾内阿米巴虫。
优选所述微生物细胞选自以下属：柠檬酸杆菌、肠杆菌、埃希氏菌、哈夫尼菌、 雷氏菌、耶尔森氏菌、消化链球菌、拟杆菌、假单胞菌、军团菌、葡萄球菌、肠球菌、 链球菌、克雷伯氏菌、假丝酵母、变形菌、伯克氏菌、梭杆菌和分枝杆菌，例如金黄 色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜肺军团菌、白色假丝酵母、铜绿假单胞菌、洋葱伯克 霍尔德氏菌和化脓性葡萄球菌。
在另一方面，本发明提供了编码上述涉及本发明的寡肽化合物的肽的核酸分子， (即，具有或包含下述(i)或(ii)或(iii)的肽：
(i)SEQ ID NO:1或40的氨基酸序列的全部或一部分；或
(ii)与SEQ ID NO:1或40的序列同一性为至少85%的氨基酸序列；或
(iii)作为SEQ ID NO:1的逆序列的全部或一部分(即，SEQ ID NO:2:或41的全 部或一部分)的氨基酸序列，或者作为与SEQ ID NO:1或40的序列同一性为至少85% 的氨基酸序列的逆序列的氨基酸序列)。本发明还提供了所述核酸分子的互补物。在 优选实施方式中，核酸分子还编码上述的细胞穿透肽。
本发明的核酸分子优选包含至少30个核苷酸，优选不超过800个核苷酸，更优 选不超过700个、650个、600个、550个、500个、450个、400个、350个、300 个、250个、200个、150个、100个或50个核苷酸。核酸分子优选是分离的分子。
另一方面涉及含有本发明所述核酸分子的载体。载体可以含有其他常见载体中的 元件，例如复制起点、可选择标记物如抗生素抗性和/或多克隆位点。载体还可以是 表达载体，并且可包含其他元件，例如用于核酸分子表达的转录和/或翻译控制或调 节元件。所述控制元件是本领域中公知的，并且已有广泛描述，例如启动子、核糖体 结合位点、增强子、终止子等。
载体例如可以是质粒或病毒，优选其选自逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。
在另一方面，提供了含有上述核酸分子和/或载体的重组宿主细胞。宿主细胞可 以是动物细胞，例如哺乳动物细胞，如大鼠、鼠类或人的细胞，或者其可以是微生物 细胞，例如细菌细胞。
“重组”是指核酸分子和/或载体已经引入到宿主细胞中。
在另一方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文定义的寡肽化合物、 本文定义的核酸分子和/或本文定义的载体，以及药理学(制药)可接受的赋形剂。
赋形剂可以包括本领域已知的任何赋形剂，例如任何载剂或稀释剂或任何其他成 分或试剂，例如缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、粘合剂、包衣剂、崩解剂、填料、芳香 剂、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂和/或甜味剂等。
赋形剂可以选自，例如乳酸、右旋糖、焦亚硫酸钠、苯甲醇、聚乙二醇、丙二醇、 微晶纤维素、乳糖、淀粉、脱乙酰壳聚糖、预胶凝化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、葡萄糖 结合剂(dextrates)、糊精、右旋糖、磷酸氢钙二水合物、磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、 麦芽糊精、甘露醇、粉末状纤维素、氯化钠、山梨糖醇和/或滑石。
因此，根据所要治疗或预防的病况和/或所要取得的效果、所要治疗的患者等， 寡肽化合物可以通过不同途径输送。因此，可以选择例如输送途径或施用方式，从而 提供系统的或局部的效果。因此，例如寡肽化合物可以以系统性输送的方式来施用于 受试对象，例如通过口服或胃肠外途径施用。作为选择，并且在某些情况下优选的是， 可以将寡肽化合物局部输送或施用于感染部位或癌部位，例如局部施用于肿瘤。因此， 根据癌症部位(例如肿瘤)的病程，可以向癌症部位(例如肿瘤)局部输送或直接施用， 例如通过注射、输注或吸入等。在癌症治疗中优选局部施用。
可以提供本领域已知的任何形式的药物组合物，例如片剂、胶囊剂、包衣片、液 体剂、悬浮剂、片剂(tab)、囊袋剂、植入体、吸入剂、粉末剂、丸、乳剂、冻干剂、 泡腾剂、喷射剂、油膏、乳剂、软膏剂、硬膏剂或其任何混合形式。可以将其提供为 例如耐胃液制剂和/或持续作用形式。其可以为适合口服、胃肠外、局部、直肠、生 殖器、皮下、经尿道、经皮、鼻内、腹膜内、肌肉内和/或静脉内施用的形式和/或用 于吸入的形式。
药物组合物可以为适合脂质体施用的形式，因此可提供含有药物组合物的脂质 体。当使用脂质体时，可以不必包含其他赋形剂，因此还提供了包含本文定义的寡肽 化合物、本文定义的核酸分子和/或本文定义的载体的脂质体。
本发明的另一方面提供了对抗癌症和/或微生物感染、特别是细菌感染的方法， 所述方法包括对有需要的受试对象施用(特别是施用有效剂量的)本文定义的寡肽化 合物或本文定义的核酸分子。
在另一方面，提供了可用于治疗、特别是用于对抗癌症和/或微生物感染(特别是 细菌感染)的本文定义的寡肽化合物或本文定义的核酸分子。
在另一方面，提供了本文定义的寡肽化合物或本文定义的核酸分子在制备用于对 抗癌症和/或微生物感染、特别是细菌感染的药物中的应用。
本文所用的术语“对抗”包括治疗和预防。更特别的是，本发明因此提供了治疗 癌症的方法和应用，例如治疗肿瘤和/或对抗微生物感染、特别是细菌感染的方法和 应用。
因此本发明的寡肽化合物(包括构建体)在癌症和/或微生物感染的治疗或控制中 具有治疗学用途。因此，其可用作抗癌剂，或者更特别地用作抗肿瘤剂和/或抗微生 物剂、更特别是抗细菌剂。
因此，所述寡肽化合物可用于治疗任何可受益于本发明化合物的细胞毒性效果的 病况(病况在本文中宽泛的用于包括任何疾病或异常或者任何临床状况)。所述寡肽化 合物因此在任何靶向细胞(特别是癌细胞，例如肿瘤细胞)和/或微生物(特别是细菌)的 疗法(或治疗)中具有用途。
本文所用的术语“治疗”广泛地指在控制临床病况中有益的效果或步骤(或干预 手段)。治疗可以包括与治疗前的病况或症状相比降低、减轻、改善、延缓所治疗的 病况或其一种或多种症状的进展，或消除所治疗的病况或其一种或多种症状，或者任 何改善受试对象的临床情况的方式。治疗可以包括有助于治疗程序或治疗方案的或者 作为治疗程序或治疗方案的一部分的任何临床步骤或干预手段。
“预防(prevention)”或“预防疗法(prophylaxis)”可以包括与例如施用化合物前 的病况或症状相比延迟、限制、降低或防止病况或病况的发作，或其一种或多种症状。 因此预防确切地包括绝对防止病况或其症状的发生或发展，以及对病况或其症状的发 作或发展的任何延迟，或对病况或其症状的发展或进展的降低或限制。
本发明的治疗因此包括杀死细胞、抑制或延迟细胞的生长或者细胞体或细胞群的 尺寸的增加(例如，组织中的、肿瘤的或生长的细胞)，降低细胞数量或防止细胞扩散 (例如扩散至另一解剖学部位)，降低细胞生长的大小等。术语“治疗”不隐含治愈或 完全终止或消除细胞生长或细胞的生长。
包括了对各种类型癌症的治疗，例如包括实体瘤和血癌。因此本文中术语“癌” 广泛地用于包括任何赘生性病况，恶性的、恶性前期的或非恶性的赘生性病况。癌症 的代表性类型包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头颈部 癌、鳞状细胞癌、胃肠癌、乳癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非霍奇 金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、 急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、脑癌(例如星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、髓 母细胞瘤)、神经母细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、肛门癌、膀胱癌、胰腺 癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、尤因肉瘤、黑 色素瘤和其他皮肤癌。
还可以举出窦肿瘤、尿道癌和泌尿生殖系癌、食道癌、骨髓瘤、内分泌癌和纤维 肉瘤，和任何良性或恶性的外周或中枢神经系统的肿瘤，包括神经胶质瘤和神经母细 胞瘤。
特别关注的癌包括脑癌、肺癌、乳癌和结肠癌以及黑色素瘤。
如以下实施例所显示的是，本发明的化合物可具有细胞毒性效果，特别是对抗癌 细胞或肿瘤和/或对抗微生物细胞、特别是细菌的细胞毒性效果。
更具体而言，所述化合物能够选择性靶向癌细胞。换言之，本发明的化合物具有 对癌细胞的选择性，并因此其可对正常(非癌)细胞没有影响或影响极小。这样，可以 有利地避免不想要的对肺癌细胞的细胞毒性效果。本发明的化合物因此优选显示出对 癌细胞的选择性。所述细胞可以在实体瘤中，或者可以是转移的细胞。本发明的化合 物优选不对非癌细胞显示出细胞毒性。
另外在癌症治疗的情况下，本发明的化合物优选有效改善存活或延长存活，例如 以实验动物模型进行评价的那样，例如在已经引发了肿瘤或已经引入了肿瘤或肿瘤细 胞的动物中。以下实施例描述了这样的动物模型。此外，所述化合物优选有效抑制肿 瘤生长，例如根除肿瘤或减小肿瘤尺寸或使肿瘤症状停止或减缓，例如在上述动物模 型中。作为选择或作为补充，化合物还优选有效预防或减少肿瘤的扩散或肿瘤的转移 潜力。这同样可以在上述动物模型中评价。
本发明的化合物可以引起癌细胞的裂解和/或凋亡。下述实施例显示当对各种细 胞类型应用本发明的化合物时可观察到裂解效应和凋亡效应。因此，本发明的化合物 可引起癌(肿瘤)细胞的裂解。裂解由细胞膜崩解所致，这导致细胞死亡。确定细胞裂 解的方法对本领域技术人员而言是已知的。下述实施例表明所述方法如何进行。
作为选择或作为补充，本发明的化合物可以引起癌细胞凋亡。凋亡是程序性细胞 死亡(PCD)的过程，可发生于多细胞生物中。程序性细胞死亡涉及导致特征性细胞形 态变化和死亡的一系列生物化学事件；包括：出泡、细胞膜的变化，例如膜不对称性 和附着的丧失、细胞皱缩、核片段化、染色质凝集和染色体DNA片段化。确定细胞 是否经历或已经经历凋亡的实验是本领域公知的(见以下实施例)。本发明的化合物对 癌细胞可以具有裂解性和/或凋亡性，优选同时具有二者。
在本发明的优选方面，本发明的寡肽化合物具有对抗细菌的细胞毒性，即，杀菌 剂。实施例中显示了本发明化合物对各种细菌的裂解。本发明化合物可用于治疗或预 防任何微生物感染，包括以上列出的任何微生物，但优选细菌、包括以上列出的任何 细菌。特别是，所述感染可以是病原体感染。值得注意的是由柠檬酸杆菌、肠杆菌、 埃希氏菌、哈夫尼菌、雷氏菌、耶尔森氏菌、消化链球菌、拟杆菌、假单胞菌、军团 菌、葡萄球菌、肠球菌、链球菌、克雷伯氏菌、假丝酵母、变形菌、伯克氏菌、梭杆 菌和分枝杆菌，例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜肺军团菌、白色假丝酵母、 铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌和化脓性葡萄球菌引起的感染。
感染可以是急性的，或者可以是慢性的，例如持续至少5或至少10天、特别是 至少20天、更特别至少30天、最特别至少40天的感染。
在一个实施方式中，本发明的这一方面可以包括将受试对象诊断为具有发展出感 染的风险或可受益于对现有感染进行治疗的候选者的步骤。
所包括的有对败血症、感染性休克、脓毒症、脑膜炎或微生物毒素(例如霍乱毒 素和肉毒菌毒素)中毒的治疗，以及对更局部的感染(例如特定部位、组织或器官的感 染)的治疗。
任何受试对象均可发生感染，但一些受试对象比其它受试对象对感染更易感。对 感染易感的受试对象包括但不限于上皮和/或内皮屏障被削弱和/或受损的受试对象， 对微生物感染的分泌类防御废弃、损坏、削弱或破坏的受试对象，和免疫受损、免疫 缺乏或免疫抑制的受试对象(即，其免疫系统的任何部分都不能正常工作或工作低于 正常的受试对象，换言之，免疫响应或免疫活性的任何部分降低或受损的受试对象， 而无论是因为疾病或临床干预或其他治疗或任何方式所引起)。
对感染易感的受试对象的代表性实例包括但不限于：具有预先建立的感染(例如， 细菌、病毒、真菌或寄生虫如原生动物引起的感染)的受试对象，尤其是带有HIV的 受试对象、患有脓毒症的受试对象和感染性休克的受试对象；免疫缺陷的受试对象， 例如准备进行、正在进行化学治疗和/或放射治疗或者正在从化学治疗和/或放射治疗 中恢复的受试对象，器官(例如骨髓、肝脏、心脏、心脏瓣膜、肾脏等)移植受试对象 (包括自体移植、同种异基因移植和异种移植物患者)、患有AIDS的受试对象；入住 卫生保健机构、例如医院的受试对象，尤其是在重症监护或病危监护的受试对象(即， 涉及对患者提供生命支持或器官支持的病室)；遭遇创伤的受试对象；烧伤的受试对 象；带有急性和/或慢性伤口的受试对象；新生儿受试对象；年长的受试对象；患有 癌症的受试对象，尤其是患有免疫系统癌症(例如白血病、淋巴瘤和其他血液学癌症) 的受试对象；患有例如类风湿性关节炎、I型糖尿病、克罗恩氏病等自身免疫病况的 受试对象，尤其是那些接受针对这些疾病的免疫抑制治疗的受试对象；表皮或内皮的 分泌(例如，粘液、泪液、唾液)降低或终止和/或分泌清除(例如，具有对粘液组织的 功能性较差的纤毛的受试对象和/或具有粘液过粘的患者(例如，吸烟者和患COPD、 支气管炎、囊性纤维化、肺气肿、肺癌、哮喘、肺炎或鼻窦炎的患者)降低或终止的 受试对象，和装配有医疗设备的受试对象。
因此，所具有的感染可特别根据本发明进行抗击的受试对象包括因以下情况 而受损的患者：灌注较差、反复创伤、营养不良、氧合情况较差或白细胞功能障碍。
特别注意的是遭受过物理创伤的受试对象。创伤本身可引起该受试对象的表皮和 /或内皮屏障的弱化或受损，或者受试对象可响应于创伤而变得免疫受损(休克响应)。 术语“创伤”泛指由外来物体对细胞的攻击和/或细胞的物理损伤。外来物体中包括 微生物、颗粒物和化学试剂等。物理损伤中包括机械损伤；热损伤，例如由过热或过 冷导致的损伤；电损伤，例如通过接触电势源而造成的损伤；和辐射损伤，例如由长 期、广泛接触红外、紫外或电离辐射造成的损伤。
特别注意的还有烧伤的受试对象。任何烧伤、特别是严重烧伤对受试对象的表皮 和/或内皮屏障的完整性具有重大影响，并且该受试对象通常会响应于烧伤而变得免 疫受损(休克响应)。
典型的引起烧伤的因素是极端温度(例如，处于极端温度的火以及液体和气体)、 电、腐蚀性化学物、摩擦和辐射。暴露的程度和时间以及该因素的强度/力度导致不 同严重性的烧伤。烫伤(即，高温液体和/或气体相关的创伤)被认为属于烧伤。
本发明因此可用于治疗或预防急性或慢性伤口的感染。急性伤口是依次经过愈合 过程的3个公认阶段(即，炎性阶段、增殖阶段和重塑期)进行并且没有时间拖延的创 伤。相反，慢性伤口是指由于伤口停滞于某个愈合阶段而没有完成愈合过程的有序生 物化学事件序列的伤口。通常，慢性伤口停留在炎性阶段。慢性伤口可以定义为在至 少40天、特别是至少50天、更特别至少60条、最特别至少70天内没有愈合的伤口。 伤口由于缺乏表皮屏障并且具有可用于微生物附着和建群的基质和表面，因此是感 染、特别是慢性感染的理想环境。问题在于，伤口的感染通常进一步延迟愈合，因此 使得伤口对已建立的感染更易感。
所述化合物因此可用于治疗在体内或体表任何地方发生的感染。因此，在另一实 施方式中，所述感染可以是医疗设备、特别是留置型医疗设备的感染。
根据本发明所述化合物可用作口腔卫生保健剂，例如用于控制牙菌斑，例如通过 杀死菌斑中的微生物或抑制所述微生物的复制或生长而减少牙菌斑或者预防、降低或 延迟其发展。藻酸盐寡聚体也可用于治疗和预防可发生于口腔中的感染或传染病，例 如牙龈炎和牙周炎。
本发明的化合物可用作预防性治疗，例如预防感染或污染(例如病原体引起)或使 感染或污染(例如病原体引起)风险至少最小化。这可用于住院患者的护理，这是因为 本文所述化合物的预防性给药可以将接触医院感染源(通常称为医院相关性/获得性感 染或卫生保健相关感染)的风险最小化，例如金黄色葡萄球菌、青霉素耐药性金黄色 葡萄球菌(MRSA)、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、难辨梭状芽孢杆 菌、结核分枝杆菌和万古霉素耐药性肠球菌的风险。本发明的这一方面对于遭受创伤 的受试对象、烧伤受试对象和有伤口的受试对象的护理特别有用，上述受试对象如上 所述比未受到相似影响的受试对象更易感于微生物感染。
寡肽化合物的“制药有效”量是提供了对靶细胞可测量的效果(例如，细胞毒性 或细胞生长抑制效果)和/或对所靶向的病况可测量的效果的量。优选其是足以直接杀 死细胞或抑制细胞生长的量。所述量可以参考决定给药量的标准实践确定，并且本领 域技术人员能够根据其经验和其所能利用的常规测试的辅助来检测成功治疗的证据。
受试对象可以是任何人或非人的动物受试对象，但更特别可以是脊椎动物，例如 选自哺乳动物、鸟、两栖动物和爬行动物的动物。所述动物可以是家畜或驯养动物或 有商业价值的动物，包括实验室动物或动物园或狩猎公园的动物。因此，代表性动物 包括狗、猫、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、马、猪、绵羊、山羊、牛、鸡、火鸡、珍珠鸡、 鸭、鹅、鹦鹉、虎皮鹦鹉、鸽、鲑鱼、鳟鱼、鳕鱼、黑线鳕、鲈鱼和鲤鱼。因此，涵 盖了本发明的兽医用途。受试对象可以视为患者。优选受试对象是人。
如上所述，就化合物的抗微生物效果而言，本发明不限于医疗用途(即，治疗或 预防感染)，并且涵盖了非医疗用途，例如用以对抗微生物污染或建群(例如，在没有 生命的位置或部位处，在没有生命的位置或部位中或在没有生命的位置或部位上)， 例如用于消毒或清洁的目的的用途。
因此，更一般而言，本发明包括抑制微生物细胞(或者微生物)的活力和/或生长的 方法，所述方法包括使所述细胞(或者微生物)接触本文此前定义的寡肽化合物。特别 是，该方法是体外方法。因此，该方面可以替代性地视为在没有生命的部位抑制微生 物活力和/或生长的方法，或抗击微生物污染或建群的方法，所述方法包括使所述部 位接触本文此前定义的寡肽化合物。本文所用的“抗击”包括抑制(即，降低或预防) 微生物污染或建群，以及处理已有的污染或建群。
术语“接触”涵盖将化合物向微生物或位点的任何方式的直接或间接输送，因此 涵盖了将化合物应用于微生物或位点、或者将微生物或位点暴露于化合物的任何方 式，例如将化合物直接应用于微生物或位点。
更特别是，微生物或位点将接触有效量的藻酸盐化合物，更特别是可有效直接抑 制微生物的生活力(例如，杀死)或直接抑制微生物的生长的量的所述化合物。
微生物的位点或部位没有限制。微生物可以存在于表面。位点不受限制，包括其 上或其中存在微生物的任何位点，或可以暴露于微生物接触或污染的任何位点。因此， 特别包括机械、特别是工业机械或医疗设备(上的位点)，或暴露于水环境的任何位点 (例如海事设备，或船或艇或其部件或成分)，或暴露于该环境的任何部分的任何位点， 例如管道或建筑物上的位点。这种暴露于微生物接触或污染的无生命的位点特别包括 以下的任何部分：食品或饮料加工、制备、储存或分配的机械或设备，空调装置，工 业机械，例如化学或生物技术加工厂中的工业机械，储存罐、医疗或外科设备和细胞 与组织培养设备。用于携带或运输或输送材料的任何装置或设备均易受到微生物污 染。所述表面特别包括管道(该术语在本文中用于泛指包括任何导管或管线)。代表性 无生命或非生命表面包括但不限于食品加工、储存、分配或制备设备或表面、槽、传 送带、地板、排水管、冷却器、冷冻器、设备表面、壁、阀、带、管道、空调导管、 冷却设备、食品或饮料分配管线、热交换器、艇体或艇结构的任何暴露于水的部分、 牙科水线、石油钻井管道、隐形眼镜和存储盒。
如上所述，医疗或外科设备或装置代表了特定的一类其上可形成微生物污染的表 面。这可以包括任何类型的管线，包括导管(例如，中心静脉管和尿管)、假体，例如 心脏瓣膜、人工关节、假牙、牙冠、牙帽和软组织植入物(例如，乳房植入物、臀部 植入物和嘴唇植入物)。包括任何类型的可植入(或"留置型")医疗装置(例如，支架、 子宫内装置、起搏器、插管用管、修补物或假体装置、管线或导管)。“留置型”医疗 装置可以包括其中其任何部分包含在体内的装置，即，该装置可以整个或部分被留置。
所述位点可以为食品，例如牛肉、禽肉、猪肉、蔬菜、水果、鱼、贝和其组合等； 个人卫生产品，洗漱用品、化妆品等；化学或工业品和试剂等；临床、科研或工业废 料等。因此，所述化合物可以用作材料、特别是液体和溶液中的防腐剂或防污染剂。
在本发明的某些有利实施方式中，所述化合物可以与第二抗微生物剂或其它抗微 生物剂(下文称为“另外的抗微生物剂”)联合或组合使用。
在医疗用途的情况下，所述抗微生物剂可以是任何临床有用的抗微生物剂，特别 是抗生素或抗病毒剂或抗真菌剂。在非临床使用的情况中，所述抗微生物剂同样可以 是任何用于所述目的的抗微生物剂，例如任何消毒剂、防菌剂、清洁剂或消毒剂。所 述试剂可以分开使用，也可以在同一组合物中共同使用，同时或依次或分开使用，例 如以任何理想的时间间隔分开使用。
对抗微生物剂的选择当然需要适于所涉及的治疗或应用，但可以使用例如抗微生 物剂，例如抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、防腐剂，和/或消毒条件例如照射(例如， UV、X-射线、γ射线)、极端的温度和极端的pH。
其它抗微生物剂可方便地在上述化合物之前、同时或之后应用。方便的是，所述 其它抗微生物剂基本上在上述化合物的同时或之后应用。为了使所述其它抗微生物剂 的抗微生物效果最优化，可以将其在适合所用试剂的时间点重复给予(例如，施用或 输送)。本领域技术人员能够设计适合的给药或使用方案。在长期治疗中，所述化合 物也可以重复使用。所需的频率取决于微生物、位点、疾病、有效性、组成和所用的 抗微生物剂等，并且本领域技术人员能够优化给药或使用方式，从而优化结果。
相似地和类似地，在本文所述癌症治疗的情况中，本发明的化合物可以与其它抗 癌剂组合或结合使用，所述其它抗癌剂例如有化学治疗剂或抗肿瘤剂或任何可指示肿 瘤学或血液病学指征的试剂。
因此，本发明的化合物可以与其它治疗剂组合使用，例如在单一药物制剂或组合 物中共同施用，或分开施用(即，分开、依次或同时施用)。因此，本发明的化合物可 以与第二(或额外的)治疗活性剂组合，例如组合在药物试剂盒中，或作为组合的("组 合")产品。
因此，本发明的另外的方面提供了含有本文定义的寡肽化合物或核酸分子和第二 活性剂(例如，抗癌或抗微生物剂)的作为组合制剂的产品，以用于分开、同时或依次 使用(例如，应用于微生物或位点和/或施用于受试对象)，从而抑制癌细胞或微生物细 胞的活力和/或生长，或更特别用于治疗癌症或抗击微生物感染或位点的微生物污染 或建群，或实际上任何本文所述或所限定的应用。
将寡肽化合物或核酸分子引入细胞的适合方法为本领域技术人员所公知。例如， 下文将简述一些适合的方法。如上文所详述，肽介导的输送方法可以使用特别的细胞 穿透肽(CPP)，如上所述其是短序列并且在一些情况下为聚阳离子性序列，其能够帮 助含有CPP或与CPP连接的肽、蛋白或核苷酸分子的细胞摄入，例如通过增强哺乳 动物细胞的内体中的摄入来进行。微囊包封(microencapsulation)提供了简单且成本有 效的将生物活性材料包封在半透性聚合物膜内的方法，目的是保护所述生物活性材料 并使所包封的物质或其产物以受控方式释放。在光化学内化(PCI)中，所感兴趣的分 子和光敏化合物同时被细胞摄入到溶酶体或内体中。细胞然后暴露于适当波长的光， 从而激活光敏化合物，使光敏化合物破坏溶酶体或内体的膜，进而将所关注分子释放 到细胞的胞质中。
其他方法包括显微注射、血红细胞影介导融合、脂质体融合、胞饮体的渗透裂解、 划痕标记(scrape loading)、电穿孔、磷酸钙和病毒介导的转染以及使用共聚物载剂。
壳聚糖和水溶性壳聚糖衍生物、特别是二醇壳聚糖因其体内生物相容性和生物可 降解性而作为当选药物载剂而出现。优选的实例是经5β-胆烷酸疏水性修饰的二醇壳 聚糖。
本发明的“寡肽化合物”可以引入一个或多个，例如至少1、2、3、4或5个并 非由标准遗传密码编码的带侧链的氨基酸，本文也称为“非编码氨基酸”。这些氨基 酸可以选自通过代谢过程形成的氨基酸，例如鸟氨酸或牛磺酸，和/或人工修饰的氨 基酸，例如9H-氟-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6- 磺酰基(Pmc)保护的氨基酸，或具有苄氧基羰基(Z)基团的氨基酸。
本发明寡肽化合物的体外和/或体内稳定性可通过使用本领域已知的稳定或保护 方法来改善或增强，例如添加保护基或稳定基团、引入氨基酸衍生物或类似物或氨基 酸的化学修饰。所述保护基或稳定基团可以例如添加在N和/或C-末端。这种基团的 实例有乙酰基和其他保护基，或本领域已知的可以稳定肽的基团。
以下实施例显示，经修饰而包含D型氨基酸和/或其中利用了SEQ ID NO:1的逆 序列的本发明的经修饰寡肽化合物可以保留本发明的抗癌和/或抗微生物活性。
因此，在一个实施方式中，本发明的寡肽化合物仅包含L构型的氨基酸，但在另 一实施方式中存在一个或多个D构型的氨基酸。寡肽化合物可以具有至少1个、2个、 3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个D型氨基酸。优选 的是，寡肽化合物所含全为D型氨基酸。因此，特别包括反式的寡肽化合物或本发 明寡肽化合物的反式类似物(更具体是反式肽(inverso peptide))。
如以上具体指出，还包括“逆序”寡肽化合物(或逆序肽(retro peptide))，其中残 基(例如氨基酸残基)按照与母体化合物或参比化合物(例如，肽)相反的顺序组装。因 此，特别包括其中例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的序列逆转的化合物。逆序 序列分别如SEQ ID NO.2和41所示。
逆序-反式寡肽化合物包含顺序与母体化合物或参比化合物序列相逆(相反)的D 型氨基酸。逆序-反式类似物因此具有逆转的末端和逆序的肽键顺序，同时基本保持 母体或参比序列中侧链的拓扑学。
本发明的化合物可以包括部分反式、逆序或逆序-反式的序列。在优选实施方式 中，化合物是反式的，并且在进一步优选的实施方式中，序列是EIYRKYIAKAVRLTK (SEQ ID NO.2)或包含该序列。在进一步优选的实施方式中，化合物是逆序-反式的， 即，由SEQ ID NO.2或SEQ ID NO:41的序列的D型氨基酸组成，或包含SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO:41的序列的D型氨基酸。
“寡肽化合物”是指由通过肽键或等同键连接在一起的氨基酸或等同亚单元组成 的化合物。因此，术语"寡肽化合物"包括肽和肽模拟物。
“等同亚单元”是指其结构和功能与氨基酸类似的亚单元。亚单元的骨架部分可 以与标准氨基酸不同，例如它可引入一个或多个氮原子替代一个或多个碳原子。
"肽模拟物"是指其功能与肽等同或类似并且能够采取与其肽对应物相似的三维 结构的化合物，但其并非仅由通过肽键连接的氨基酸组成。一类优选的肽模拟物是类 肽(peptoid)，即，N-取代的甘氨酸。类肽与其天然肽等同物密切相关，但其在化学上 的不同之处在于其侧链附接在沿着分子骨架的氮原子上，而不是氨基酸中的α-碳。
肽模拟物在患者体内通常具有更长的半衰期，因此在需要更长的持续效果的实施 方式中是优选的。这能够帮助降低组合物反复施用的频率。然而，在其他实施方式中 出于生物安全原因可优选更短的半衰期；在这些实施方式中优选肽。
最优选的是，寡肽化合物是肽。寡肽化合物可引入二聚氨基酸和/或β-氨基酸。 最优选的是，寡肽化合物由α-氨基酸组成。
前缀“寡”用于指亚单元、例如氨基酸的数量相对较小，即，小于200、优选小 于100、90、80、70、60或50个亚单元。本发明的寡肽化合物因此可包含至少7个 并且不多于200个亚单元。优选地，其包含至少8个、9个、10个、11个、12个、 13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24 个亚单元。作为选择限定的是，其包含不多于50个、45个、40个、35个、30个、 29个、28个、27个、26或25个亚单元。代表性亚单元范围因此包括10～40、10～ 35、10～30、10～25、10～20、10～15、10～12等，优选10～20和10～30。其他代 表性范围包括15～50、15～45、15～40、15～35和15～30，更特别是20～50、20～ 45、20～40、20～30、25～50、25～45、25～40、25～35、25～32和25～30。
本发明的寡肽化合物可以包含与SEQ ID NO 1、2、40或41所示序列的同一性 为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%的氨基酸序列，或由所述序列组成。
可以通过任何常规方法评价序列同一性。然而，为了确定序列之间的序列同一性 程度，有用的是执行序列多重比对的计算机程序，例如Clustal W(Thompson等,(1994) Nucleic Acids Res.,22:4673-4680)。对序列对进行比较和比对的程序，如ALIGN (Myers等,(1988)CABIOS,4:11-17)、FASTA(Pearson等,(1988)PNAS,85:2444-2448; Pearson(1990),Methods Enzymol.,183:63-98)和空位BLAST(Altschul等,(1997) Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)也可用于该目的。此外，欧洲生物信息学会(European Bioinformatics Institute)的Dali服务器提供了基于结构的蛋白序列比对(Holm(1993)J. Mol.Biol.,233:123-138;Holm(1995)Trends Biochem.Sci.,20:478-480;Holm(1998) NucleicAcid Res.,26:316-319)。
多序列比对和百分比同一性计算可利用标准BLAST参数确定(利用来自所有现 有生物的序列,阵列Blosum 62,空位值:存在11,延伸1)。作为选择，可以使用以下 程序和参数：程序：Align Plus 4,4.10版(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比较:整体比较,标准线性计分阵列,错配罚分=2,开放空位罚分=4, 延伸空位罚分=1。氨基酸比较:整体比较,BLOSUM 62计分阵列。
本发明的范围中因此包括所述序列或给出序列的变体，只要变体寡肽化合物保留 亲本的功能活性即可，即，变体具有等同的功能，换言之其具有或显示出本文所定义 的亲本化合物的活性(例如，对癌细胞和/或微生物细胞的生长和/或活力的抑制效果、 细胞毒性、抗肿瘤或抗细菌活性等。所述变体可包含亲本序列的氨基酸置换、添加或 缺失(包括在一端或两端的截短)，例如一个或多个氨基酸、例如1～6个氨基酸置换、 添加或缺失。
还包括其中一个或多个氨基酸得到化学衍生化(例如取代有化学基团)的功能等 同的衍生物。
因此，本发明的寡肽化合物可包含SEQ ID NO:1,2,40或41的片段，只要所述 化合物保留了所需活性即可。SEQ ID NO:1或2的片段长度可以为例如7～14个残基， 例如12或13个残基。SEQ ID NO:40或41的片段长度可以为13至26个残基，例 如13、14、15、16或17至26个残基。
如以下实施例所述，SEQ ID NO:40的肽是在pH7.0时净电荷为12的的强阳离 子肽，并且具有12.4的高等电点(pI)。优选本发明的化合物以及其功能等同变体(包括 其片段)具有相似性质。换言之，优选变体(包括片段)保留了亲本化合物的物理化学性 质。所述性质包括特别其阳离子性性质。SEQ ID NO.40的肽具有α-螺旋结构。在某 些实施方式中，本发明化合物可具有α-螺旋结构，但这并非关键特征；在其他实施方 式中化合物可具有β-折叠片结构，或者可具有另一种或无规的结构，例如卷曲，或者 化合物可具有含不同结构的域的复合结构。
在优选的代表性实施方式中，本发明的化合物(包括SEQ ID NO.1、2、40或41 的功能等同变体和片段)可具有一种或多种以下性质：
pH7.0时的净电荷为10～13，例如11～12.5；
pI为12～13；
平均亲水性为0.7～1.0，例如0.8～1.0；
亲水性残基/残基总数的比例为45～60%，例如46～58%、48～58%或50～56%。
本发明的寡肽化合物可形成更大单元的一部分，例如其可以与多肽融合形成重组 融合蛋白或与框架接合形成肽适体。因此，引入了本发明寡肽化合物的融合蛋白或适 体形成了本发明的另一方面。在另一方面还包括含有所述融合蛋白或适体的药物组合 物，以及所述融合蛋白或适体在疗法或上述治疗方法中的应用。
还涵盖了将本文所限定的寡肽化合物、核酸分子和/或载体对细胞或细胞培养物 的体外施用。这种体外方法可用于研究本发明化合物的细胞毒性效果。
现在将参考下列附图在以下非限制性实施例中对本发明进行描述，其中：
图1显示了为筛选而设计的96种合成肽处理24小时后对细胞存活的影响。SEQ ID NO.40的肽(称为"肽1″)得到了最低的吸光度，表明最低的细胞存活(图1的图中肽 1由与最短柱形相邻的箭头指示)。
图2显示了以96种肽中的3种培养20分钟后通过对细胞的光学显微术确定的形 态学效果。
图3显示了全L型氨基酸形式的肽1(SEQ ID NO.40)、逆序-反式(ri)形式的肽 1(即，逆序列的全D型氨基酸(SEQ ID NO.41))和全D型氨基酸形式的肽1(SEQ ID NO.40)对单层培养物中的细胞的效果。
图4显示了不同时间点以不同肽浓度对HFF1(人包皮成纤维细胞)、T986(神经 母细胞)、GaMG(成胶质细胞瘤)和A172(成胶质细胞瘤)施用的肽1的MTT分析。与 HFF1细胞相比，对于肿瘤细胞系观察到较低的存活分数。
图5显示了分别以2.5至30μg/ml的肽处理的两种正常细胞系(142细胞和HFF1 细胞)以及两种癌细胞系(143癌细胞和HOS肉瘤细胞系)的LIVE/DEAD活力测试的结 果。与正常细胞系相比，在两种癌细胞系中观察到了强细胞毒性作用。
图6(A)以肽1处理后细胞的高分辨率扫描电子显微镜图像。(B)显示了带有荧光 素硫氰酸酯的肽的标记的N端部分。
图7显示向小鼠的4T1肿瘤中局部注射肽1引起了对4T1肿瘤的强生长抑制效 果。
图8显示了Kaplan Meier存活实验的结果，该实验比较了经处理的和未经处理的 皮下注射有4T1癌细胞的动物。基于严重的肿瘤负担，当动物显示了系统疾病的指征 时处死动物。
图9显示了Kaplan Meier存活实验的肿瘤的组织学分析。
图10显示了在脂双层中含有不同磷脂组成的200nm脂质体。脂质体装载有荧光 染料，并且在肽1(图10上的肽X)处理后测到了染料流出。染料是指荧光团ANTX 和淬灭剂DPX，并且染料释放是指通过洗涤剂(Triton x100)达到的总释放的%。
图11显示了将不同时间点的膜破裂和ds Red从细胞中的释放可视化的时间跟踪 共聚焦显微照片。白色箭头突出显示由膜破裂引起的突然丧失ds Red的细胞质含量 的细胞。
图12显示了对所观察到的膜破裂效果的理论解释。
图13显示了当将三种细菌菌株与肽1或不与肽1温育2小时时对该三种细菌菌 株生长的结果。
图14显示了肽1在pH7.0的净电荷为12；等电点为12.4；平均亲水性为1；亲 水性残基/残基总数的比例为56%。
实施例
实施例1.96种肽的最初设计和筛选以及对癌细胞存活和形态的影响
肽设计和制备
利用搜素引擎Expasy和Swissprot确定了已知肿瘤抑制物(见表2)的可能的保守 元件和活性位点。鉴定了96种肽。TAT序列接合在N端以用于细胞内输送。在 Cambridge Peptides(Cambridge,UK)和Genscript(NJ,USA)合成肽。所有肽均被酰胺化 和乙酰化。所合成的肽溶于水得到1mg/ml的终浓度。
细胞培养
细胞系U87、MCF7、SF295、T47D和4T1获自挪威Bergen大学的肿瘤库。成 纤维细胞获自健康捐献者。所有细胞系在补充有NEAA、100U/ml青霉素/链霉素和 400μML-谷氨酰胺的含10%胎牛血清的DMEM(Sigma,St.Louis,MO,USA)中生长， 所补充的物质均来自Cambrex(East Rutherford,NJ,USA)。在所有试验中，将1×104 个细胞分配到96孔板中。
细胞存活
图1显示了以所鉴定的96种肽进行24小时培养后胶质瘤细胞系u87的最初筛选 中的细胞存活结果。3种肽显示对癌细胞的活力有明显负面影响。其中选择肽1(SEQ ID NO.41)用于进一步研究。
“肽1”对应于在其N端具有SEQ ID NO.36的HIV-TAT序列的SEQ ID NO:1 的肽序列。
细胞形态
通过光学显微镜和时间跟踪显微镜确定以96种肽中的三种培养20分钟后的细胞 形态，结果如图2所示。该结果显示细胞大量收缩的过程和固缩细胞外观，表明细胞 死亡。
肽稳定化
通常而言，肽的主要问题是其易受到蛋白水解性降解，特别是被血清中存在的蛋 白酶降解。本发明人因此设计了以D氨基酸取代L氨基酸从而稳定肽的策略。研究 显示所述肽在补充了血清的培养基中并未丧失其效果。实际上，所述肽还耐受胰酶的 蛋白水解性降解。图3显示了单层培养物中经取代的肽的效力，表面经取代的肽甚至 比原始肽效果更好。
实施例2.肽1对癌细胞的体外效果
正常细胞和癌细胞系之间的体外细胞活力比较
MTT细胞活力测试：
MTT (噻唑蓝溴化四唑)在传统上使用放射性同位素的掺入作为细胞分裂的度量 的研究中可用于测定细胞增殖。MTT是淡黄色溶液，并且被活细胞的线粒体脱氢酶 转变为深蓝色的水不溶性MTT-甲臜(formazan)。该蓝色晶体可被酸化异丙醇溶解，并 在570nm波长比色测定其强度(MTT测试的规程按照制造商的说明书使用)。利用 MTT细胞活力测试，比较了正常人的人包皮成纤维细胞(HFF1)和三种癌细胞系T986 (神经母细胞瘤细胞)、GaMG(成胶质细胞瘤)和A172(成胶质细胞瘤)。在90分钟暴 露于肽1后，在20μg/ml的浓度，存活分数为19%至43%。相比之下，正常HFF1细 胞的存活分数为58%，这表明该肽对癌细胞作用更强(见图4)。
利用分子探针对细胞活力的比较(存活/死亡试剂盒)
活力/细胞毒性试剂盒利用荧光染料来评价哺乳动物细胞活力。发 现钙黄绿素AM和溴乙啶同源二聚体-1(EthD-1)是用于此目的的最佳染料。通过无荧 光钙黄绿素AM向强荧光钙黄绿素的酶促转变而确定细胞内酯酶活性，根据细胞内酯 酶活性的存在将活细胞与死细胞区分开。聚阴离子染料钙黄绿素能被很好地保留在活 细胞中，并产生均匀的强绿色荧光。EthD-1被活细胞的完整细胞膜排除在外，但其 可进入具有受损细胞膜的细胞并结合核酸，在死亡细胞中产生明亮红色荧光。该存活 /死亡试剂盒的规程由制造商提供。
为了量化肽1的细胞毒性作用，将20000个细胞放置在24孔多孔皿中。48小时 之后，向孔中加入浓度为0.1μg/ml～35μg/ml的肽1。1小时-3小时-6小时后，利用 Molecular Probes LIVE/DEAD试剂盒评价细胞生活力。将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中快速洗涤，然后向孔中加入10μM EthD-1和5μM钙黄绿素。然后将细胞在组织培 养箱中37℃温育30分钟。
然后利用装配有FITC(绿色荧光)和TRITC(红色荧光)滤光片的倒置荧光显微镜 (Nikon Eclipse 2000E,Tokyo,日本)观察细胞。然后将发荧光的细胞以100倍的放大率 照相。然后通过对100个细胞计数，来评估活细胞(具有绿色荧光的细胞)的比例和死 细胞(红色荧光)的比例。
对照相比显示了含有发绿色荧光的细胞的融合的单层。未观察到红色荧光的细胞 表明100%的活力(图5)。在接受了0.1μg/ml、1μg/ml和5μg/ml肽的细胞中观察到 同样的荧光。然而，在接受10μg/ml肽的单层中观察到了一些红色细胞，表明该浓度 下的轻微的细胞毒性。相反，接受15μg/ml肽的细胞显示了很大比例的死亡细胞(图 5)。接受30μg/ml肽的单层显示出接近100%死亡的细胞，表明了较强的细胞毒性(见 图5)。
不同浓度时的活细胞和死细胞的百分比如表3所示。肽的裂解作用在1小时后发 生，在3至6小时未观察到有进一步的变化。
形态
高分辨率扫描电子显微镜显示了肽处理后质膜的总崩解，表明该肽发挥了影响质 膜的强细胞裂解性作用(图6A)。通过详细的体外形态学分析，发现存在一些细胞片 段化的证据表明凋亡的发生。发明人因此以荧光素硫氰酸酯(FITC)对肽的N端部分进 行标记，并对其在体外处理。处理之后立刻出现的免疫荧光表明肽也在核中累积。因 此，存在肽通过与核蛋白的相互作用而触发凋亡的一些证据。如图6B所示，肽1也 在核中累积。根据对组织培养完成的形态学观察，也存在肽也触发凋亡的一些证据。
实施例3.肽1对癌细胞的体内作用
4T1乳癌是具有高度致瘤性和侵袭性的可移植的肿瘤细胞系，并且其与大多数肿 瘤模型不同，其可自发从乳腺的原发肿瘤转移至多个远端部位，包括淋巴结、血液、 肝脏、肺、脑和骨。4T1肿瘤的几种特性使得其成为适合的人类乳癌的实验动物模型。 首先，肿瘤细胞容易移植到乳腺中，从而使原发肿瘤在解剖学正确的位置生长。其次， 与在人乳癌中一样，4T1转移疾病自发地从原发肿瘤发展。并且，4T1转移向引流淋 巴结和其他器官的渐进性传播与人乳癌中非常相像。将1×106个4T1细胞皮下注射到 12只雌性BALBc小鼠中。治疗组中6只动物，接受混杂肽序列的对照组中6只动物。 当肿瘤达到0.8cm的尺寸时(10天后)，肿瘤接受3次以100μl施用的400μg肽的局部 注射。所施用的肽的总浓度为1200μg。然后每4天用测径器记录肿瘤。
肿瘤生长
如图7所示，肽向4T1肿瘤中的局部注射引起了对4T1肿瘤的强生长抑制作用。 数据点代表了对照组和治疗组的6只动物的平均值。
动物存活
本发明人进行了Kaplan Meier存活实验，对接受4T1癌细胞皮下注射的经治疗 的动物和未经治疗的动物进行了比较。基于严重的肿瘤负担，当动物显示出系统疾病 指征时处死动物。如图8所示，与未经治疗组相比，治疗组具有明显的存活优势。将 肿瘤收集以用于组织学分析。将切下的肿瘤在4%缓冲甲醛中固定。将石蜡包埋的 5-μm切片以H&E染色。将细胞培养物在4%PFA中固定，并以Nikon Eclipse TE2000-E 荧光显微镜(Nikon,Tokyo,日本)成像。如图9所示，大量细胞死亡之后观察到了严重 的坏死，表明了肽的强细胞毒性作用。
实施例4.体外和体内膜破裂实验
制备在脂双层中含有不同磷脂成分的200nm脂质体。脂质体装载有荧光染料， 并且在肽1(图10上的肽X)处理后测到了染料流出。染料是指荧光团ANTX和淬灭 剂DPX，并且染料释放是指通过洗涤剂(Triton x100)达到的总释放的%。如图10所示， 肽1具有强的充当囊泡破坏者的功能，特别是当磷脂带负电时尤其如此(PBPS:EYL; 蓝色符号;S0.5(半最大效果)=8.5μg/ml;2,46μM)。肽还具有一些对中性(极性)磷脂的 效果(EYL:绿色符号)，但该效果小于对带负电磷脂的效果。使用对照肽(肽A)作为尺 寸相同但序列不同的参比。肽A在所研究的浓度下没有效果。
利用慢病毒载体稳定转染4T1乳癌细胞，以表达荧光标记物dsRed。所转染的细 胞将在胞质中累积dsRed，能够容易在荧光显微镜中可视化(见图11)。然后将细胞暴 露于20μg/ml的肽1，在3小时期间进行随时间跟踪共聚焦显微照相。该研究能够使 癌细胞中的膜破裂直接可视化。
图12显示了对所观察到的效果的理论解释。已知与正常细胞相比，癌细胞通常 具有带负电的细胞膜。阳离子肽对于细胞膜上的电荷少于癌细胞膜的正常细胞几乎没 有影响，癌细胞膜在外表面上具有更多酸性磷脂和磷脂酰丝氨酸，这极可能是由于磷 脂双层中翻转活性的增加。肽1很容易结合带负电的磷脂，在磷脂双层中产生孔。由 于多种细菌膜带负电，本发明人还评价了肽对各种菌株的作用。
实施例5.肽1对细菌的效果
肽1还显示了杀菌剂活性，可在两小时内杀死细菌。所测试的菌株是埃希氏大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌。这表明该肽还对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具 有裂解活性。图13显示了当上述菌株与肽1或不与肽1温育2小时时的结果。
实施例6.肽1的物理性质
确定了肽1在pH7.0时的净电荷为12；等电点为12.4；平均亲水性为1；亲水性 残基/残基总数的比例为56%。肽1因此具有强阳离子性，并具有较高等电点。结果 如图14所示。
表2
肽筛选中所用的已知肿瘤抑制物 PTEN p15 p12 p27 par-4 P53BP1 PML ATM chd5 apc smad4 puma 视网膜母细胞瘤 NF1 patched Numb Axin WT SMAD2 SMAD3 P16
表3.不同浓度下的活细胞和死细胞的百分比，两种正常细胞系(142和HFF1)与两种癌 细胞系(143癌和HOS肉瘤)之间的比较
讨论
实验表明，肽1以及基于肽1的经修饰的肽在体外和体内对各种癌细胞系有抗肿 瘤效果。而且，所述肽在体外对人成纤维细胞和对小鼠进行腹膜内注射均表现出几乎 没有毒性。实际上，对18gr,nod-scid小鼠皮下注射1000μg肽没发现毒性。肽在体外 使多种癌细胞系的生长停顿，而正常细胞受相同浓度的影响更小。通过对小鼠体内实 体瘤的直接肽注射，24小时后观察到了严重的坏死和后续的生长抑制。另外，这导 致与未治疗动物相比更显著的动物存活。扫描电子显微镜以及功能性研究显示肽影响 了癌细胞质膜，引起膜破裂。另外，肽还转运至核，触发了癌细胞的凋亡机制。因此， 具有新颖序列的肽1及其修饰物代表了可抑制各种癌(例如，脑癌、肺癌、乳癌和结 肠癌)的肿瘤生长的治疗性分子。结果还显示，通过简单操作，可以使肽对蛋白水解 性降解稳定化(产生抵抗性)，这进一步增强了其作为抗肿瘤化合物的潜力。另外，结 果表明，肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有杀菌效果。所述肽因此可用于抵抗 人的各种细菌感染。
参考文献
1.Dunn GP，Bruce AT,Ikeda H,Old LJ,Schreiber RD.Cancer immunoediting:from immunosurveillance to tumor escape.Nat Immunol 2002;3:991-8.
2.Mocellin S,Rossi CR,Nitti D.Cancer vaccine development:on the way to break immune tolerance to malignant cells.Exp Cell Res 2004;299:267-78.
3.Blattman JN,Greenberg PD.Cancer immunotherapy:a treatment for the masses. Science 2004;305:200–5.
4.Boman HG.Peptide antibiotics and their role in innate immunity.Annu Rev Immunol 1995;13:61–92.
5.Hancock RE.Peptide antibiotics.Lancet 1997;349:418–22.
6.Ganz T,Lehrer RI.Antimicrobial peptides of vertebrates.Curr Opin Immunol 1998;10:41-4.
7.Zasloff M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature 2002;415:389–95.
8.Ohsaki Y，Gazdar AF,Chen HC,Johnson BE.Antitumor activity of magainin analogues against human lung cancer cell lines.Cancer Res 1992;52:3534–8
9.Chen Y，Xu X,Hong S,等RGD-Tachyplesin inhibits tumor growth.Cancer Res 2001;61:2434-8.
10.Street SE,Cretney E,Smyth MJ.Perforin and interferon-g activities independently control tumor initiation,growh,and metastasis.Blood 2001;97:192-7.
11.Ellerby HM,Lee S,Ellerby LM等，An artificially designed pore-forming protein with anti-tumor effects.J Biol Chem 2003;278:35311-6.
12.Leuschner C,Enright FM,Gawronska B,Hansel W.Membrane disrupting lytic peptide conjugates destroy hormone dependent and independent breast cancer cells in vitro and in vivo.Breast Cancer Res Treat 2003;78:17–27.
13.Papo N,Braunstein A,Eshhar Z,Shai Y.Suppression of human prostate tumor growth in mice by a cytolytic D-,L-amino acid peptide:membrane lysis,increased necrosis,and inhibition of prostate-specific antigen secretion.Cancer Res 2004;64:5779–86.
14.Ganz T,Lehrer RI.Defensins.Curr Opin Immunol 1994;6:584–9.
15.Epand RM,Vogel HJ.Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action.Biochim Biophys Acta 1999;15:1–2.
16.Shai Y.Mechanism of the binding,insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by a-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides.Biochim Biophys Acta 1999;1462.
17.Tossi A,Sandri L,Giangaspero A.Amphipathic,a-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 2000;55:4-30.
18.Bulet P，Stocklin R,Menin L.Anti-microbial peptides:from invertebrates to vertebrates.Immunol Rev 2004;198:169–84.
19.Shai Y.Mode of action of membrane active antimicrobial peptides.Biopolymers 2002;66:236–48.
20.Papo N,Shahar M,Eisenbach L,Shai Y.A novellytic peptide composed of D,L amino acids selectively kills cancer cells in culture and in mice.J Biol Chem 2003;278:21018-23.
21.Zwaal RF,Schroit AJ.Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells.Blood 1997;89:1121–32.
22.Zwaal RF,Comfurius P，Bevers EM.Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.Cell Mol Life Sci 2005;62:971–88.
23.Chen HM,Wang W，Smith D,Chan SC.Effects of the anti-bacterial peptide cecropin B and its analogs,cecropins B-1and B-2,on liposomes,bacteria,and cancer cells. Biochim BiophysActa 1997;1336:171–9.
24.Chan SC,Yau WL,Wang W，Smith DK,Sheu FS,Chen HM.Microscopic observations of the different morphological changes caused by anti-bacterial peptides on Klebsiella pneumoniae and HL-60leukemia cells.J Pept Sci 1998;4:413–25.
25.Papo N,Shai Y.New lytic peptides based on the D,L amphipathic helix motif preferentially kill tumor cells compared to normal cells.Biochemistry 2003;42:9346–54.
26.Manno S,Takakuwa Y，Mohandas N.Identification of a functional role for lipid asymmetry in biological membranes:phosphatidylserine-skeletal protein interactions modulate membrane stability.Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:1943-8.
27.Ellerby HM,Arap W，Ellerby LM等,Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides.Nat Med 1999;5:1032–8.
28.Baker MA,Maloy WL,Zasloff M,Jacob LS.Anticancer efficacy of magainin 2 and analogue peptides.Cancer Res 1993;53:3052-7.