寡肽化合物及其应用.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102781953 A (43)申请公布日 2012.11.14 CN 102781953 A *CN102781953A* (21)申请号 201180008036.9 (22)申请日 2011.02.01 1001602.0 2010.02.01 GB C07K 7/08(2006.01) C07K 14/16(2006.01) C07K 14/47(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 38/16(2006.01) (71)申请人 西托瓦申公司 地址 挪威卑尔根 (72)发明人 L佩斯特加登 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代

2、理有限 公司 11127 代理人 丁香兰 庞东成 (54) 发明名称 寡肽化合物及其应用 (57) 摘要 本发明涉及新型试剂、 含有所述新型试剂的 药物组合物和它们在治疗、 特别是抗微生物和抗 癌治疗中的应用。特别是， 本发明涉及基于 SEQ ID NO:40 的新型肽类化合物， 所述新型肽类化合 物令人惊讶地表现出对细胞、 特别是细菌和癌细 胞的生长和 / 或活力的抑制效果。本发明还提供 了包括使用本发明肽的治疗方法和非治疗方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.08.01 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/051422 2011.02.01

3、 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/092347 EN 2011.08.04 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 27 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 27 页 附图 8 页 1/2 页 2 1. 一种寡肽化合物， 所述寡肽化合物包含 ： (i) 氨基酸序列 YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE(SEQ ID NO:40) ； 或 (ii) 与序列 SEQ ID NO:40 的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列 ； 或 (iii) 作为 SEQ ID NO:40 的逆序列的

4、全部或一部分的氨基酸序列， 或作为与序列 SEQ ID NO:40 的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列的逆序列 ； 其中， 所述化合物具有抑制微生物细胞和 / 或癌细胞的生长和 / 或活力的活性。 2. 如权利要求 1 所述的寡肽化合物， 所述寡肽化合物的序列为 SEQ ID NO:40。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物包含一个或多个 D 型氨基 酸。 4.如权利要求3所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物是完全含有D型氨基酸的反式化 合物。 5.如权利要求1至4中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物是其中所述氨基酸 序列为逆序的逆序化合物。

5、 6.如权利要求1至5中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物是逆序-反式化合 物。 7.如权利要求1至6中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述逆序列如SEQ IDNO:41所 示。 8.如权利要求1至7中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物具有一种或多种以 下性质 ： a) 在 pH 7.0 的净电荷为 10 13， b)pI 为 12 13 ； c) 平均亲水性为 0.7 1.0 和 / 或 d) 亲水性残基 / 残基总数的比例为 45% 60%。 9. 如权利要求 1 至 8 中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物是抗细菌剂。 10. 如权利要求 1 至 9 中任

6、一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物具有细胞毒性。 11.如权利要求1至8中任一项或权利要求10所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物能 够引发癌细胞裂解和 / 或凋亡。 12. 如权利要求 1 至 8 和 10 至 11 中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物对癌 细胞具有选择性细胞毒性。 13. 如权利要求 1 至 8 和 10 至 12 中任一项所述的寡肽化合物， 其中， 所述化合物能够 减小肿瘤尺寸。 14.一种编码权利要求1至7中任一项所述的氨基酸序列的核酸分子， 或所述核酸分子 的互补物。 15. 一种载体， 所述载体包含权利要求 14 所述的核酸分子。 16. 一种

7、细胞， 所述细胞通过引入权利要求 14 或 15 所述的核酸分子或载体而得到修 饰。 17. 一种药物组合物， 所述药物组合物包含权利要求 1 至 15 中任一项所述的寡肽化合 物或核酸分子以及制药可接受的赋形剂。 18. 用于治疗的权利要求 1 至 17 中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子或组合物。 权 利 要 求 书 CN 102781953 A 2 2/2 页 3 19. 用于对抗微生物感染的权利要求 1 至 18 中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子或 组合物。 20.用于治疗癌症的权利要求1至18中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子或组合物。 21.权利要求1至17中任一项所述的寡

8、肽化合物或核酸分子在制造用于对抗微生物感 染和 / 或治疗癌症的药物中的应用。 22. 一种对抗微生物感染和 / 或治疗癌症的方法， 所述方法包括对有需要的受试对象 施用权利要求 1 至 17 中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子或组合物。 23. 权利要求 1 至 18、 20 和 21 中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子、 组合物、 应用或 方法， 其中， 当用于治疗癌症时， 所述癌症选自脑癌、 肺癌、 乳癌、 结肠癌或者黑色素瘤。 24.权利要求1至18、 20、 21和23中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子、 组合物、 应用 或方法， 其中， 当用于治疗癌症时， 所述寡肽化合物、

9、核酸分子、 组合物或药物用于向所述癌 症的局部输送。 25. 权利要求 1 至 19、 21 至 22 中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分子、 组合物、 应用或 方法， 其中， 当用于对抗微生物感染时， 所述微生物感染是细菌感染。 26. 一种产品， 所述产品作为组合制剂含有权利要求 1 至 17 中任一项所述的寡肽化合 物、 核酸分子或组合物以及第二治疗活性剂， 并且所述寡肽化合物、 核酸分子或组合物与第 二治疗活性剂分开、 同时或依次使用以抑制癌细胞或微生物细胞的活力和 / 或生长。 27.一种试剂盒， 所述试剂盒含有权利要求1至17中任一项所述的寡肽化合物、 核酸分 子或组合物以及第二治

10、疗活性剂。 28. 如权利要求 26 或 27 所述的试剂盒或产品， 其中， 所述第二治疗活性剂具有对抗微 生物感染或癌症的活性。 29. 如权利要求 26 至 28 中任一项所述的试剂盒或产品， 其中， 所述第二治疗活性剂是 化学治疗剂或抗肿瘤剂。 30. 如权利要求 26 至 28 中任一项所述的试剂盒或产品， 其中， 所述第二治疗活性剂是 抗生素或抗病毒剂或抗真菌剂。 31. 一种抑制微生物的活力和 / 或生长的体外或离体方法， 所述方法包括使所述微生 物接触权利要求 1 至 13 中任一项所述的寡肽化合物。 32. 一种抑制癌细胞的活力和 / 或生长的体外或离体方法， 所述方法包括使所

11、述癌细 胞接触权利要求 1 至 14 中任一项所述的寡肽化合物或核酸分子。 权 利 要 求 书 CN 102781953 A 3 1/27 页 4 寡肽化合物及其应用 0001 本发明涉及新型试剂、 含有所述新型试剂的药物组合物和它们在治疗、 特别是抗 微生物和抗癌治疗中的应用。 特别是， 本发明涉及新型肽类化合物， 所述新型肽类化合物令 人惊讶地表现出对细胞、 特别是细菌和癌细胞的生长和 / 或活力的抑制效果。本发明的新 型肽已显示对细菌和癌细胞具有细胞毒性效果和对肿瘤生长的抑制。 所述肽或其模拟物因 而可用于癌症治疗或用作抗微生物剂， 更特别是用作抗癌剂或抗细菌剂。本发明还提供了 包括使用

12、本发明肽的治疗方法和非治疗方法。 0002 癌症是其中细胞显示出不受控制的生长并侵入和破坏邻近组织的病况。 在一些情 况中癌细胞转移并迁移至其他部位， 形成继发性癌位点。 癌症可影响所有年龄的人， 对于大 多数类型的癌而言风险随年龄增长。2007 年所有人类死亡中， 由癌症导致的占约 13%(760 万 )。实际上， 仅美国每年就有 600,000 人死于癌症。 0003 癌症由细胞的遗传物质异常引起。这种异常可能是由于致癌物的影响造成， 例如 烟草的烟雾、 辐射、 化学物质或传染性病原体。其他导致癌症的遗传异常可能通过 DNA 复制 中的错误而随机发生或遗传， 并因此自出生起就存在于所有细胞

13、中。癌症的遗传力通常受 到致癌物和宿主基因组间的复杂相互作用的影响。 0004 已知人的免疫系统可以识别并破坏癌细胞， 这主要通过受体介导的机制进行 (1 3)。 然而， 尽管有免疫系统监视， 但癌细胞能够逃避宿主免疫控制， 因此通常需要对癌症进行 外科干预或治疗。 0005 由于对医药的研究和进展， 大多数癌症可以以某些形式进行治疗， 少数癌症可以 治愈， 这取决于具体类型、 部位和阶段。 一旦诊断， 通常通过外科手术、 化疗和放疗的组合对 癌症进行治疗。不过， 多数癌症不能通过传统方法治愈， 因而需要对癌症患者的替代性治 疗。宿主免疫控制通常由宿主防御产生的细胞裂解性阳离子多肽介导， 这以

14、及其他因素一 起导致了在癌症治疗中使用抗癌肽的提议。 这种肽最初因其在清除细菌中的作用而被发现 (4-7)。然而， 肿瘤似乎通过尚且未知的受体介导的机制避免了这些宿主控制机制 (8-13)。 0006 已知对癌细胞显示出抑制效果的肽 ( 抑制性肽 ) 可强力结合带负电的膜 (4,5,1418)， 随后发生膜的裂解(19,20)。 通常许多抗癌肽是阳离子性的。 癌细胞的质膜 含有少量的带负电的磷脂酰丝氨酸 (3% 9%; 参考文献 21,22)， 因此癌细胞比大多数非恶 性真核细胞带有稍多的负电。 细胞膜组成的这种微小差异是否可以解释一些阳离子性肽优 选杀死癌细胞的能力还不清楚 (2325)。

15、0007 表面暴露的磷脂酰丝氨酸还可以充当由先天免疫效应物(如单核细胞)将癌细胞 从血流中清除的标志物， 不过是通过完全不同的 ( 受体介导的 ) 机制 (26)。本领域中已经 提出， 阳离子性肽对肿瘤细胞的实际破坏是以下两个过程之一的结果 ： (i) 细胞质膜破裂 引起的对坏死的诱导 (20,25) 或 (ii) 肽与线粒体膜的结合触发对凋亡的诱导 (9,27)。本 领域中所描述的许多抗癌肽据信可通过涉及细胞裂解的机制发挥其效应。 0008 尽管某些这类肽在体外有有力的抗癌活性， 但体内研究受到限制。目前， 仅有少 数研究是利用能够破坏癌细胞膜并随后引起癌细胞死亡的肽在体内进行。这些研究包括

16、 (i) 以细胞裂解肽对实体肿瘤进行系统性治疗， 但仅将所述细胞裂解肽与导航 ( 靶向 ) 域 说 明 书 CN 102781953 A 4 2/27 页 5 缀合或将其用作前肽 (12,27)， 这是因为细胞裂解实体在血清中无活性和缺乏肿瘤特异性 ； (ii) 以爪蟾抗细菌肽及其 D 型氨基酸对映体治疗卵巢癌， 但仅将其以高剂量进行腹膜内注 射 (28) ； 和 (iii) 以抗人乳癌异种移植物的 69 个氨基酸的成孔肽进行肿瘤内施用 (11)。 0009 由于有限的固有局部活性或其不能到达完整动物体内较大的转移物， 所有这些治 疗对散播的转移物(27)仅有轻微影响(如果有的话)。 目前，

17、对于细胞毒性肽对癌细胞的选 择性和其对其他健康器官的毒性还没有深入研究。然而， 对于一种称为 D-K6L9 的肽 ( 十五 聚体 D,L- 氨基酸短肽 )， 已经显示出肿瘤内注射对原发性人前列腺癌生长的抑制， 并且不 会影响邻近的非恶性细胞(13)。 在小鼠中已经显示出， 肽D-K6L9在系统性施用时特异性靶 向并抑制原发性肿瘤和转移性肿瘤的生长。 该肽似乎通过去极化细胞裂解机制作用于胞膜 中的磷脂酰丝氨酸。 0010 因此， 虽然在抗癌肽领域已经取得一些进展， 但仍需要可有效破坏或抑制癌细胞 生长并且对非癌细胞不显示细胞毒性的新型肽。 0011 如上所述， 开发抗癌肽的工作主要集中于细胞裂解

18、性抗微生物肽， 许多这种肽已 显示出针对不同类型癌细胞的体外作用。所述肽在包括昆虫、 两栖动物和哺乳动物在内的 生物的先天免疫中具有核心作用。实例包括人的防御素、 杀菌肽、 杀菌肽 - 爪蟾抗细菌肽杂 合物、 爪蟾抗细菌肽， 以及与导航域和前肽缀合的所述肽。如上所论述， 这些肽优选结合并 破坏带负电的作为细菌胞膜的主要成分的磷脂膜。 0012 诸如细菌等微生物是导致多种传染病的原因， 并每年导致大量死亡。 例如， 致病菌 导致结核等疾病。由于微生物引起多种传染病， 并且致病菌的耐药性是现代医学面临的严 重问题， 急需针对微生物的新型的替代性治疗。 0013 本发明针对这些需要提供了新型肽类化合

19、物， 所述肽类化合物是惊人地有效的新 型抗癌剂和抗微生物剂。 0014 因此， 已经设计了新型肽， 并且基于此新型肽的肽令人惊讶地显示出可有效在体 外抗击癌细胞和细菌细胞， 和有效在体内抑制肿瘤生长。 如以下实施例所述， 基于此新型肽 序列的肽显示出针对多种癌细胞系的细胞毒性活性， 同时显示出对正常细胞的极低活性和 低毒性。 还显示出针对各种细菌物种的细胞毒性效应， 包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。 此外， 在癌症动物模型中观察到了强抗肿瘤效应， 对肿瘤生长具有显著明确的抑制效应。 经 治疗的动物与未治疗组相比具有显著的活力优势， 实际上研究表明所述动物的肿瘤可能已 被治愈。因此， 已经展示出

20、惊人的抗癌或抗肿瘤效果 ( 在这个意义上， 抗癌 用来表示对 癌细胞的负面影响， 更具体来说是对癌细胞的生长和 / 或活力的负面影响， 更具体而言是 对癌细胞的细胞毒性效应 )。 0015 本发明人最初试图基于已知肿瘤抑制蛋白的氨基酸序列来设计具有 “肿瘤抑制 物” 效果的肽。因此希望设计可结合肿瘤抑制物蛋白的受体并从而阻断肿瘤生长的肽。制 备了一组共 96 种肽， 并筛选抗癌和抗微生物活性。在该筛选中鉴定出了构成本发明基础的 肽， 其为仅有的三种显示出显著活性水平的肽中的一种。本发明的肽显示出针对癌细胞和 微生物细胞的出人意料的高细胞毒性活性， 在癌细胞的情况中在体外和体内均显示出所述 出人

21、意料的高细胞毒性活性。 令人惊讶的是， 考虑到肽库设计的基本原理， 发现所述肽具有 细胞裂解活性、 破坏癌细胞的胞膜并裂解细菌。此外， 还惊人地观察到了凋亡效应， 表明所 述肽可能触发或引起凋亡。如上所述， 进一步研究表明这种抗癌效果可能对癌细胞有选择 说 明 书 CN 102781953 A 5 3/27 页 6 性， 使非癌细胞保持完好， 这对于癌症治疗非常有利， 在癌症治疗中治疗、 例如化疗的不利 副作用通常较大。本发明的肽类化合物还已经显示出根除了数种细菌菌株， 并且可以提供 针对多耐药性细菌的有效工具。 0016 根据这些惊人的不可预料的结果， 本发明人在此提出了基于这一新型肽序列

22、(即， 序列SEQ ID NO.1)的肽和肽类化合物可用于治疗癌症和微生物感染， 更一般而言还可 用作抗微生物剂、 包括非治疗用途的抗微生物剂， 例如用以抗击微生物感染或建群， 例如作 为消毒剂等， 其中 SEQ ID NO.1 为 0017 KTLRVAKAIYKRYIE(SEQ ID NO:1) 0018 因此， 本发明的一个方面提供了寡肽化合物， 所述寡肽化合物包含 ： 0019 (i)SEQ ID NO.1 的氨基酸序列的全部或一部分 ； 或 0020 (ii) 与 SEQ ID NO:1 的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列 ； 或 0021 (iii) 作 为 SEQ ID N

23、O:1 的 逆 序 列 的 全 部 或 一 部 分 ( 即， SEQ ID NO:2 ： EIYRKYIAKAVRLTK的全部或一部分)的氨基酸序列， 或者作为与SEQ ID NO:1的序列同一性 为至少 85% 的氨基酸序列的逆序列 ； 0022 其中所述化合物具有抑制癌细胞和 / 或微生物细胞的生长和 / 或活力的活性 ( 即， 能够或有效抑制癌细胞和 / 或微生物细胞的生长和 / 或活力 )。换言之， 所述化合物 可能具有抗肿瘤活性或抗微生物活性， 在抗微生物活性中优选抗细菌活性。 0023 下文中将要描述的是， 本发明的寡肽化合物可以有利地具有额外的寡肽序列， 该 另外的寡肽序列具有

24、“细胞穿透” 活性 ( 如以下所进一步限定 )。特别是， 优选基于 HIV-TAT 肽的所述细胞穿透寡肽序列。以下实施例中研究了在这一基础上设计的肽， 其表现出特别 有效。 0024 因此， 在一个优选方面， 本发明提供了寡肽化合物， 所述寡肽化合物包含 ： 0025 (i)氨基酸序列YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE(SEQ ID NO:40)的全部或一部分 ； 或 0026 (ii) 与 SEQ ID NO:40 序列的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列 ； 或 0027 (iii) 作 为 SEQ ID NO:40 的 逆 序 列 的 全 部 或 一 部 分 (

25、即， SEQ ID NO.41EIYRKYIAKAVRLTKGRRRQRRKKRGY的全部或一部分)的氨基酸序列， 或者作为与SEQ ID NO:40 序列的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列的逆序列的氨基酸序列， 0028 其中所述化合物具有抑制癌细胞和 / 或微生物细胞的生长和 / 或活力的活性 ( 即， 能够或有效抑制癌细胞和 / 或微生物细胞的生长和 / 或活力 )。换言之， 所述化合物 可能具有抗肿瘤活性或抗微生物活性， 在抗微生物活性中优选抗细菌活性。 0029 SEQ ID NO:40 的寡肽化合物对应于连接到 SEQ ID NO:1 的 N 端的 SEQ ID NO:36(

26、 见下文 ) 的 HIV-TAT 序列。 0030 本发明的寡肽化合物因此对细胞、 特别是癌细胞或微生物细胞、 尤其是细菌的生 长和 / 或活力具有抑制效果。所述化合物因此具有细胞生长抑制活性或细胞毒性活性， 优 选细胞毒性活性， 特别是针对癌细胞或微生物细胞、 例如针对肿瘤的细胞生长抑制活性或 细胞毒性活性。在一方面， 所述化合物是抑细菌剂或杀细菌剂， 优选杀细菌剂。 0031 对于细胞 “抑制生长” 表示降低、 更特别是显著降低了细胞生长的任何方面， 所述 细胞生长的任何方面包括细胞尺寸的增加或细胞成分的量和 / 或体积的增加， 但更优选为 说 明 书 CN 102781953 A 6 4

27、/27 页 7 细胞数量的增加。术语 “生长” 因此明确包括细胞的复制或繁殖。可以降低细胞生长速度， 例如细胞数量增加的速度。作为代表性实例， 生长 ( 例如， 细胞数量或生长速度 ) 可以降低 至少 50%、 60%、 70%、 80%、 90% 或 95%。在某些情况中， 生长可以降低 100%， 即， 生长停止或完 全抑制。因此， 细胞的复制或复制可能降低或被抑制。因此， 术语 “抑制” 包括任何程度的 生长下降(例如， 与不存在所述寡肽化合物的情况下观察到的生长相比)。 可以将复制或繁 殖速度以传代时间进行评估或表示， 特别是在微生物细胞的情形中 ( 即， 微生物产生其自 身的拷贝所需

28、的时间)。 对于癌细胞， 生长可以通过确定细胞数量来评估或通过评估肿瘤尺 寸或其生长速度来评估。 0032 对于细胞 “抑制活力” 包括降低细胞活力的任何效应， 或使得细胞更不容易生存或 无法存活的任何效应。细胞的活力可以视为细胞在给定条件下生存的能力。特别地， 其包 括杀死或破坏细胞， 即， 使细胞死亡。死亡可以通过以下因素评估 ： 不能生长 ( 包括不能复 制)或不能利用或同化营养 ； 细胞或者含有所述细胞的组织(例如肿瘤)的的形态改变， 例 如坏死可以作为证据。通常， 如果细胞膜完整性丧失， 则可认为细胞死亡。 0033 术语 “细胞生长抑制” 和 “细胞毒性” 可以进行类似解读。 00

29、34 本领域中公知确定癌细胞或微生物细胞的活力或生长的方法。 用许多常规测试可 确定细胞是否活着 ( 存活 ) 或死亡。一个选择是将细胞置于正常情况下可支持该细胞生长 的条件下， 并通过适合的标准方法监测细胞的生长， 例如监测细胞的尺寸、 细胞的形态、 随 时间变化的细胞数量、 培养基中营养的消耗等。另一选择是对细胞进行细胞死亡形态特征 的评估， 例如坏死或凋亡体、 膜出泡、 核聚缩和 DNA 断裂为尺寸均匀的片段、 破裂的细胞壁 或膜和细胞内容物泄露到细胞外环境中。 0035 其他方法利用了死亡细胞中细胞膜完整性的特征性丧失。通常使用不可透膜的 染料 ( 例如台盼蓝和碘化丙啶 ) 来评估膜的

30、完整性。这些染料被完整细胞排斥， 因此在这 些细胞中不发生染色。如果细胞膜完整性被破坏， 这些染料可以进入细胞并对细胞内组分 染色。作为选择， 或作为补充， 使用只对具有完整膜的细胞染色的染料来指示细胞的活力。 Invitrogen Ltd的Live/Dead Assay是使用两种染料的测试， 一种对死细胞染色， 另一种对 活细胞染色。 评估膜完整性的另一种方式是检测细胞成分例如乳酸脱氢酶在培养基中的释 放。 0036 另一种选择是测定细胞的代谢。 这通常可以以多种方式完成。 例如， 可以测定ATP 水平。只有具有完整膜的活细胞可以合成 ATP， 并且由于 ATP 不储存在细胞中， 细胞死亡使

31、 ATP 水平迅速下降。对 ATP 水平的监测因此指示出细胞状态。再一种选择是测定细胞的还 原电位。代谢营养物的活细胞利用还原反应， 因此通过对细胞应用可给出是否处于还原形 式或氧化形式的不同结果的标志物(例如荧光染料)， 可以评估细胞的还原电位。 缺乏还原 标志物的能力的细胞可被视为死亡。MTT 和 MTS 测试是这种测试的合适实例。 0037 “抗肿瘤” 效应或活性可被视为对肿瘤的生长和 / 或活力的影响。该术语包括对肿 瘤的任何负面效果或活性。肿瘤细胞可以被杀死或破坏。肿瘤的生长可以被抑制， 例如可 使肿瘤不能生长， 或可使肿瘤生长速度降低 ( 例如， 与以该化合物治疗前的肿瘤相比， 或

32、与 同等的或相应的未经治疗的肿瘤相比 )。肿瘤尺寸可以减小， 或者在有利的情况下， 肿瘤可 以完全消失(即， 消融或毁灭)。 抗肿瘤效果在某些情况下可以包括降低癌细胞从肿瘤扩散 的效果， 例如， 可以降低肿瘤的代谢能力。肿瘤的其他致病性质或行为也可以降低， 例如其 说 明 书 CN 102781953 A 7 5/27 页 8 侵袭或浸润周围组织的能力。 0038 参考以上定义，“抗微生物” 活性表示任何杀死或毁灭微生物或抑制微生物生长的 效应， 类推抗细菌活性是任何杀死或毁灭细菌或者抑制细菌生长的效应。 0039 有利的是， 本发明的寡肽化合物直接作用于细胞， 即， 其可直接抑制细胞的生长和

33、 / 或活力。 “直接” 是指化合物不用募集生理系统或机制 ( 例如， 免疫系统 ) 来发挥其效力 ( 例如， 其细胞毒性或细胞生长抑制效力 )。相反， 所述化合物直接作用于细胞。 0040 为了辅助本发明的寡肽化合物以便发挥其效力， 或促进这种效力， 或者在有些情 况下使其能够发挥这种效力， 可以对该化合物提供要素从而促进或改善其向细胞的运送， 或使得其能够被运送到细胞 ( 细胞内运送 )。 0041 因此， 在一个实施方式中， 寡肽化合物还包含细胞穿透序列 ( 细胞穿透肽 )。在该 实施方式的优选方面， 寡肽化合物包含基于 HIV-TAT 序列 ( 特别是 47 位至 58 位氨基酸 )

34、的细胞穿透序列。 0042 因此， 可以看出在所述实施方式中， 本发明的寡肽化合物可以采取构建体的形式， 所述构建体包含 ( 即， 含有 ) 本发明的寡肽化合物以及细胞穿透序列或肽。因此在这一方 面， 本发明可以看作提供含有本发明的寡肽化合物以及至少一种细胞穿透肽的构建体。在 “细胞穿透肽” 的语境中使用时， 术语 “肽” 不仅限于具有肽键的肽， 其还包括下文进一步论 述的其他的肽样化合物或肽类化合物， 例如肽模拟结构体。换言之，“细胞穿透肽” 可以包括 具有细胞穿透活性的任何寡肽化合物。 0043 因此， 细胞穿透肽可以是起着将寡肽化合物输送到细胞中或跨过细胞膜 ( 即， 进 入细胞内部 )

35、 的作用的序列。因此， 其可以是所谓的 “细胞穿透” 序列 ( 或者更具体而言是 “细胞穿透肽” )， 本领域中也称为蛋白转导域 (PTD) 或蛋白转导序列。 0044 因此， 如上所述， 本发明的优选实施方式是包含以下 (i) 和 (ii) 的构建体 ： (i) 本 文所定义的本发明的寡肽化合物 ； (ii) 细胞穿透序列 ( 更具体而言是细胞穿透肽 )。 0045 细胞穿透肽 (CPP) 技术近年来有很大发展， 现有技术中已知并描述了多种细胞穿 透肽， 并且实际中许多此类肽可商购。 细胞穿透肽的尺寸、 序列和电荷以及事实上其作用机 制 ( 对于一些细胞穿透肽作用机制目前未知， 对于其他细胞

36、穿透肽而言作用机制未得到完 全明晰 ) 可以有很大不同， 但均具有跨越胞膜并将所附着或关联的部分 ( 所谓的 “被运载 物” ) 运送到细胞的胞浆中、 在某些情况下甚至运送到细胞核中的共同能力。CPP 因此是肽 类运送载体。 0046 CPP 可以来源于能够跨越细胞膜的天然存在的蛋白 ( 例如果蝇的同源框蛋白 Antennapedia( 一种转录因子 )、 病毒蛋白 ( 例如 HIV-1 转录因子 TAT 和来自 HSV-1 的衣 壳蛋白 VP22) ； 或者 CPP 可以合成得到， 例如由嵌合蛋白或合成多肽 ( 如多聚精氨酸 ) 获 得。如上所述， 对于转导效果并没有单一的机制， 因此 CP

37、P 的设计可以基于不同结构和序 列。 Jarver等对细胞穿透肽在2006Biochimica et Biophysica Acta 1758,第260-263页 中进行了综述， 下表 1 列出了各种代表性肽。US 6,645,501 还描述了可使用的各种细胞穿 透肽。 0047 表 1 0048 说 明 书 CN 102781953 A 8 6/27 页 9 0049 说 明 书 CN 102781953 A 9 7/27 页 10 0050 基于HIV-TAT序列的序列以及HIV-TAT及其片段代表可用于本发明的一类优选的 CPP。US 5,656,122 中描述了基于 TAT 的各种 C

38、PP。下文实施例中所用的示例性 HIV-TAT 肽是 YGRKKRRQRRRG(SEQ ID.No.36)， 并且其构成了本发明的优选形式， 但容易理解的是可 以使用更长或更短的TAT片段。 HIV-TAT的氨基酸序列可以被修饰和/或截短， 或者所述肽 可以进行化学修饰， 或制备逆序列类似物、 反式序列类似物或逆序 - 反式序列类似物， 同时 保持其细胞穿透活性。 0051 另 一 类 细 胞 穿 透 肽 是 表 1 所 示 的 基 于 约 16 氨 基 酸 穿 膜 素 序 列 的 源 自 Antennapedia 的 CPP(Antp 类 )， 该 16 个氨基酸穿膜素序列对应于 Anten

39、napedia 蛋白的第 三环， 并且据显示其负责蛋白转位。 对穿膜素作为运输载体已经进行了深入开发， 特别包括 说 明 书 CN 102781953 A 10 8/27 页 11 用于药物用途， 已经提出并描述了多种穿膜素衍生物和修饰序列。 具体可参见WO 91/1891、 WO 00/1417、 WO 00/29427、 WO 2004/069279 和 US 6,080,724。因此， 穿膜素的该 16 氨基酸 序列可以被修饰和 / 或截短， 或可以对该肽进行化学修饰， 或制备其逆序列类似物、 反式序 列类似物或逆序 - 反式序列类似物， 同时保持其细胞穿透活性。 0052 如上所述，

40、对于所用的 CPP 而言， 没有共有的特定结构特征或序列基序。然而， 可 以通过特定特征来识别各类 CPP， 例如具有两亲性且带净电荷为负电的肽。其他类别的 CPP 可具有显示高-螺旋含量的结构。 另一类别可以是以碱性氨基酸含量高为特征的肽。 CPP 因此可以是或者可包含碱性氨基酸例如精氨酸的寡聚体， 例如 5 20 个、 6 15 个或 6 12 个 R 残基， 例如 R7(SEQ ID NO:35)、 R8(SEQ ID NO:37) 或 R11(SEQ ID NO:38) 或 QSR8(SEQ ID NO:39)。 0053 富含脯氨酸的两性肽是另一类 CPP， 并且 Pujals 等在

41、 2008Advanced Drug Delivery Reviews 60,473-484 页中描述了特征为存在吡咯烷环的这种肽。 0054 其 他 成 功 开 发 的 CPP 包 括 pVEC(Elmquist 等， 2003Biol.Chem 384,387-393 页 ;Holm 等， 2005Febs Lett.579,5217-5222 页 ) 和 源 自 降 钙 素 的 肽 (Krauss 等， 2004Bioorg.Med.Chem.Lett.,14,51-54 页 )。 0055 商 售 的 CPP 包 括 基 于 Pep-1 肽 的 Chariot(Active Motif

42、，法 国 )、基 于 protegrin 肽 PG-1 的 Syn-B 载 体 (Syntem, 法 国 ) 和 基 于 MPG 肽 的 Express-si Delivery(Genospectra, 美国 )。 0056 除了可公开获得的和报道的 CPP， 可以根据已知的或所报道的标准来设计和合成 新型的或衍生化CPP肽(例如， 已知的CPP序列或特征， 例如上述的碱性氨基酸含量、 -螺 旋含量等 )。另外， 可以对随机涉及的肽或其他肽筛选 CPP 活性， 例如通过将含有报告分子 ( 例如， 可检测的标签或标记， 例如荧光标记 ) 的这种肽与所需的被运载物 ( 本发明的寡肽 化合物 ) 偶

43、联或接合， 并检测该构建体是否被转运跨越胞膜， 例如通过在活细胞中添加这 些肽然后利用例如共聚焦显微镜来检测细胞输入来进行。 0057 实际上， 虽然通常情况是 CPP 可几乎穿透或进入任何细胞类型， 但在一些情况下 观察到成功的或有效的运输可能取决于被运载物 ( 例如被运载物肽序列 ) 和 / 或所用 CPP 的确切性质或依赖于该性质而有所变化。确定最佳的肽序列和组合等， 以及检测和 / 或修 饰被运载物和 / 或 CPP 序列或结构等均属于本领域技术人员的常规技术。 0058 本发明的代表性寡肽化合物 ( 或构建体 ) 因此可包括 ： 0059 (a) 第一寡肽序列， 该第一寡肽序列包括

44、： 0060 (i)SEQ ID NO.1 的氨基酸序列的全部或一部分 ； 或 0061 (ii) 与 SEQ ID NO:1 序列的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列 ； 或 0062 (iii) 作 为 SEQ ID NO:1 的 逆 序 列 的 全 部 或 一 部 分 ( 即， SEQ ID NO:2 ： EIYRKYIAKAVRLTK的全部或一部分)的氨基酸序列， 或者作为与SEQ ID NO:1的序列同一性 为至少 85% 的氨基酸序列的逆序列 ； 和 0063 (b) 第二寡肽序列， 该第二寡肽序列是细胞穿透肽序列。 0064 成分(b)可以选自上述的任何CPP， 更特别是选自

45、任何基于HIV-TAT或由其衍生的 序列。 0065 CPP( 即， 上述定义的成分 (b) 可以附接于或设置在寡肽化合物的 N 端或 C 端， 说 明 书 CN 102781953 A 11 9/27 页 12 但优选其位于 N 端。因此， 成分 (a) 和 (b) 可以以任何顺序接合或连接， 但优选顺序为 (a)-(b)。 0066 本发明的寡肽化合物(或构建体)的成分或元件可以根据本领域公知技术以任何 合乎需要的或方便的方式来相互接合或连接。因此， 所述成分或独立部分可以利用例如已 知的化学偶联技术来通过化学方式连接或缀合， 或可以利用遗传工程技术 ( 例如， 形成融 合蛋白的技术 )

46、将构建体作为单一整体形成， 或可以利用例如肽合成技术将它们简单地整 体合成。 0067 可以将不同部分或成分直接相互连接， 或将它们通过一个或多个连接子 ( 或间隔 子 ) 序列间接连接。因此， 连接子序列可以将化合物的两部分 ( 或寡肽构建体中的两个独 立成分 ) 间隔开或分离。连接子序列的确切性质并不关键， 其可具有可变的长度和 / 或序 列， 例如其可以具有 0 15 个、 0 12 个、 0 10 个、 0 8 个、 0 6 个、 0 4 或 0 3 个 残基， 例如 1 个、 2 或 3 或更多个残基。作为代表性实例， 连接子序列如果存在则可具有 1 15 个、 1 12 个、 1

47、10 个、 1 8 个、 1 6 或 1 4 个残基等。残基的性质无关紧要， 其 可以是例如任何氨基酸， 例如中性氨基酸， 或脂肪族氨基酸， 或其可以是疏水性的， 或极性 的或带电荷的或形成结构的， 例如脯氨酸。示例性的连接子序列因而可以包括任何单氨基 酸残基， 例如 A、 I、 L、 V、 G、 R、 Q、 T 或 W， 或由所述残基组成的二肽、 三肽、 四肽、 五肽或六肽。 0068 当寡肽化合物含有作为 SEQ ID NO:1( 或者其具有至少 85% 序列同一性的功能等 同的变体 ) 的逆序列的序列时， 则优选 CPP( 例如成分 (b) 的序列也为逆序， 并且其以逆序 接合。换言之，

48、 包含两个部分的整个化合物 ( 或构建体 ) 的序列是逆序。然而， 不排除只有 一个部分是逆序的情况， 或者两个部分均为逆序但以 “非逆序” 的顺序接合的情况。 0069 本发明的代表性优选化合物可具有如下序列 ： 0070 YGRKKRRQRRRGKTLRVAKAIYKRYIE (SEQ ID NO:40) 0071 本发明的化合物可包括含有以下组分的化合物 ： 0072 (i) 氨基酸序列 SEQ ID NO:40 的全部或一部分 ； 或 0073 (ii) 与 SEQ ID NO:40 序列的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列 ； 或 0074 (iii) 作 为 SEQ ID NO

49、:40 的 逆 序 列 的 全 部 或 一 部 分 ( 即， SEQ ID NO.41EIYRKYIAKAVRLTKGRRRQRRKKRGY的全部或一部分)的氨基酸序列， 或者作为与SEQ ID NO:40 序列的序列同一性为至少 85% 的氨基酸序列的逆序列的氨基酸序列。 0075 本发明的癌细胞可以是来自任何癌的细胞， 例如任何下述癌。 其可以是肿瘤细胞。 所述细胞可以是临床肿瘤或癌组织中的细胞， 或来自所述组织的细胞， 或来自癌细胞系的 细胞。 0076 本文所用术语 微生物细胞 包括任何微生物。因此， 所述细胞可以是任何真核 或原核细胞， 并包括细菌、 真菌、 藻类、 古细菌和原生动物。 该术语因此包括通常为单细胞的 生物， 但其可具有在某些条件下组织为简单协作集落或结构体的能力， 如纤丝、 菌丝或菌丝 体 ( 但不是真正的组织 ) 的能力。微生物可以来自微生物的任何纲、 属或种。原核微生物 的实例包括但不限于， 包括支原体在内的细菌 ( 例如， 革兰氏阳性细菌、 革兰氏阴性细菌或 或革兰氏测试无反应的细菌 )， 以及古细菌。真核微生物包括真菌、 藻类和其他被归类或已 经归类为分类学中的原生生物界或被视为是原生生物的微生物， 其包括但不限于， 例如原 生动物、 硅藻、 原