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1、(10)申请公布号 CN 103667381 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667381 A (21)申请号 201310721098.5 (22)申请日 2013.12.24 CGMCC No.8392 2013.10.25 C12P 13/10(2006.01) C07C 279/14(2006.01) C07C 277/08(2006.01) C12R 1/13(2006.01) (71)申请人 山东民强生物科技股份有限公司 地址 256600 山东省滨州市高新技术开发区 新八路 267 号 (72)发明人 高法民 高树营 (74)专利代理机构 济南舜源专利事。
2、务所有限公 司 37205 代理人 宋玉霞 (54) 发明名称 一种提高精氨酸收率的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种提高精氨酸收率的方法。 本方法采用陶瓷膜代替传统的板框过滤， 提高了 滤液质量， 减少了占地面积， 提高了产品收率， 降 低了劳动强度。 通过本发明制备方法， 成品对于发 酵液来说总收率能达到 86.5% 以上 （相对于除去 菌体的净精氨酸含量计算） ， 成品一次合格率达到 99.8%。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 (10)申请公布号。
3、 CN 103667381 A CN 103667381 A 1/2 页 2 1. 一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 包括发酵液的制备和提取精制步骤， 其中 发酵液的制备采用黄色短杆菌 MQA121。 2. 根据权利要求 1 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 发酵液的制备包 括下述的步骤 ： （1） 斜面培养 ： 将 MQA121 菌种接入灭菌的斜面培养基， 在 32培养， 32 小时得到斜面 菌种 ； （2） 摇瓶菌种 ： 将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基 32培养 22-32 小时得 到摇瓶种子液 ； （3）一级种子培养 ： 将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级。
4、种子培养基， 32培养 22-28 小时得一级种液 ； （4） 二级种子培养 ： 将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基 32培养 4-8 小时得二级种子液 ； （5）将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中， 发酵过程补加按重 量 百 分 比 的 3% 葡 萄 糖 和 玉 米 浆 3.0-5.0%、 (NH4)2SO41.5-3.5%、 KH2PO40.3-0.8%、 K2HPO43H2O0.3-0.6%， 通入无菌风， 采用氨水 （1:1 浓度） 控制 pH 值 6.8， 在 32条件下， 经 过 65-70 小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。 3. 根据权利要求 1 所述的一。
5、种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 步骤 （1）中 斜面培养基按重量百分比包括葡萄糖 2.5-4.0%、 (NH4)2SO41.0-2.5%、 KH2PO40.3-0.8%、 K2HPO43H2O0.3-0.8%、MgSO47H2O0.05-0.1%、FeSO47H2O 0.002-0.004%、 MnSO4H2O0.002-0.010%， 琼脂粉 2.0%， pH6.47.0。 4. 根据权利要求 1 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 摇瓶种子培养基、 一级种子培养基、 二级种子培养基以及发酵培养基按重量百分比包括 ： 初糖浓度 12.5%， 尿 素 0.3%， 玉米浆 C。
6、SL4.0%,（NH4） SO45.0%。 5. 根据权利要求 1 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 步骤 （5） 中氨水体 积浓度为 1:1 浓度。 6. 根据权利要求 1 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 发酵产品提取精 制包括以下步骤 ： 发酵液预处理 ； 絮凝、 脱色、 预浓缩 ； 浓缩、 结晶 ； 离心得成品。 7. 根据权利要求 6 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 步骤具体为 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白， 陶瓷膜孔径 120-500nm， 操作压差 0.15-0.40MPa， 膜面流速3.0-3.5m/s， 拟稳定通量。
7、70-120L/m2.h ； 发酵液直接经过陶瓷膜循 环过滤， 过程采用循环水为循环料液降温， 循环料液温度控制在 65以下， 浓缩液加入反渗 透水清洗出残留的产品， 过滤时间为 12 小时得滤清液。 8. 根据权利要求 7 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 步骤具体为 ： 将 步骤中得到的滤清液以树脂 1 倍体积 / 小时的流速流过弱酸性阳离子树脂吸附产品， 用 2倍树脂体积的2.0N氨水， 以1倍树脂体积的流速洗脱得到洗脱液 ； 洗脱液通过通径为800 分子量的纳滤膜设备循环脱色， 过程使用循环水降温控制循环料液温度低于 50， 用反渗 透水清洗浓缩液至产品含量低于 0.2%。
8、， 得到透光为 80% 以上， 含量为 6% 的纳滤浓缩液 ； 纳 滤清液升温至 60， 120rpm 搅拌状态下加入 1% 活性炭脱色， 保温 45 分钟， 当清液透光率达 到 93% 以上后经脱碳机除去活性炭得到脱色清液， 脱色清液经过反渗透循环， 用循环水降 权 利 要 求 书 CN 103667381 A 2 2/2 页 3 温控制循环料液温度低于 60， 浓缩液含量达到 12-15% 后得到反渗透浓缩液 ； 反渗透浓缩 液以 1 倍树脂体积 / 小时的流速流经经过弱碱性阴离子树脂得到含量为 13% 透光率 99.5% 的阴离子树脂交换液。 9. 根据权利要求 8 所述的一种提高精氨酸。
9、收率的方法， 其特征在于， 步骤具体为 ： 将 阴离子交换液吸入浓缩结晶罐， 在 -0.08Mpa、 料液温度控制在 60、 搅拌转速为 120rpm 的 条件下将阴离子交换液浓缩至料液含量达到 85%， 降低转速至 80rpm， 用 -5冰水将料液降 温至 5-10养晶 8 小时。 10. 根据权利要求 9 所述的一种提高精氨酸收率的方法， 其特征在于， 步骤具体为 ： 将养好晶的结晶液以 2500rpm 转速的全自动出料离心机将结晶和母液分离， 用 75% 的酒精 清洗结晶得到湿品， 湿品经双锥干燥在真空度 -0.08Mpa， 温度 80条件下烘干 5 小时得到 含水量0.5%以下的干品，。
10、 干品在环境为温度2228， 湿度50%， 无菌条件下包装得成 品。 权 利 要 求 书 CN 103667381 A 3 1/5 页 4 一种提高精氨酸收率的方法 技术领域 0001 本发明涉及氨基酸生产技术领域， 特别是涉及一种提高精氨酸收率的方法。 背景技术 0002 传统生物发酵工艺来制备精氨酸。 生物发酵工艺中发酵液中含有大量的有机和无 机杂质， 传统的后提取处理工艺对产品质量没有保障， 而且费工费时。 现有技术提取时采用 了板框过滤， 时间长， 收率低， 损失大。传统工艺只能达到 50% 的总收率， 一次合格率只有 97%。 发明内容 0003 本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而。
11、提供一种提高精氨酸收率的方法。 本方 法采用陶瓷膜代替传统的板框过滤， 提高了滤液质量， 减少了占地面积， 提高了产品收率， 降低了劳动强度。通过本发明制备方法， 成品对于发酵液来说总收率能达到 86.5% 以上 （相 对于除去菌体的净精氨酸含量计算） ， 成品一次合格率达到 99.8%。 0004 本发明的一种提高精氨酸收率的方法技术方案为， 包括发酵液的制备和提取精制 步骤， 其中发酵液的制备采用黄色短杆菌 MQA121。 0005 MQA121 菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮编 ： 100101， 其保藏编号是 ：。
12、 CGMCC No.8392， 菌种的拉丁文 名称是Brevibacterium fLavum， 参据的微生物 （株） ： MQA121， 保藏日期是 2013 年 10 月 25 日。 0006 本发明所述的 MQA121 菌株特征为 ： 产酸能力强、 糖酸转化率高、 性能稳定。 0007 发酵液的制备包括下述的步骤 ： （1） 斜面培养 ： 将 MQA121 菌种接入灭菌的斜面培养基， 在 32培养， 32 小时得到斜面 菌种 ； （2） 摇瓶菌种 ： 将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基 32培养 22-32 小时得 到摇瓶种子液 ； （3）一级种子培养 ： 将培养好的摇瓶种子液接入。
13、灭菌的一级种子培养基， 32培养 22-28 小时得一级种液 ； （4） 二级种子培养 ： 将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基 32培养 4-8 小时得二级种子液 ； （5）将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中， 发酵过程补加按重 量 百 分 比 的 3% 葡 萄 糖 和 玉 米 浆 3.0-5.0%、 (NH4)2SO41.5-3.5%、 KH2PO40.3-0.8%、 K2HPO43H2O0.3-0.6%， 通入无菌风， 采用氨水 （1:1 浓度） 控制 pH 值 6.8， 在 32条件下， 经 过 65-70 小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。 0008 步骤 （1）。
14、 中斜面培养基按重量百分比包括葡萄糖 2.5-4.0%、 (NH4)2SO41.0-2.5%、 KH2PO40.3-0.8%、 K2HPO43H2O0.3-0.8%、 MgSO47H2O0.05-0.1%、 FeSO47H2O 0.002-0.004%、 说 明 书 CN 103667381 A 4 2/5 页 5 MnSO4H2O0.002-0.010%， 琼脂粉 2.0%， pH6.47.0。 0009 摇瓶种子培养基、 一级种子培养基、 二级种子培养基以及发酵培养基按重量百分 比包括 ： 初糖浓度 12.5%， 尿素 0.3%， 玉米浆 CSL4.0%,（NH4） SO45.0%。 00。
15、10 步骤 （5） 中氨水体积浓度为 1:1 浓度。 0011 发酵产品提取精制包括以下步骤 ：（1） 发酵液预处理 ；（2） 絮凝、 脱色、 预浓缩 ； （3） 浓缩、 结晶 ；（4） 离心得成品。 0012 具体为 ： （1） 发酵液预处理 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白。 陶瓷膜孔径 120-500nm， 操作压差 0.15-0.40MPa， 膜面流速 3.0-3.5m/s， 拟稳定通量 70-120L/m2.h。 0013 发酵液直接经过陶瓷膜循环过滤， 过程采用循环水为循环料液降温， 循环料液温 度控制在 65以下， 浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品。过滤时间为 1。
16、2 小时， 滤清液 含量为 60-80g/L， 滤液澄清、 透明， 预处理收率为 85%。经过陶瓷膜后， 清液含菌量 0.2%。 0014 （2） 絮凝、 脱色， 预浓缩 将步骤 （1） 中得到的滤清液以树脂 1 倍体积 / 小时的流 速流过弱酸性阳离子树脂吸附产品， 用 2 倍树脂体积的 2.0N 氨水， 以 1 倍树脂体积的流速 洗脱得到洗脱液 ； 洗脱液通过通径为 800 分子量的纳滤膜设备循环脱色， 过程使用循环水 降温控制循环料液温度低于 50， 用反渗透水清洗浓缩液至产品含量低于 0.2%， 得到透光 为 80% 以上， 含量为 6% 的纳滤浓缩液 ； 纳滤清液升温至 60， 12。
17、0rpm 搅拌状态下加入 1% 活性炭脱色， 保温 45 分钟， 当清液透光率达到 93% 以上后经脱碳机除去活性炭得到脱色清 液， 脱色清液经过反渗透循环， 用循环水降温控制循环料液温度低于 60， 浓缩液含量达到 12-15% 后得到反渗透浓缩液 ； 反渗透浓缩液以 1 倍树脂体积 / 小时的流速流经经过弱碱性 阴离子树脂得到含量为 13% 透光率 99.5% 的阴离子树脂交换液。 0015 （3） 浓缩、 结晶 将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐， 在 -0.08Mpa、 料液温度控制在 60、 搅拌转速为 120rpm 的条件下将阴离子交换液浓缩至料液含量达到 85%， 降低转速至 80rp。
18、m， 用 -5冰水将料液降温至 5-10养晶 8 小时。 0016 （4） 成品 将养好晶的结晶液以 2500rpm 转速的全自动出料离心机将结晶和母液 分离， 用75%的酒精清洗结晶得到湿品， 湿品经双锥干燥在真空度-0.08Mpa， 温度80条件 下烘干5小时得到含水量0.5%以下的干品， 干品在环境为温度2228， 湿度50%， 无 菌条件下包装得成品。 0017 本发明的优点在于， 本提取工艺采用陶瓷膜代替传统的板框过滤， 提高了滤液质 量， 减少了占地面积， 提高了产品收率， 降低了劳动强度。 0018 采用膜分离技术代替传统的离子交换分离技术， 降低了树脂用量， 提高了料液质 量和。
19、透过， 减少了活性炭用量， 提高了产品质量。 0019 采用膜浓缩技术代替传统的减压浓缩技术， 减少了对产品的破坏， 降低了能耗， 提 高了产品质量。 0020 最后， 通过本发明制备方法， 成品对于发酵液来说总收率能达到 86.5% 以上 （相对 于除去菌体的净精氨酸含量计算） ， 成品一次合格率达到 99.8%。 0021 具体实施方式 ： 为了更好地理解本发明， 下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案， 但是本发明 并不局限于此。 说 明 书 CN 103667381 A 5 3/5 页 6 0022 实施例 发酵液的制备包括下述的步骤 ： （1）斜面培养 ： 将 MQA121 菌种接。
20、入灭菌的斜面培养基 （配方葡萄糖 2.5-4.0%、 (NH4)2SO41.0-2.5%、 KH2PO40.3-0.8%、 K2HPO43H2O0.3-0.8%、 MgSO47H2O0.05-0.1%、 FeSO47H2O 0.002-0.004%、 MnSO4H2O0.002-0.010%， 琼脂粉 2.0%， pH6.47.0。 ） ， 在 32 培养， 32 小时得到斜面菌种 ； （2） 摇瓶菌种 ： 将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基 32培养 22-32 小时得 到摇瓶种子液 ； （3）一级种子培养 ： 将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基， 32培养 22-28 小时。
21、得一级种液 ； （4） 二级种子培养 ： 将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基 32培养 4-8 小时得二级种子液 ； （5）将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中， 发酵过程补加含量 为 3% 葡 萄 糖 和 营 养 物 质 （玉 米 浆 3.0-5.0%、 (NH4)2SO41.5-3.5%、 KH2PO40.3-0.8%、 K2HPO43H2O0.3-0.6%） ， 通入无菌风， 采用氨水 （1:1 体积浓度） 控制 pH 值 6.8， 在 32条件 下， 经过 65-70 小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。 0023 摇瓶种子培养基、 一级种子培养基、 二级种子培养基以。
22、及发酵培养基配方为 ： 初糖 浓度 12.5%， 尿素 0.3%， 玉米浆 CSL4.0%,（NH4） SO45.0%。 0024 发酵产品提取精制包括以下步骤 ：（1） 发酵液预处理 ；（2） 絮凝、 脱色、 预浓缩 ； （3） 浓缩、 结晶 ；（4） 离心得成品。 0025 具体为 ： （1） 发酵液预处理 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白。 陶瓷膜孔径 120-500nm， 操作压差 0.15-0.40MPa， 膜面流速 3.0-3.5m/s， 拟稳定通量 70-120L/m2.h。 0026 发酵液直接经过陶瓷膜循环过滤， 过程采用循环水为循环料液降温， 循环料液温 度控。
23、制在 65以下， 浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品。过滤时间为 12 小时， 滤清液 含量为 60-80g/L， 滤液澄清、 透明， 预处理收率为 85%。经过陶瓷膜后， 清液含菌量 0.2%。 0027 （2） 絮凝、 脱色， 预浓缩 将步骤 （1） 中得到的滤清液以树脂 1 倍体积 / 小时的流速 流过弱酸性阳离子树脂 D124（上海劲凯树脂有限公司） 吸附产品， 用 2 倍树脂体积的 2.0N 氨水， 以1倍树脂体积的流速洗脱得到洗脱液 ； 洗脱液通过通径为800分子量的纳滤膜设备 循环脱色， 过程使用循环水降温控制循环料液温度低于 50， 用反渗透水清洗浓缩液至产 品含量低于 0.2。
24、%， 得到透光为 80% 以上， 含量为 6% 的纳滤浓缩液 ； 纳滤清液升温至 60， 120rpm搅拌状态下加入1%活性炭脱色， 保温45分钟， 当清液透光率达到93%以上后经脱碳 机除去活性炭得到脱色清液， 脱色清液经过反渗透循环， 用循环水降温控制循环料液温度 低于 60， 浓缩液含量达到 12-15% 后得到反渗透浓缩液 ； 反渗透浓缩液以 1 倍树脂体积 / 小时的流速流经经过弱碱性阴离子树脂 D450（上海华震科技有限公司） 得到含量为 13% 透 光率 99.5% 的阴离子树脂交换液。 0028 （3） 浓缩、 结晶 将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐， 在 -0.08Mpa、 料液。
25、温度控制在 60、 搅拌转速为 120rpm 的条件下将阴离子交换液浓缩至料液含量达到 85%， 降低转速至 80rpm， 用 -5冰水将料液降温至 5-10养晶 8 小时。 说 明 书 CN 103667381 A 6 4/5 页 7 0029 （4） 成品 将养好晶的结晶液以 2500rpm 转速的全自动出料离心机将结晶和母液 分离， 用75%的酒精清洗结晶得到湿品， 湿品经双锥干燥在真空度-0.08Mpa， 温度80条件 下烘干5小时得到含水量0.5%以下的干品， 干品在环境为温度2228， 湿度50%， 无 菌条件下包装得成品。 0030 本发明的优点在于， 本提取工艺采用陶瓷膜代替传。
26、统的板框过滤， 提高了滤液质 量， 减少了占地面积， 提高了产品收率， 降低了劳动强度。 0031 采用膜分离技术代替传统的离子交换分离技术， 降低了树脂用量， 提高了料液质 量和透过， 减少了活性炭用量， 提高了产品质量。 0032 采用膜浓缩技术代替传统的减压浓缩技术， 减少了对产品的破坏， 降低了能耗， 提 高了产品质量。 0033 最后， 通过本发明制备方法， 成品对于发酵液来说总收率能达到 86.5% 以上 （相对 于除去菌体的净精氨酸含量计算） ， 成品一次合格率达到 99.8%。 0034 陶瓷膜对精氨酸发酵液具有良好地除菌效果， 除菌效果如表 1 所示 ： 表 1 。 0035。
27、 从表 2 可以看出本， 经过本发明采用的新技术用于精氨酸的提取， 一次产品合格 率和提取收率比现有技术水平高。 0036 表 2 。 0037 采用上述处理手段， 成品对于发酵液来说总收率能达到 85% 以上 （相对于除去菌 体的净精氨酸含量计算） ， 成品一次合格率达到 100%， 而传统工艺只能达到 50% 的总收率， 一次合格率只有98%。 中试产品经滨州市质量技术监督局第三方检验， 各项指标符合中华人 说 明 书 CN 103667381 A 7 5/5 页 8 民共和国国家标准， 食品安全国家标准， 食品添加剂， L- 精氨酸 GB 283062012 标准， 主要 性能指标详见表 3 ： 表 3 。 说 明 书 CN 103667381 A 8 。