NCSTN突变型基因、其鉴定方法和工具.pdf

本发明涉及突变的NCSTN基因，其突变位点为NCSTN基因第11个内含子IVS11+1位置上的核苷酸，由鸟苷酸突变为腺苷酸；和/或其在NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸A和G的缺失等。本发明对探索AI及新的治疗途径有重要意义。

1.分离的NCSTN的突变型序列，其在NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸，由鸟苷酸突变为腺苷酸；和／或其在NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸A和G的缺失；其中所述的NCSTN基因来源于人，所述NCSTN基因的序列为SEQ ID NO：27所示的序列。 2.权利要求1的突变型序列，其中所述的NCSTN基因第11个内含子序列如SEQ ID NO：1所示；和／或所述的NCSTN基因第3号外显子序列如SEQ ID NO：2所示。 3.重组载体，其含有权利要求1或2所述的突变型序列。 4.重组细胞，其含有权利要求3所述的重组载体。 5.筛选或鉴定样品中NCSTN基因突变的非诊断或治疗目的的方法，包括步骤：1)测定待测样品中NCSTN基因第11个内含子IVS11+1位置上的序列，和／或NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的序列；2)NCSTN基因第11个内含子IVS11+1位置上的核苷酸序列为G，则为野生型，核苷酸序列为A，则为突变型；NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列有AG，则为野生型，没有AG，则为突变型。 6.权利要求5的方法，其中所述的核苷酸序列的测定采用PCR扩增再测序的方法，PCR的引物对分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列；和／或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列。 7.逆向性痤疮相关基因的检测剂，其至少包括根据NCSTN基因所有17条外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含NCSTN基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列，和／或NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列。 8.权利要求7的检测剂，其中所述引物分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列，和／或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列，或选自SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：26所示序列中的至少一对。 9.试剂盒，所述试剂盒至少包括：1)根据NCSTN基因所有17条外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含NCSTN基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列，和／或NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列；2)任选地，包含用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。 10.权利要求9的试剂盒，其中所述引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列，和／或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列，或选自SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：26所示序列中的至少1对引物。 11.权利要求1—2的序列、选自SEQ ID NO：3—26中的至少一对引物在制备用于鉴定逆向性痤疮相关基因的试剂盒中的用途。

技术领域

本发明涉及单基因的突变基因，以及该基因的鉴定方法和试剂盒。

背景技术

逆向性痤疮(Inversa acne，AI)又名化脓性汗腺炎，是一种少见的 常染色体显性遗传病，该病属于单基因遗传疾病。以反复发生皮肤脓肿、 窦道及瘢痕形成为特征性表现。本病多发生于女性，是大汗腺导管闭塞 继发细菌感染所致，通常好发于腋窝、腹股沟及臀部等大汗腺分布部位， 初起为坚实的疼痛性炎性结节，以后可出现波动感、脓肿破裂、流脓和 形成窦道。实验室检查往往发现贫血、血沉加快，血清类风湿因子阴性。 AI常伴发聚合性痤疮和脓肿性穿凿性头部毛囊周围炎，统称为毛囊闭锁 三联征；除皮损外，AI还可伴发关节炎或者继发鳞状上皮细胞癌(Thein  M，Hogarth MB，Acland K.Seronegative arthritis associated with  the follicular occlusion triad.Clin Exp Dermatol.2004  Sep；29(5)：550-2；Dufresne RG Jr，Ratz JL，Bergfeld WF，et al. Squamous cell carcinoma arising from the follicular occlusion  triad.J Am Acad Dermatol.1996 Sep；35(3 Pt 1)：475-7.)，不仅 对患者的健康和美观均有极大影响，而且可造成患者严重的身心负担。 本病可表现为常染色体显性遗传，亦可为散发。有家族遗传史者通常发 病较早，一般在11-12岁开始发病，而散发者多数在20岁后发病。

目前该病的研究主要限于病例报道，其分子学发病机制仍然不明。 2006年，高敏等(Gao M，Wang PG，Cui Y，et al，Inversa acne (hidradenitis suppurativa)：a case report and identification of  the locus at chromosome 1p21.1-1q25.3.J Invest Dermatol 2006， 126(6)：1302-1306.)研究者在一个中国汉族人四代家系中将该病的致 病基因定位于1p21.1-1q25.3区域，该连锁区域范围较大，包含大约900 余个基因，包括已知基因、未知基因和预测基因，而继续寻找大的家系 进行精细定位将是一个耗时费力的过程。由于寻找该病致病基因不仅对 发现易感人群和基因诊断有重要价值，而且对探索其发病机制和开辟新 的治疗途径也有意义，因此亟待寻找一种新的方法以发现该病的致病基 因。

最近，外显子组测序(exome sequencing)被成功地应用于发现稀 有单基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon综合症的MYH3基因， Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因，以及严重大脑畸形的WDR62 突变等(Ng SB，Turner EH，Robertson PD，et al，Targeted capture and  massively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature 2009， 461(7261)：272-276；A H，BW vB，C G，et al，De novo mutations of SETBP1  cause Schinzel-Giedion syndrome.D-9216904(-1546-1718 (Electronic))；Bilguvar K，Ozturk AK，Louvi A，et al，Whole-exome  sequencing identifies recessive WDR62 mutations in severe brain  malformations.Nature 2010，467(7312)：207-210.)。该方法已被证明为 降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段。

发明内容

为了寻找逆向性痤疮的相关基因，发明人将外显子组测序与生物 信息学方法相结合，最终找到了逆向性痤疮的相关基因，由此完成了 本发明。

本发明的一个方面涉及分离的逆向性痤疮相关基因NCSTN的突变 型序列，其在NCSTN基因第11个内含子的第1位核苷酸，由鸟苷酸突 变为腺苷酸(IVS11+1G＞A)；和/或其在NCSTN基因第3号外显子第19 位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸A和G的缺失。

在本发明的一个实施方案中，发明人检测了两个AI家系，发现 AI患者中NCSTN基因的第11个内含子序列如下所示： taagaatcacttggccctgcaccctcttcattcttgaagagagtctattctgcagtctgggaggaaggtcactgc cctccgctttcccacactaccccctccagaacttcaggtccatctgtattctttgctcagtggcgttttcacatct gaactgaaacccttatttgtttgactggatattcatcttagaaactcatcctcacccttagccctttactgtcaac aatccttggttatggttccactgctccctagctctccagggtcctgagttcctcagggttgccagcagagggcatc atctcaaacacaagcatgggaaggatggtgggggccctttggctagaagacagaaagcagtccttctctggaactc acccagaggtgccagaaacagtattcatactctgtgaaatgtaccatgttcttgccatgtggtagatggccatggt tcagtgcgagggtaaaagtgcctcctatagctgatggggctccagagatacaaagggtaactctgggttacccttt aactgctcctaacttgaggccttggataacaggggacttcttactcaggctggattgccaagcttcccgagggcca aatgagtttcgtagtgaaaatgcttgagctctatttctgaccccagccaagtagcaccttctcattcatttagggg agtgaccgtcctagcacttagggtcagctgtcttctctaaagctatccttgtaccactttggggcaagtgaagatt catcatttgaacacattttggatttgattatgtagctgacttgactttgtgtgggacagggatttactgatggtaa agactgtggagctcagcctctcttttaagatctatctccttggggctccataaggatcatcatggtgattttatca gtgtattcttatatatcagtgagcagacctgatcctaagacctgctaatcacctcctgctcccagctaccctaaat ataaatgttcattggaacagttatacaactgatctcatgatacatggcagagttctctgaaaatcatcttagccat cccccatatctccagcccaaatgatgtagaagagtctctcctttgtttaaagatctgagctcattcagcttttcta ccttgtctgtcaggaaagtctttaattttcactaaccacctcaccctcactcctacctccctgttctccacacctt ctgcaatatgggatcctgattgtctctcacccctttcttctgatgctgaaaatgagatactgagtccctgcataag gagcatttgagggaggaaaggggcagagccctggctaaatgtagccaaggctcatgccggctttcctggcag (SEQ ID NO：1)所示，在NCSTN基因第11个内含子的第1位核苷酸， 由鸟苷酸突变为腺苷酸，即IVS11+1G＞A；

和/或NCSTN基因的第3号外显子序列如：

CTTCAATTAGTGGAGACAGGTTATCCACGTAGTAGAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCC CCAACCCCCCTTACATGGTTCTGCTGGAGAGCAAGCATTTTACCAG(SEQ ID NO：2)所示，在 NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间存在核苷酸 A和G的缺失，即c.210_211delAG。而家系中对照或正常人群则没有 此突变。

本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明所述的突变 型序列。

本发明的另一方面涉及一种重组细胞，其含有本发明所述的重组 载体。

本发明的另一方面涉及一种样品中逆向性痤疮相关基因的鉴定方 法，其包括以下步骤：

1)测定待测样品中NCSTN基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核 苷酸序列，和/或NCSTN基因第3号外显子第19位核苷酸C及其后的 G之间的核苷酸序列；

2)NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列为G，则为野生型， 核苷酸序列为A，则为突变型；NCSTN基因第3号外显子第19位核苷 酸C及其后的G之间的核苷酸序列有AG，则为野生型，没有AG，则为 突变型。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的核苷酸序列的测定采用 先PCR扩增再测序的方法，所述PCR引物对为F1： tttgctcccttcaattctgc(SEQ ID NO：3)和R1：aacgccactgagcaaagaat (SEQ ID NO：4)所示序列；和/或F2：gggcaacagcttttcagttc(SEQ  ID NO：5)和R2：cctgcaggatggaaacaaat(SEQ ID NO：6)。

本发明的另一方面涉及一种逆向性痤疮相关基因的检测剂，其至 少包括根据NCSTN基因所有17条外显子及其外显子-内含子交界区序 列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含NCSTN 基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列，和/或NCSTN基因第 3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列；所述PCR 引物对分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列；和/或SEQ ID  NO：5和SEQ ID NO：6所示序列。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒至少包括：

1)根据NCSTN基因所有17条外显子及其外显子-内含子交界区序 列设计的PCR引物，所述引物用于PCR扩增，其扩增产物包含NCSTN 基因中NCSTN基因IVS11+1位置上的核苷酸序列，和/或NCSTN基因第 3号外显子第19位核苷酸C及其后的G之间的核苷酸序列；所述PCR 引物对分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列；和/或SEQ ID  NO：5和SEQ ID NO：6所示序列。

2)任选地，包含用于PCR的DNA扩增酶和相应缓冲液。

本发明的另一方面涉及本发明所述的试剂盒用于鉴定逆向性痤疮 相关基因的用途。

以下为正常人的NCSTN序列：

CGCCTGGAAACACGAACTTCCGGTCTCTTAGGCTCCGGGCCACAGAGACGGTGTCAGTGGTAGCCTAGAGAG GCCGCTAACAGACAGGAGCCGAACGGGGGCTTCCGCTCAGCAGAGAGGCAAGATGGCTACGGCAGGGGGTGGCTCT GGGGCTGACCCGGGAAGTCGGGGTCTCCTTCGCCTTCTGTCTTTCTGCGTCCTACTAGCAGgtgaggcctccccgc ccgtgagctccgttctctaaggggaactctcggatcggccccgccgcgaccgccactgtctcccttctggttcctg ctgcccctctgtccccccaccctgtaaatcctctttctttttcgttcccacgacagaagttccccctttgcctgga cctgaaggtcccttctcccccgcagcacgtcgtgtcgcttcactcccttctctaggcctcttcctggacttcgagc ctgaccctctcccactttgtccagatgtctcgtttttcccacaaccccagccacccaccccacagtcgaaaggaac aggtgtgaaagttagctttcttcctcgcgtttagactttttgagacgaaagcaatcttgttctgtgggtgctgtgc ggcgcttaaaaggtggatttcttatttcttcctctgttgattacatcctaagtctgtgtccccctgccttgcctca ggttttttttttttttttttttttaatcagtaaagcaagaataaggtaggatatgggtactcttaactgtgaagac cctgaagtaacaattcaaggaacttttggcatttataatgtacttaagtgtttgctgatacgcgttcatttactga tacatggctttttagttggtcaagccctaaaatgcaaatgcctgtatataactatgactgtgccttcccccaattc acattgtttttaaggatcctcaaaggagaaactacagctgccccacactgtgggcacacaaatgacctgctgatgt 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发明的有益效果

本发明利用外显子组测序发现一种逆向性痤疮相关基因NCSTN。 NCSTN编码的蛋白是γ分泌酶复合体的四个亚单位之一，而γ分泌酶与 AI及阿尔采默氏病(Alzhe imer′s Disease，AD)的发病密切相关 (Kelleher RJ r，JS，Genetics.Gamma-secretase and human disease. D-0404511(-1095-9203(Electronic))：T-ppublish.)。因此该 基因的鉴定对发现AI及其相关疾病的易感人群和基因诊断有重要价值， 对探索AI及其相关疾病的发病机制和开辟新的治疗途径有重要意义。

附图说明

图1：外显子组测序的实验流程图

图2：外显子组测序信息分析流程图

图3：表示AI家系中NCSTN基因3号外显子上c.210_211delAG突 变位点的检测和验证的结果，其中各个泳道分别表示家系2中13个样 本(5名病例，8名家系内正常人)NCSTN基因外显子3及其外显子-内 含子交界区域目的片段PCR扩增产物电泳图，大小：641bp。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市购获得的常规产品。

实施例1：利用外显子组测序捕获逆向性痤疮相关基因

发明人在前述的高敏等(Gao M，Wang PG，Cui Y，et al，Inversa acne (hidradenitis suppurativa)：a case report and identification of the  locus at chromosome 1p21.1-1q25.3.J Invest Dermatol 2006， 126(6)：1302-1306.)研究的基础上，采用外显子组测序对原定位家系中 的成员进行研究，以发现该病的致病基因。

首先，发明人用Agilent SureSelect Human All Exon Kit结合 Solexa高通量测序技术对该家系中的两名病例(II 4 and III 8)和一名家 系内正常人(II 7)的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段 两端分别连接上接头制备杂交文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

2)文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩 增与SureSelect Biotiny lated RNA Libra ry(BAITS)进行杂交富集， 再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序(图1)。测序平台为 Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少 为50。

3)测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7 进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.20(Li R，Li Y， Kristiansen K，et al，SOAP：short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008，24(5)：713-714；Li R，Yu C，Li Y，ea al，SOAP2： an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics  2009，25(15)：1966-1967.)比对参考基因组，获得比对到基因组上的 Unique mapped reads。靶区域的基因型由SOAPsnp(Li R，Li Y，Fang X， Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome  resequencing.Genome Res 2009，19(6)：1124-1132.)确定。然后对数 据进行标准的信息分析流程，包括对SNP、InDel等进行检测、注释和 统计分析。同时对数据进行质控检测，包括测序深度、覆盖度均一性等 分析的检测报告(图2)。

每个个体的平均测序长度为10.36GB，去除了有重复起始位点的 reads后，发明人得到了由RefSeq genes(Pruitt KD，Tatusova T， Maglott DR：NCBI reference sequences(RefSeq)：a curated  non-redundant sequence database of genomes，transcripts and  proteins.Nucleic Acids Res 2007，35(Database issue)：D61-65.) 定义测序深度为50，长度为2.2Gb目的外显子组。平均起来，87.4％的 外显子组被覆盖，测序深度至少为10，平均每个个体发现的遗传变异有 42,678个，包括34,570个非同义突变。

为了从所用突变中找到可能的致病突变，发明人重点关注了非同义 突变和剪接位点突变，认为同义突变致病的可能性较小。与此同时，导 致A I的突变应该是稀有突变，因此它应该在一般人群中缺失。因此， 一个新的突变是这样定义的：它同时不存在于下列数据库中，包括： dbSNP129，8个HapMap个体的外显子组数据(Ng SB，Turner EH， Robertson PD，et al：Targeted capture and massively parallel  sequencing of 12 human exomes.Nature 2009，461(7261)：272-276.)， 1000人基因组计划(Siva N：1000Genomes project.Nat Biotechnol  2008，26(3)：256.)，该家系中正常对照的外显子组数据。

经过上述数据库的筛除后，这两个病例共有的突变还剩8个位于发 明人(高敏等)之前定位的区域1p21.1-1q25.3，他们分别位于以下8 个基因内：MYBPHL，KCNC4，FLAD1，NES，NCSTN，ITLN2，SLC9A11和 Clorf220。接下来，发明人使用ANNOVAR软件(Wang K，Li M，Hakonarson  H：ANNOVAR：functional annotation of genetic variants from  high-throughput sequencing data.Nucleic Acids Res 2010， 38(16)：e164)预测可能有害的基因，将候选基因的范围缩小到5个： MYBPHL，KCNC4，FLAD1，NCSTN，ITLN2。

之后，发明人进一步使用GERP评分(Cooper GM，Goode DL，Ng SB， et al：Single-nucleotide evolutionary constraint scores highlight  disease-causing mutations.Nat Methods 2010，7(4)：250-251.)对这5 个突变基因的有害性进行了排序，NCSTN排序第一，提示其有害性最大。 发明人进一步观察到在个8个候选基因中只有位于NCSTN中的突变是剪 接位点突变，其可能阻止了转录产物的适当剪接，所以发明人推测NCSTN 和AI的发病可能相关。

该突变为位于NCSTN IVS11+1位置上的鸟苷酸由腺苷酸替换(以 下，简称为：c.1352+1G＞A)(图3)。

gcatttcaggcctaaaagagacctcctgcttcccatcccccagcctcccatcagtta atctccctcgtaccccccagGTGGAGGATCTCCTGGCCACATTGGAGAAGAGTGGTGCTGG TGTCCCTGCTGTCATCCTCAGGAGGCCAAATCAGTCCCAGCCTCTCCCACCATCTTCCCTG CAGCGATTTCTTCGAGCTCGAAACATCTCTGGCGTTGTTCTGGCTGACCACTCTGGTGCCT TCCATAACAAtaagaatcacttggccctgca(SEQ ID NO：28)，其中大写字 母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列，深色底色稍大的斜体代 表突变的核苷酸。

实施例2：NCSTN基因第11个内含子c.1352+1G＞A突变的验证

为了验证该突变，发明人对实施例1所述家系的所有9名病例和12 名家系内正常人进行了Sanger测序。

(1)利用PCR扩增了该突变。

提取家系中各样本的基因组DNA，提取方法为：

取AI家系成员外周血4ml，EDTA抗凝，取400μl抽提基因组DNA， 使用Flexi基因DNA抽提试剂盒(Qiagen，Germany)严格按照说明书 进行。将浓度校正至25ng/μl后进行PCR反应。

PCR引物由Primer 3.0 program在线设计，设计的引物序列为：

F1：tttgctcccttcaattctgc(SEQ ID NO：3)和

R1：aacgccactgagcaaagaat(SEQ ID NO：4)。

PCR反应体系10μl，包含1xPCR反应缓冲液1μl，MgCl2(25mmol/l) 1.2μl，dNTPs 0.2μl，上下游引物各0.08μl；AmpliTaq GoldTM(5μ l/l)0.08μl；基因组DNA(25ng/μl)1.5μl，dd H2O 5.86μl。

PCR反应在Perkin Elmer 9700热循环仪上完成。PCR反应条件如 下：预变性94℃10分钟；94℃、57℃、72℃各1分钟，共40个循环， 最后延伸72℃10分钟。

PCR反应产物由QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化后由 ABI PRISM 3730自动测序仪(Applied Biosystems)进行测序。

结果，1352+1G＞A突变在9名病例被验证出来，而12名家系内正常 人均未发现此突变。

实施例3：NCSTN基因3号外显子上c.210_211delAG突变位点的鉴 定

进一步地，发明人选择了第二个AI家系(5名病例，8名对照)对 NCSTN基因的所有17条外显子及外显子-内含子交界区进行了PCR扩增。 扩增引物见表1。PCR反应体系和反应条件同实施例1。

表1NCSTN基因各外显子及外显子-内含子交界区扩增引物

注：其中exon-11引物序列即为鉴定NCSTN IVS11+1位置上的鸟苷 酸由腺苷酸替换(c.1352+1G＞A)的引物序列。

结果显示，在该基因的第3号外显子发现了一个两个核苷酸(AG) 的缺失c.210_211delAG(p.Thr70fsX18)，该缺失被认为从密码子70 开始改变了读码框，它在新读码框的18号密码子提前终止。

catctttaggggataaaagatacgcagaatcagtgaggcaaagtcagaattgttaactatgggag ctttaatttgactcattctgtcctggcagCTTCAATTAGTGGAGACAGGTTATCCACGTAGTA GAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCCCCAACCCCCCTTACATGGTTCTGCT GGAGAGCAAGCATTTTACCAGgtaagaactagatgtatctgctgggaaaacatccatag(SEQ ID  NO：29)(其中大写字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列)。 其中深色底色的斜体字母C和G之间缺失AG。

在以上序列中，以斜体显示的C和G之间缺失了AG。

与此同时，发明人在这两个家系的所有正常对照(第一个家系12 人，第二个家系8人)和90名AI家系外正常人中，针对每例个体采用 表1中所有引物进行扩增，用sanger测序检测了这两个突变，均为阴 性结果。结果表明突变的存在与疾病的有无存在正相关性，另外也证明 表1中的引物能够有效扩增目标序列，同时进行目标序列的突变检测。

实施例4：AI家系中NCSTN基因3号外显子上c.210_211delAG突 变位点的检测和验证

收集实施例3的AI家系成员(5名病例，8名家系内正常人)外周血 4ml，EDTA抗凝，取400μl抽提基因组DNA，使用Flexi基因DNA抽提 试剂盒(Qiagen，Germany)严格按照说明书进行。将浓度校正至25ng/ μl后进行PCR反应。引物为：

上游引物：gggcaacagcttttcagttc(SEQ ID NO：5)

下游引物：cctgcaggatggaaacaaat(SEQ ID NO：6)

PCR反应如下：反应为体系10μl，包含1xPCR反应缓冲液1μl， MgCl2(25mmol/l)1.2μl，dNTPs 0.2μl，上下游引物各0.08μl； AmpliTaq GoldTM(5μl/l)0.08μl；基因组DNA(25ng/μl)1.5μl， dd H2O 5.86μl。PCR反应在Perkin Elmer 9700热循环仪上完成。PCR 反应条件如下：预变性94℃10分钟；94℃、57℃、72℃各1分钟，共40 个循环，最后延伸72℃10分钟。扩增产物641bp，用2％琼脂糖凝胶电 泳检测，结果参见图3。

扩增产物纯化后由ABI PRISM 3730自动测序仪(Applied  Biosystems)直接进行Sanger测序，得到NCSTN基因序列。在PubMed BLAST 数据库中进行核酸同源性检测，发现只有与人NCSTN基因同源性最高。

ggcaacagcttttcagttcaaatctagaggtgcctgtattcacccaaatatgttgtg acatctttaggggataaaagatacgcagaatcagtgaggcaaagtcagaattgttaactat gggagctttaatttgactcattctgtcctggcagCTTCAATTAGTGGAGACACGGGTTA TCCACGTAGTAGAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCCCCAACCCCCC TTACATGGTTCTGCTGGAGAGCAAGCATTTTACCAGgtaagaactagatgtatctgctggg aaaacatccatagagggaaagtttcagtgaacagtcctcacacttattagtgaaaacttcc cttggctgccctggtctggtcaggggagagggcagggtggtcctcagaaggaaaggtgtac catcaaaagaaatgatcttgagcttagggctaaatttcacctacctgtccctgagtaaccc tgggcatccctcccctccctccctggggtccttactcactaaagctctactttttagagca gatcattgtccagactcagaatttagagactgaaagggaagaaataagtcaacagtttgat tcccctagttccccatttgtttccatcctgcagg (SEQ ID NO：30)(其中大写 字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列)

以上序列为UCSC Genome Bioinformatics中NCSTN基因序列 (hg18)(3号外显子及其侧翼序列)

gggcaacagcttttcagttcaaatctagaggtgcctgtattcacccaaatatgttgt gacatctttaggggataaaagatacgcagaatcagtgaggcaaagtcagaattgttaacta tgggagctttaatttgactcattctgtcctggcagCTTCAATTAGTGGAGACAGGTTAT CCACGTAGTAGAGAAAGAGGAGGACCTACAGTGGGTATTGACTGATGGCCCCAACCCCCCT TACATGGTTCTGCTGGAGAGCAAGCATTTTACCAGgtaagaactagatgtatctgctggga aaacatccatagagggaaagtttcagtgaacagtcctcacacttattagtgaaaacttccc ttggctgccctggtctggtcaggggagagggcagggtggtcctcagaaggaaaggtgtacc atcaaaagaaatgatcttgagcttagggctaaatttcacctacctgtccctgagtaaccct gggcatccctcccctccctccctggggtccttactcactaaagctctactttttagagcag atcattgtccagactcagaatttagagactgaaagggaagaaataagtcaacagtttgatt cccctagttccccatttgtttccatcctgcaggca(SEQ ID NO：31)(其中大写 字母代表外显子序列，小写字母代表内含子序列)

以上序列为测序后得到的NCSTN突变基因(c.210_211delAG)(3号 外显子及其侧翼序列)，在深色底色的斜体C和G之间缺失AG。

测序结果表明存在c.210_211delAG突变位点的检测样本都是患病 样本，换言之，二者存在正相关性。

实施例5：检测NCSTN基因3号外显子突变(c.210_211delAG)的 试剂盒的组成及使用方法

A：试剂盒组成

引物：表1中列出的可扩增出NCSTN所有17条外显子的12对引物；

其它成分，包括：PCR反应缓冲液，MgCl2(25mmol/l)，dNTPs， AmpliTaq GoldTM(5μl/l)，dd H2O。

B：使用方法

1)在试剂盒的组成成分中加入待测DNA样品后进行PCR反应；

2)PCR反应产物经纯化后测序，将所得到的序列与NCSTN正常基因 序列比对，确定3号外显子序列第19位碱基的C和G之间是否缺失AG。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。