利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102676624 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676624 A *CN102676624A* (21)申请号 201210161902.4 (22)申请日 2012.05.23 C12P 21/06(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) (71)申请人 河南省农业科学院 地址 450002 河南省郑州市农业路一号 (72)发明人 芦鑫 黄纪念 孙强 侯传伟 宋国辉 张丽霞 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所 ( 普通 合伙 ) 41104 代理人 刘建芳 杨海霞 (54)。

2、 发明名称 利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方 法 (57) 摘要 本发明属于花生蛋白深加工技术领域， 具体 涉及一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽 的方法， 具体为 ： 采用化学改性的磁性壳聚糖微 粒固定碱性和中性两种蛋白酶， 以此进行酶法水 解， 离心、 脱色、 纳滤脱盐、 超滤分级、 喷雾干燥获 得花生活性肽。 较传统制备方法， 该方法具有生产 成本低、 生产周期短、 产品得率高、 纯度高、 生产工 艺具有温和、 绿色、 节能等特点。采用本发明方法 生产出的花生功能肽除了具有良好的溶解性外， 还具有降血压和抗氧化功能， 因此具有广阔的市 场开发价值。 (51)Int.Cl. 权利。

3、要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 1/1 页 2 1. 一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1） 制备化学改性的磁性壳聚糖微粒 ： 在碱性条件下， 将壳聚糖粉末与环氧氯丙烷混合后于50100搅拌反应1-2 h， 然后 加入二胺化合物继续反应 1.5-2.5 h， 反应结束后固液分离， 取固体备用， 投料比按照每 1g 壳聚糖粉末添加 3-5ml 环氧氯丙烷和 1-5ml 二胺化合物计 ； 将固体用稀酸溶解后， 加入三聚磷酸钠和粒径 100nm、 纯度不小于 。

4、95% 的四氧化三铁 超声波搅拌处理， 三聚磷酸钠的加入量为固体重量的 0.05-0.1 倍， 四氧化三铁的加入量为 固体重量的 0.25-0.75 倍， 反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒， 即为改性后的磁性 壳聚糖微粒， 记为固体颗粒 a ； 2） 磁性壳聚糖固定复合蛋白酶 ： 将上述改性后的磁性壳聚糖微粒加入到含 2-5V% 戊二 醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌 1-3 h， 然后加入含复合蛋白酶的磷酸缓冲液继续搅拌 3-6 h， 结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出， 记为固体颗粒 b， 备用 ； 其中， 所述磷酸缓冲 液浓度为 0.05 0.2 mol/L， pH 6.8-8.0 ； 。

5、投料比按照每 1g 改性后的磁性壳聚糖微粒添加 10-30mL 含戊二醛的磷酸缓冲液和 2-6 mL 含复合蛋白酶的磷酸缓冲液计， 复合蛋白酶在体 系中的质量终浓度为 0.1-2.5% ； 3） 制备花生蛋白 ： 将花生饼粕粉碎、 脱油后， 采用碱提酸沉提取花生蛋白 ； 4） 制备花生活性肽 ： 将花生蛋白用蒸馏水溶解并调至 pH 为 8.0 10.5， 然后加入固 体颗粒 b 于 35 50 酶解 2 4h， 酶用量为 3000 4000 u/g 蛋白， 反应结束后调至酶 解反应体系 pH 为 7.0 ； 5） 肽液纯化处理 ： 取步骤 4） 所得酶解反应体系， 将除去固体颗粒后的剩余溶液离。

6、心， 取上清液用活性炭吸附脱色、 纳滤膜脱盐、 超滤膜分离得花生活性肽精制液， 花生肽精制液 再经浓缩、 喷雾干燥制得花生活性肽干粉。 2. 如权利要求 1 所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其特征在于， 步 骤 1） 中， 将壳聚糖用碱液浸泡 6 9 h 后加入环氧氯丙烷 ； 所述的二胺化合物为乙二胺、 1， 4- 丁二胺、 1， 6- 已二胺、 1， 8- 辛二胺或 1， 12- 二氨基十二烷。 3. 如权利要求 1 所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其特征在于， 步 骤 1） 中， 超声波搅拌处理条件为 ： 20 kHZ， 500 800 W， 30 60 m。

7、in， 150 250 rpm。 4. 如权利要求 1 所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其特征在于， 步 骤 2） 中， 复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比 2:1 混合而成， 所述碱性蛋白酶 为蛋白酶2709或蛋白酶Alcalase， 所述中性蛋白酶为胰蛋白酶、 蛋白酶Neutrase或蛋白酶 AS1.398。 5. 如权利要求 1 所述利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其特征在于， 步 骤 3） 具体为 ： 将花生饼粕粉碎后过 60 80 目， 与正己烷混合回流 2 4 h 进行脱油， 脱油 后的花生饼粕粉与水按质量比 1:6 12 混合， 用碱试剂调至 。

8、pH 值为 8 12， 搅拌 1 2h， 4000 4500 rpm 离心 10 20 min， 取沉淀重复碱提过程， 合并两次上清液， 用 80 100 目滤网过滤， 滤液加酸调至 pH 为 4.10 4.60， 静置 10 20 min， 4000 4500 rpm 转速 下离心 10 20 min， 收集沉淀， 即为花生蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102676624 A 2 1/7 页 3 利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法 技术领域 0001 本发明方法涉及花生副产物的深加工技术领域， 具体涉及一种花生活性肽的酶法 制备工艺， 是以花生饼粕为原料， 利用化学改性的磁性壳聚糖。

9、微粒固定复合蛋白酶水解， 从 而获得花生活性肽的方法。 背景技术 0002 花生是世界上种植的主要农作物之一。我国是花生的生产大国， 花生产量常年稳 居世界首位， 花生年产量在 1400 万吨左右。花生营养丰富， 富含优质蛋白和油脂， 脂肪含量 在 44 50%， 蛋白质含量在 24 34%， 且含有多种维生素和矿物质。花生蛋白含有人体所 必需的 8 种氨基酸， 消化性可达 99%， 是营养价值高且资源丰富的植物蛋白资源。由于花生 营养丰富且风味独特， 所以深受我国人民的喜爱。目前， 花生除一部分用于食品加工以外， 50% 以上的花生用于榨油。由此， 我国每年产生数百万吨的蛋白含量大于 50%。

10、 的花生饼粕。 由于我国花生深加工技术和产业化水平低， 花生饼粕中蛋白的利用有限， 大量的花生饼粕 用作动物饲料或肥料， 产品附加值低， 资源浪费严重。因此， 有必要开展花生饼粕中蛋白深 加工方面的研究。 0003 生物活性肽是通过酶法水解、 化学改性或物理作用得到的具有特殊生理功能的肽 类。 生物活性肽具有的生理功能有抗氧化、 调节血压、 促进微量元素吸收、 调节免疫、 调节睡 眠等功效。 与化学药物相比， 生物活性肽具有毒副作用小、 功效平缓、 成本低等优势， 因此国 内外已经有活性肽药品、 保健品上市， 并得到了消费者的认可。研究表明， 花生蛋白采用酶 法水解具有显著的抗氧化、 降低血压。

11、功能， 研究花生饼粕制备花生活性肽有利于开发花生 饼粕这一潜在的蛋白资源， 生产高附加值的蛋白产品。 0004 目前， 花生蛋白生产活性肽的工艺主要有化学处理和酶法水解两大类。化学处理 会降低花生肽的品质， 且生产过程中产生的酸碱废液污染环境， 这限制了化学处理的发展。 采用酶法水解花生蛋白时， 蛋白酶成本较高， 单一酶水解蛋白有限， 且酶在热、 酸碱及有机 溶剂中不稳定， 这也限制酶法制备花生活性肽的工业化转化。固定化酶技术虽然一定程度 上提高酶的利用率， 但是酶解效果不佳。 主要是酶与载体结合后， 形成空间位阻阻碍酶与底 物的结合， 同时， 加入的化学交联剂也会影响酶活。 因此， 提高酶稳。

12、定性、 回收率和酶解效率 是酶法生产活性肽工艺中需要解决的难题。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 采用该 方法所得花生活性肽纯度高且活性好。 0006 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案如下 ： 一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其包括如下步骤 ： 1） 制备化学改性的磁性壳聚糖微粒 ： 在碱性条件下， 将壳聚糖粉末与环氧氯丙烷混合后于 50-70搅拌反应 1-2 h， 然后加 说 明 书 CN 102676624 A 3 2/7 页 4 入二胺化合物继续反应 1.5-2.5 h， 反应结束后固液分离， 取固体备用， 投料。

13、比按照每 1g 壳 聚糖粉末添加3-5ml环氧氯丙烷和1-5ml二胺化合物计 ； 将固体用稀酸 （所用稀酸可以是乙 酸、 盐酸、 硫酸等） 溶解后， 加入三聚磷酸钠和粒径 100nm、 纯度不小于 95% 的四氧化三铁 超声波搅拌处理， 三聚磷酸钠的加入量为固体重量的 0.05-0.1 倍， 四氧化三铁的加入量为 固体重量的 0.25-0.75 倍， 反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒， 即为改性后的磁性 壳聚糖微粒， 记为固体颗粒 a ； 2） 磁性壳聚糖固定复合蛋白酶 ： 将上述改性后的磁性壳聚糖微粒 （即固体颗粒 a） 加入 到含 2-5V% 戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌 1-3 h。

14、， 然后加入含复合蛋白酶的磷酸缓冲 液继续搅拌 3-6 h， 结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出， 记为固体颗粒 b， 备用 （固体 颗粒 b 可 4储存于磷酸缓冲液中， 长期储存时， 应冷冻干燥保存） ； 其中， 所述磷酸缓冲液 浓度为 0.05 0.2 mol/L， pH 6.8-8.0 ； 投料比按照每 1g 改性后的磁性壳聚糖微粒添加 10-30mL 含戊二醛的磷酸缓冲液和 2-6 mL 含复合蛋白酶的磷酸缓冲液计， 复合蛋白酶在体 系中的质量终浓度为 0.1-2.5% ； 3） 制备花生蛋白 ： 将花生饼粕粉碎、 脱油后， 采用碱提酸沉提取花生蛋白 ； 4） 制备花生活性肽 ： 将。

15、花生蛋白用蒸馏水溶解 （以每 1g 花生蛋白用 8 12ml 蒸馏水 溶解为宜） 并调至 pH 为 8.0 10.5， 然后加入固体颗粒 b 于 35 50 酶解 2 4h， 酶用 量为 3000 4000 u/g 蛋白， 反应结束后调至酶解反应体系 pH 为 7.0 ； 酶解过程搅拌转速 以 80 120 rpm 为宜。 0007 5） 肽液纯化处理 ： 取步骤 4） 所得酶解反应体系， 将除去固体颗粒后的剩余溶液离 心， 取上清液用活性炭吸附脱色、 纳滤膜脱盐、 超滤膜分离得花生活性肽精制液， 花生肽精 制液再经浓缩、 喷雾干燥制得花生活性肽干粉。 除去固体颗粒的具体操作可以为 ： 用磁铁。

16、从 酶解反应体系中吸附固体颗粒， 吸附后将其加入到稀碱液中浸泡 10 20 min， 蒸馏水洗至 中性， 4保存。 0008 其中， 活性炭吸附脱色条件具体为 ： 40 60搅拌 30 60 min， 活性炭加入量为 花生饼粕重量的14%。 纳滤膜截留分子量为70200 Da， 超滤膜截留分子量为5000 Da， 操作压力 0.15 0.25 Mpa。 喷雾干燥选用压力喷雾干燥机， 3 5% 肽液浓度， 进口温度 160 180， 出口温度为 70 80， 压力为 1.2 1.6 Mpa。 0009 具体的， 步骤 1） 中， 将壳聚糖用碱液浸泡 6 9 h 后， 加入环氧氯丙烷于 50 10。

17、0搅拌 （搅拌速度在 100 300 rpm 为宜） 反应 1-2 h ； 所述的二胺化合物为乙二胺、 1， 4- 丁二胺、 1， 6- 已二胺、 1， 8- 辛二胺或 1， 12- 二氨基十二烷等。其中， 1g 壳聚糖以用 8 15ml、 浓度 1 mol/L 的碱液浸泡为佳， 所述碱液可以是 NaOH 水溶液、 KOH 水溶液等。 0010 步骤1） 中， 超声波搅拌处理条件为 ： 20 kHZ， 500800 W， 3060 min， 150250 rpm。 0011 步骤 2） 中， 复合蛋白酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比 2:1 混合而成， 所 述碱性蛋白酶为蛋白酶 2709 或。

18、蛋白酶 Alcalase， 所述中性蛋白酶为胰蛋白酶、 蛋白酶 Neutrase 或蛋白酶 AS1.398。 0012 步骤 3） 具体为 ： 将花生饼粕粉碎后过 60 80 目， 与正己烷混合 （以每 1 克花生 饼粕添加 4-8mL 正己烷为宜） 回流 2 4 h 进行脱油， 脱油后的花生饼粕粉与水按质量比 1:6 12 混合， 用碱试剂 （如 NaOH、 KOH 等） 调至 pH 值为 8 12， 机械搅拌 1 2h（搅拌 说 明 书 CN 102676624 A 4 3/7 页 5 速度 100 250 rpm） ， 4000 4500 rpm 离心 10 20 min， 取沉淀重复碱。

19、提过程， 合并两 次上清液， 用 80 100 目滤网过滤， 滤液加酸调至 pH 为 4.10 4.60， 静置 10 20 min， 4000 4500 rpm 转速下离心 10 20 min， 收集沉淀， 即为花生蛋白。 0013 本发明中所用的粒径 100nm、 纯度不小于 95% 的四氧化三铁可以购买符合条件 的市售产品， 也可以按照下述方法制备 ： 氮气保护下， 在Fe3+和Fe2+盐溶液中加入氨水 （Fe3+ 和 Fe2+摩尔比为 2 ： 1， 所加氨水与 Fe3+的摩尔比不小于 20） ， 然后于 60 90搅拌反应 0.5 1.5 h， 反应过程中可通过补加氨水使体系 pH 始。

20、终保持在 10 以上 ； 反应结束后固液 分离， 所得固体为四氧化三铁微球 ； 可暂储存于 pH 2-4 的乙酸水溶液中， 备用。 0014 本发明提供了一种利用固定化酶制备花生肽的生产工艺， 该方法采用化学共价方 法改性磁性壳聚糖微粒， 使酶与载体之间通过碳链连接， 既提高了固定化酶的酶活又不影 响固定化酶的稳定性 ； 固定复合蛋白酶， 提高了酶法水解的效率 ； 膜分离、 脱盐和干燥获得 的花生活性肽纯度高且活性好。本发明方法提高花生副产物的综合利用率， 不但能为社会 带来可观的经济价值， 而且具有生理保健功能的活性肽产品可以提高我国居民身体素质， 具有积极的社会价值。 0015 与现有技术。

21、相比， 本发明方法的优点和有益效果如下。 0016 1、 采用本发明方法生产出来的花生肽纯度高、 活性好。其中肽含量高于 85%， 灰分 含量小于5%， 脂肪含量小于2%， 干燥失重小于5%， 分子量小于1000 Da的短肽含量大于60%， 三氯乙酸氮溶解指数大于 99% ； 花生活性肽 ACE 抑制活性 ( 降血压 ) 的 IC50小于 0.6 mg/ mL， 20 mg/mL 花生活性肽抗氧化活性大于 50%。 0017 2、 采用改性磁性壳聚糖微粒固定复合蛋白酶酶活高， 性质稳定， 耐储藏。 通过增加 酶与载体间的碳链， 固定化酶的水解活性较传统固定化酶提高 2 倍以上。经过上述改性磁 。

22、性壳聚糖微粒固定的复合蛋白酶， 适用 pH 范围增宽， 且 45 55依然具有较好的热稳定 性。前五次重复使用后酶活力可保留同等量游离酶活力的 50 95%， 重复使用 10 次， 残留 酶活力为原有酶活的 10 20%。 0018 3、 采用喷雾干燥制备活性肽粉， 一方面提高缩短了干燥时间， 提高生产效率， 另一 方面提高了肽粉的复水溶解性。 0019 4、 本发明中在常温下采用膜分离技术对料液进行分离纯化脱盐， 高效节能且无污 染。 0020 5、 本发明方法生产效率高， 成本低， 生产工艺安全、 环保、 节能， 产品品质高， 可广 泛用于化妆品、 食品、 药品等领域。 具体实施方式 00。

23、21 以下通过优选实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明的保护范围并不局限 于此。 0022 实施例 1 ： 一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其包括如下步骤 ： 1） 制备化学改性的磁性壳聚糖微粒 ： 氮气保护下， 取 13.9914 g FeCl36H2O 和 5.1465 g 的 FeCl24H2O 加入到 240 mL 蒸 馏水中， 于 80搅拌 1h（转速 400 rpm） ， 随即逐滴加入 80 mL 质量浓度 28% 的氨水反应 30 说 明 书 CN 102676624 A 5 4/7 页 6 min， 反应过程中需补加氨水使体系pH始终保持在10以上 ； 反。

24、应结束后冷却至室温， 固液分 离， 所得固体为四氧化三铁 ； 用水洗涤后， 暂存于 pH 2-4 的乙酸水溶液中， 备用。 0023 称取 36 g 壳聚糖粉末， 加入到 360 mL 1mol/L 的 NaOH 中室温浸泡 6 h， 然后加入 110 mL 环氧氯丙烷于 60、 120 rpm 搅拌反应 1h， 随后加入 72 mL 1,6- 已二胺继续反应 2h， 反应结束后固液分离， 固体水洗后沥干水， 备用， 记为改性壳聚糖微粒。 0024 取 20g 上述所得固体 （即改性壳聚糖微粒） 用 3000 mL 1% 乙酸溶液搅拌溶解后， 加入 5g 四氧化三铁和 2.0 g 三聚磷酸钠，。

25、 超声波搅拌处理 40 min（条件为 20 kHZ， 600 W， 150 rpm） 。反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒， 该固体颗粒即为改性后的磁性壳聚 糖微粒， 记为固体颗粒 a， 水洗后沥干水， 备用。 0025 2） 磁性壳聚糖固定复合蛋白酶 ： 将上述所得改性后的磁性壳聚糖微粒 （即固体颗 粒 a） 加入到 1000 mL 含 3V% 戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌 1h， 然后加入含 6wt% 复合 蛋白酶 （复合蛋白酶由酶活比为 2:1 的碱性蛋白酶 2709 和胰蛋白酶混合而成） 的磷酸缓冲 液 200 mL 继续搅拌 4 h， 结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出， 记。

26、为固体颗粒 b， 该固 体颗粒 b 即为固定复合蛋白酶的壳聚糖微粒， 备用 ； 其中， 所述磷酸缓冲液浓度为 0.05mol/ L， pH 8.0 ； 复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为 1%。 0026 3） 制备花生蛋白 ： 将花生饼粕粉碎、 脱油后， 采用碱提酸沉提取花生蛋白， 具体为 ： 称取 1000 g 市售低温压榨花生饼粕 （蛋白质含量 54.85%） ， 用粉碎机粉碎至 80 目， 加入 8L 正己烷于85回流3 h进行脱油。 回流完毕冷却至室温， 除去正己烷， 将脱油后的花生饼粕 粉转移到反应器中， 加入脱油后花生饼粕粉 6 倍重量份的蒸馏水， 机械搅拌至分散均匀， 用 1 m。

27、ol/L 的食品级 NaOH 调整体系 pH 到 9.0， 搅拌 60 min， 随后 4000 rpm 离心 15 min， 取沉 淀重复碱提过程， 合并两次上清液用100目滤网过滤， 用1mol/L食品级盐酸调节滤液pH 值 在 4.3 4.4 之间， 静置 15 min， 4000 rpm 离心 20 min， 收集沉淀， 即为花生蛋白。 0027 4） 制备花生活性肽 ： 将花生蛋白用蒸馏水溶解 （每1g花生蛋白用8ml蒸馏水溶解） 并调至 pH 为 9 10， 然后加入固体颗粒 b 于 45酶解 2h， 酶用量为 3500 u/g 蛋白， 反应 结束后调至酶解反应体系pH为7.0 ；。

28、 酶解过程中需要搅拌， 搅拌转速以80120 rpm为宜。 0028 5） 肽液纯化处理 ： 取步骤 4） 所得酶解反应体系， 将除去固体颗粒后的剩余溶液离 心， 取上清液用活性炭吸附脱色 （50搅拌40 min， 抽滤除去活性炭） 、 脱色后的酶解液用截 留分子量为 150 Da 的纳滤膜稀释 10 倍脱盐， 脱盐后的酶解液用截留分子量为 5000 Da 的 超滤膜分离得花生活性肽精制液， 花生肽精制液旋转蒸发浓缩至肽浓度 3% 左右， 经喷雾干 燥制得 245.32 g 花生活性肽干粉。 0029 获得的花生活性肽干粉是一种乳白色粉末， 干基情况下， 肽含量为 89%， 灰分为 3%， 脂。

29、肪含量为 0.8%， 糖含量为 7.2% ； 三氯乙酸氮溶解指数为 99%， 分散指数为 99.7%。花生 活性肽 ACE 抑制活性 ( 降血压 ) 的 IC50小于 0.52 mg/mL, 20 mg/mL 花生活性肽抗氧化活 性 56%。 0030 实施例 2 ： 一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其包括如下步骤 ： 1） 制备化学改性的磁性壳聚糖微粒 ： 氮气保护下， 取 27.9828 g FeCl36H2O 和 11.5862 g 的 FeSO44H2O 加入到 240 mL 蒸 馏水中， 于 60搅拌 1h （转速 400 rpm） ， 随即逐滴加入 100 mL 质。

30、量浓度 28% 的氨水反应 60 说 明 书 CN 102676624 A 6 5/7 页 7 min， 反应过程中需补加氨水使体系pH始终保持在10以上 ； 反应结束后冷却至室温， 固液分 离， 所得固体为四氧化三铁 ； 用水洗涤后， 暂存于 pH 2-4 的乙酸水溶液中， 备用。 0031 称取 40 g 壳聚糖粉末， 加入到 360 mL 1mol/L 的 NaOH 中室温浸泡 8 h， 然后加入 160 mL 环氧氯丙烷于 55、 150 rpm 搅拌反应 2h， 随后加入 120mL 1,4- 丁二胺继续反应 2.5h， 反应结束后固液分离， 固体水洗后沥干水， 备用， 记为改性壳聚。

31、糖微粒。 0032 将 30g 上述所得固体 （即改性壳聚糖微粒） 用 3000 mL 1% 乙酸溶液搅拌溶解后， 加 入 10 g 四氧化三铁和 1.5g 三聚磷酸钠， 超声波搅拌处理 30 min（条件为 20 kHZ， 800 W， 150 rpm） 。反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒， 该固体颗粒即为改性后的磁性壳聚 糖微粒， 记为固体颗粒 a， 水洗后沥干水， 备用。 0033 2） 磁性壳聚糖固定复合蛋白酶 ： 将上述改性后的磁性壳聚糖微粒 （即固体颗粒 a） 加入到 1000 mL 含 4V% 戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌 2h， 然后加入含 10wt% 复合蛋白 酶 （复。

32、合蛋白酶由酶活比为 2:1 的碱性蛋白酶 2709 和中性蛋白酶 Neutrase 混合而成） 的 磷酸缓冲液 200 mL 继续搅拌 6 h， 结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出， 记为固体颗 粒 b， 该固体颗粒 b 即为固定复合蛋白酶的壳聚糖微粒， 备用 ； 其中， 所述磷酸缓冲液浓度为 0.05mol/L， pH 7.5 ； 复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为 1.67%。 0034 3） 制备花生蛋白 ： 与实施例 1 中的步骤 3） 相同。 0035 4） 制备花生活性肽 ： 将花生蛋白用蒸馏水溶解 （每 1g 花生蛋白用 10ml 蒸馏水溶 解） 并调至 pH 为 8 9， 然后。

33、加入固体颗粒 b 于 45酶解 4h， 酶用量为 4000u/g 蛋白， 反 应结束后调至酶解反应体系 pH 为 7.0 ； 酶解过程中需要搅拌， 搅拌转速以 80 120 rpm 为 宜。 0036 5） 肽液纯化处理 ： 取步骤 4） 所得酶解反应体系， 将除去固体颗粒后的剩余溶液离 心， 取上清液用活性炭吸附脱色 （60搅拌30 min， 抽滤除去活性炭） 、 脱色后的酶解液用截 留分子量为 150 Da 的纳滤膜稀释 15 倍脱盐， 脱盐后的酶解液用截留分子量为 5000 Da 的 超滤膜分离得花生活性肽精制液， 花生肽精制液旋转蒸发浓缩至肽浓度 5% 左右， 经喷雾干 燥制得 238。

34、.68 g 花生活性肽干粉。 0037 获得的花生活性肽干粉是一种乳白色粉末， 干基情况下， 肽含量为 89.8%， 灰分为 2.7%， 脂肪含量为 0.7%， 糖含量为 6.8% ； 三氯乙酸氮溶解指数为 99%， 分散指数为 99.7%。花 生活性肽 ACE 抑制活性 ( 降血压 ) 的 IC50小于 0.59 mg/mL, 20 mg/mL 花生活性肽抗氧化 活性 51%。 0038 实施例 3 一种利用固定化酶从花生饼粕中生产活性肽的方法， 其包括如下步骤 ： 1） 制备化学改性的磁性壳聚糖微粒 ： 氮气保护下， 取 25.6741 g Fe2(SO4)3和 7.1909 g 的 Fe。

35、SO44H2O 加入到 250 mL 蒸馏 水中， 于 70搅拌 1h（转速 400 rpm） ， 随即逐滴加入 100 mL 质量浓度 28% 的氨水反应 60 min， 反应过程中需补加氨水使体系pH始终保持在10以上 ； 反应结束后冷却至室温， 固液分 离， 所得固体为四氧化三铁 ； 用水洗涤后， 暂存于 pH 2-4 的乙酸水溶液中， 备用。 0039 称取 36 g 壳聚糖， 加入到 360 mL 1mol/L 的 NaOH 中室温浸泡 8 h， 然后加入 160 mL 环氧氯丙烷于 70、 150 rpm 搅拌反应 1h， 随后加入 130mL 1， 8- 辛二胺继续反应 1.5h。

36、， 反应结束后固液分离， 固体水洗后沥干水， 备用， 记为改性壳聚糖微粒。 说 明 书 CN 102676624 A 7 6/7 页 8 0040 将 26 g 上述所得固体 （即改性壳聚糖微粒） 用 3000 mL 1% 乙酸溶液搅拌溶解后， 加入 6.5 g 四氧化三铁和 2.6 g 三聚磷酸钠， 超声波搅拌处理 40 min（条件为 20 kHZ， 600 W， 150 rpm） 。反应完毕后用磁铁吸附体系中的固体颗粒， 该固体颗粒即为改性后的磁性壳 聚糖微粒， 记为固体颗粒 a， 水洗后沥干水， 备用。 0041 2） 磁性壳聚糖固定复合蛋白酶 ： 将上述改性后的磁性壳聚糖微粒 （即固。

37、体颗粒 a） 加入到 1000 mL 含 5V% 戊二醛的磷酸缓冲液中室温下搅拌 2h， 然后加入含 8wt% 复合蛋白 酶 （复合蛋白酶由酶活比为 2:1 的碱性蛋白酶 Alcalase 和胰蛋白酶混合而成） 的磷酸缓冲 液200 mL继续搅拌4h， 结束后用磁铁将体系中的固体颗粒吸附出， 记为固体颗粒b， 该固体 颗粒 b 即为固定复合蛋白酶的壳聚糖微粒， 备用 ； 其中， 所述磷酸缓冲液浓度为 0.2mol/L， pH7.5 ； 复合蛋白酶在体系中的质量终浓度为 1.3%。 0042 3） 制备花生蛋白 ： 与实施例 1 中的步骤 3） 相同。 0043 4） 制备花生活性肽 ： 将花生。

38、蛋白用蒸馏水溶解 （每 1g 花生蛋白用 12ml 蒸馏水溶 解） 并调至 pH 为 8 9， 然后加入固体颗粒 b 于 35酶解 4h， 酶用量为 3500u/g 蛋白， 反 应结束后调至酶解反应体系 pH 为 7.0 ； 酶解过程中需要搅拌， 搅拌转速以 80 120 rpm 为 宜。 0044 5） 肽液纯化处理 ： 取步骤 4） 所得酶解反应体系， 将除去固体颗粒后的剩余溶液离 心， 取上清液用活性炭吸附脱色 （60搅拌30 min， 抽滤除去活性炭） 、 脱色后的酶解液用截 留分子量为 150 Da 的纳滤膜稀释 12 倍脱盐， 脱盐后的酶解液用截留分子量为 5000 Da 的 超滤。

39、膜分离得花生活性肽精制液， 花生肽精制液旋转蒸发浓缩至肽浓度 5% 左右， 经喷雾干 燥制得 249.75 g 花生活性肽干粉。 0045 获得的花生活性肽干粉是一种乳白色粉末， 干基情况下， 肽含量为 89.6%， 灰分为 2.9%， 脂肪含量为 0.7%， 糖含量为 6.8% ； 三氯乙酸氮溶解指数为 99%， 分散指数为 99.7%。花 生活性肽 ACE 抑制活性 ( 降血压 ) 的 IC50小于 0.51 mg/mL, 20 mg/mL 花生活性肽抗氧化 活性 54%。 0046 上述各实施例中所用到的相关测定方法如下。 0047 三氯乙酸氮溶解指数测定方法 分别取两份质量相同 （1g。

40、） 的花生活性肽干粉， 将其中一份用 10 mL 蒸馏水溶解， 随后 加入10 mL浓度10%的三氯乙酸溶液混匀， 静置30min， 3500rpm离心5min， 采用凯氏定氮法 计算上清液中可溶性氮的质量 (g) 和另外一份中总氮的质量 (g)。计算公式如下 ： 三氯乙酸氮溶解指数 （%） =( 上清液中氮质量 / 总氮质量 )100 三氯乙酸氮溶解指数越高， 表明肽粉中蛋白、 多肽等杂质含量越低， 肽粉纯度越高。 0048 ACE 抑制活性测定方法 将花生活性肽干粉适当稀释 （浓度0.51mg/mL） ， 使用96孔酶标板作为反应容器。 取 20L 样液 ( 无抑制的反应液用蒸馏水代替 )。

41、 与 40 L 底物溶液 （底物是 4.66 mmol/L 马尿 酰 - 组氨酰 - 亮氨酸的氯化钠磷酸缓冲液） 混合， 然后加入 40L 浓度为 12.5 m/mL 血管 紧张素转换酶液(对照液中以蒸馏水代替)， 在微孔板混合器上混匀后置于37C恒温箱中 反应 1 h， 然后加入 150L 浓度 1.2 mol/L NaOH 溶液终止酶反应。接着在反应液中加入 2% 邻苯二甲醛甲醇溶液 40 L 混匀， 室温下静置 20 min 后加入 6 mol/L 的 HCl 溶液 40 L 终 止衍生反应。将上述溶液稀释 50 倍后， 测定荧光吸收强度， 测定的激发波长 340 nm ； 发射 说 明。

42、 书 CN 102676624 A 8 7/7 页 9 波长为 455 nm ； 狭缝宽度为 5 nm。样液的 ACE 抑制活性的计算公式如下 ： ACE 抑制率 （%） = 1-(a-c) (b-d) 100 式中， a 表示抑制剂与 ACE 都存在时的荧光吸收强度 ； b 表示抑制剂不存在而 ACE 存在时的荧光吸收强度 ； c 表示抑制剂存在而 ACE 不存在时的荧光吸收强度 ； d 表示抑制剂与 ACE 都不存在时的荧光吸收强度。 0049 ACE抑制率越大， 表明该样品的ACE抑制活性越强。 以抑制剂浓度的对数值为横坐 标， 以抑制率为纵坐标， 绘制回归曲线， 计算抑制率达到 50%。

43、 时抑制剂的浓度， 即为半抑制 浓度， 记为 IC50。IC50值越小， 说明抑制剂对 ACE 活性的抑制能力越强。 0050 抗氧化活性测定方法 将花生活性肽干粉溶于水 （浓度 15 20 mg/mL） ， 取一定体积的上清液加入 10 mL 50 mmol/L pH7.0 的磷酸缓冲液和 10 mL 1.3% 亚油酸乙醇溶液， 定容至 25 mL， 置于 40暗室 中反应 10 min。从中取 80 L 溶液， 加入 100 L 1%KSCN 乙醇溶液和 100 l 1.3 mmol/L FeCl2乙醇溶液于酶标板中， 测定波长为 492 nm。抗氧化计算公式如下 ： AA（%） =Ao-As/Ao100 式中 ： AA 为抗氧化能力 ； Ao为空白吸光度 ； As为加抗氧化剂的样品吸光度。AA 值越高， 表明该物质的抗氧化能力越强。 说 明 书 CN 102676624 A 9 。