技术领域
本发明涉及新型的抗人NGF抗体，更具体而言涉及抗人NGF抗 体的Fab’片段。
背景技术
神经生长因子（nerve growth factor；NGF）为总称为神经营养因 子（neurotrophic factor）的体液因子之一，在生物体内在神经元的发生、 分化、功能维持中承担了重要的作用。作为NGF的受体，已知有高亲 和性的trkA受体（受体型酪氨酸激酶）和低亲和性的p75NTR受体。 其中，已有报道称p75NTR与全部的神经营养因子结合、并在神经元 的发生过程中涉及细胞凋亡，但其作用还未充分明确。另一方面，已 知NGF和trkA受体的基因敲除小鼠显示出同样的表型（非专利文献1）， 且认为NGF的生理作用主要通过trkA受体进行表现。
1993年时有报道称通过对大鼠给药NGF可诱发疼痛（非专利文献 2），之后有报道称通过对人静脉内给药NGF可产生全身性的肌肉痛， 并且通过局部给药，除全身的效果外还会诱发注射部位的痛觉过敏和 异常性疼痛（非专利文献3）。另外，有报道称trkA受体的基因敲除 小鼠缺乏痛觉（非专利文献4），认为NGF是与疼痛的表现紧密相关 的分子。关于与人疼痛病理状态的相关性，已证实：退行性关节病 （osteoarthritis；OA）的关节软骨中NGF/trkA的表达亢进（非专利文 献6）、风湿病性关节炎（非专利文献7）、间质性膀胱炎（非专利文 献8）的患者中NGF水平上升。
从这些事实可知，若能够开发出与NGF特异性结合、且具有抑制 其作用的活性的单克隆抗体，则可期待对以疼痛为代表的与NGF相关 的各种疾病的治疗、预防、诊断有用。
至今，作为临床开发不断推进的人NGF的抗体，已报道了作为人 化抗人NGF抗体的Tanezumab（专利文献1）和PG110（专利文献2）、 作为全人抗人NGF抗体的REGN475（专利文献3）、Fulranumab（专 利文献4）、和MEDI-578（专利文献5）。其中，Tanezumab是最先 进行开发的，有报道称从其临床结果可知，其对于与退行性关节病相 伴的关节痛、慢性腰痛、与间质性膀胱炎相伴的膀胱痛等疼痛，显示 出了强大且广范围的镇痛效果（非专利文献9～11）。
一般而言，作为规定抗体药物的有效给药量的主要要素，可以列 举抗体所具有的对抗原的中和活性、存在于体内的抗原的量，中和活 性的提高与给药量的降低相联系，可以说结果就是与患者的经济负担、 医疗成本的降低也相关的极其有益的改良。另外，若能够实现给药量 的降低，则也能够进行皮下给药。关于皮下给药，若满足一定的条件 则具有能够在家里进行自我注射的最大优点，另外，一般而言静脉内 给药在大多数情况下需要一定时间实施点滴给药，与此相对，皮下给 药在能够以丸剂进行给药的方面也是有用的，对于医师和患者双方而 言，期望能够选择静脉内给药制剂和皮下给药制剂。但是，一般而言， 皮下给药1次能够给药的容量为1mL左右，量少，为了表现出药效， 需要在该液量中含有充分的抗体。另外，与静脉内给药不同，也必须 考虑到生物利用度。即，为了实现皮下给药的制剂，要求制作出溶解 性优良、并且即使用量低也可表现出充分的药效的抗体。因此，对NGF 的中和活性比现有的抗体更高的抗体的获得，对于与NGF相关的疾病 的治疗和其便利性的提高是有用的。
另外，如前所述，NGF是对于神经元的发育而言重要的因子，在 抑制NGF的功能的药品的开发中，也需要从安全性的观点进行充分的 研究。特别是作为在安全性方面应当进行研究的事项之一，可列举出 对胎儿的影响。至今，关于NGF的功能抑制，已报道了：NGF突变是 先天性无痛症的原因（非专利文献5）；在动物实验中，若使妊娠豚鼠 产生对NGF的自身抗体来抑制生物体内的NGF，则生产的新生仔豚鼠 呈现出无痛症状（非专利文献12）。另外，使用NGF、trkA的缺陷小 鼠的试验也证实，由于NGF作用的缺失，胚胎的感觉神经和交感神经 的神经元的发育受到抑制（非专利文献4和13），从这些事实可以理 解NGF是发生初期的神经发育所必需的因子。另一方面，NGF所涉及 的疾病中也包括：间质性膀胱炎（半数以上的患者为44岁以下，患者 的90%为女性（非专利文献14））、慢性腰痛（平均年龄为40～50岁， 大于50%的患者为女性（非专利文献15～17））、偏头痛（多发于15～40 岁，患者的80%为女性（非专利文献18））等在妊娠适龄期的女性中 以高比例发生的疾病。从这种状况可知，在开发抗NGF抗体作为药品 的情况下，极其重要的是回避对妊娠中的女性的胎儿的副作用风险。
另外，关于开发抗NGF抗体作为药品的情况的另一风险要素，可 列举出免疫复合物（IC）的形成。抗体与抗原结合而成的免疫复合物 通常在脾脏、肝脏等的网状内皮系统中被处理掉，但在免疫异常等病 理状态时、所形成的IC尺寸大时，IC失去可溶性，血栓形成的风险增 高，并且会蓄积于肾小球，从而与肾炎的发病相关。IgG为2价抗体， 在抗原为多价的情况下，IC由于晶格形成（lattice formation）可得到 各种尺寸。IC的尺寸取决于抗体与抗原的量、比、抗体的亲和性等， 例如已有报道称，抗VEGF抗体Bevacizumab（商品名：アバスチン） 为IgG1抗体，其与二聚体的VEGF结合形成IC，可诱发血栓形成。具 体而言，对人FcγRIIα受体Tg小鼠给药アバスチン和VEGF时，观察 到形成肺动脉血栓（非专利文献19）。另外有报道称，接受了化疗法 和アバスチン的治疗的转移性癌的患者与仅进行化疗法的安慰剂组相 比，动脉血栓的发生率高（非专利文献20）。NGF在生物体内也通过 形成二聚体来发挥生理作用，因此在抗NGF抗体的药品开发中，期望 回避IC形成的风险，进一步提高安全性。
由此可见，保持了高的中和活性并且降低了对胎儿的影响、血栓 形成等副作用风险的安全性优良的抗NGF抗体的获得，对于与NGF 相关的各种疾病的治疗或预防而言是极其重要的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2004/058184
专利文献2：WO2005/061540
专利文献3：WO2009/023540
专利文献4：WO2005/019266
专利文献5：WO2006/077441
非专利文献
非专利文献1：Conover JC,et al,Rev Neurosci.1997,8:13-27.
非专利文献2：Lewin GR,et al,J Neurosci.1993,13:2136-48.
非专利文献3：Petty BG,et al,Ann Neurol.1994,36:244-6.
非专利文献4：Smeyne RJ,et al,Nature.1994,368:246-9.
非专利文献5：Indo Y,et al,Nat Genet.1996,13:485-8.
非专利文献6：Iannone F,et al,Rheumatology2002,41:1413-8.
非专利文献7：Aloe L,et al,Clin Exp Rheumatol.1997,15:433-8.
非专利文献8：Lowe EM,et al,Br J Urol.1997,79:572-7.
非专利文献9：Lane NE,et al,N Engl J Med.2010,363:1521-31.
非专利文献10：Evans RJ,et al,J Urol.2011,185:1716-21.
非专利文献11：Katz N,et al,Pain.2011,in press
非专利文献12：Johnson EM Jr,et al,Science.1980,210:916-8.
非专利文献13：Crowley C,et al,Cell.1994,76:1001-11.
非专利文献14：Payne CK,et al,J Urol.2007,177:2042-9.
非专利文献15：Manchikanti L,et al,Pain Physician.2010, 13:E279-92.
非专利文献16：Wilkens P,et al,JAMA.2010,304:45-52.
非专利文献17：Buynak R,et al,Expert Opin Pharmacother.2010, 11:1787-804.
非专利文献18：Sakai F,et al,Cephalalgia.1997,17:15-22.
非专利文献19：Meyer T,et al,J Thromb Haemost.2009,7:171-81.
非专利文献20：Scappaticci FA,et al,J Natl Cancer Inst.2007, 99:1232-9.
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供保持了高的中和活性并且降低了对胎儿的 影响、血栓形成等副作用风险的安全性优良的抗人NGF抗体或其抗原 结合片段。
用于解决问题的方法
本发明包括作为医学上或产业上有用的物质和方法的以下的发 明。
[1]一种抗人NGF抗体Fab’片段，其包括由序列号6所示的氨基 酸序列构成的重链可变区和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链 可变区。
[2]如[1]所述的Fab’片段，其中，所述Fab’片段的重链恒定区为 人Igγ1恒定区。
[3]如[1]所述的Fab’片段，其中，所述Fab’片段的轻链恒定区为 人Igκ恒定区。
[4]如[1]所述的Fab’片段，其中，所述Fab’片段的重链恒定区为 人Igγ1恒定区，所述Fab’片段的轻链恒定区为人Igκ恒定区。
[5]如[1]所述的Fab’片段，其包括由序列号10、序列号14或序列 号16所示的氨基酸序列构成的重链片段和由序列号12所示的氨基酸 序列构成的轻链。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的Fab’片段，其结合有聚乙二醇。
[7]一种多核苷酸，其包含编码[1]～[6]中任一项所述的Fab’片段的 重链片段的序列。
[8]一种多核苷酸，其包含编码[1]～[6]中任一项所述的Fab’片段的 轻链的序列。
[9]一种表达载体，其包含[7]和/或[8]所述的多核苷酸。
[10]一种用[9]所述的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[11]如[10]所述的宿主细胞，其选自由下述（a）和（b）所构成 的组，
（a）用含有包含编码[1]～[6]中任一项所述的Fab’片段的重链片段 的序列的多核苷酸和包含编码该Fab’片段的轻链的序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞；以及
（b）用含有包含编码[1]～[6]中任一项所述的Fab’片段的重链片段 的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该Fab’片段的轻链的序 列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[12]一种生产[1]～[6]中任一项所述的Fab’片段的方法，其包括培 养[10]或[11]所述的宿主细胞而使抗人NGF抗体Fab’片段表达的步骤。
[13]一种疼痛治疗药，其包含[1]～[6]中任一项所述的Fab’片段。
[14]如[13]所述的治疗药，其中，所述疼痛为伴随退行性关节病 的关节痛。
[15]一种用于预防或处置疼痛的方法，其包括给药[1]～[6]中任一 项所述的Fab’片段的步骤。
[16]如[15]所述的方法，其中，所述疼痛为伴随退行性关节病的 关节痛。
[17][1]～[6]中任一项所述的Fab’片段，其用于疼痛的预防或处置。
[18]如[17]所述的Fab’片段，其中，所述疼痛为伴随退行性关节 病的关节痛。
发明效果
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段对于人NGF参与发病的各种疾 病的预防或治疗是有用的。这种本发明的抗人NGF抗体Fab’片段由于 其高的中和活性，带来了给药量的减少、给药间隔的扩大、给药方法 的改善（例如皮下注射剂）等临床应用中的优良的改善，并且对胎儿 的影响、血栓形成等副作用风险得到降低，安全性非常优良，其对于 人NGF参与发病的各种疾病的预防、治疗具有显著贡献。
附图说明
图1中示出了小鼠胶原诱导关节炎模型的足底中抗体滞留量的经 时变化。
具体实施方式
以下对本发明进行详述。
本发明人在抗人NGF抗体或其抗原结合片段的制作方面反复进行 了相当独创性的研究，结果成功地制作出保持了高的中和活性并且降 低了对胎儿的影响、血栓形成等副作用风险的安全性优良的抗人NGF 抗体Fab’片段。
抗体分子的基本结构在各类中共通，由分子量5万～7万的重链和 2～3万的轻链构成。重链通常由包含约440个氨基酸的多肽链构成，每 类具有特征性的结构，对应于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE称为γ、μ、 α、δ、ε链。进而，IgG中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，分别称为γ1、 γ2、γ3、γ4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知L 型和K型这两种，分别称为λ、κ链。对于抗体分子的基本结构的肽构 成而言，同源的两条重链和同源的两条轻链通过二硫键(S-S键)和非共 价键键合，分子量为15万～19万。两种轻链可以与任何一种重链成对。 各个抗体分子经常由相同的两条轻链与相同的两条重链形成。
链内S-S键在重链中有四个(μ、ε链中有五个)、在轻链中有两个， 每100～110个氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，被 称为结构单元或结构域。对于重链、轻链中均位于N末端的结构域而 言，即使是来自于同种动物的同一类(亚类)的标准品，其氨基酸序列也 并非恒定，称为可变区，各结构域分别称为重链可变区(VH)和轻链可变 区(VL)。由此向C末端侧的氨基酸序列在各类或亚类中基本恒定，称 为恒定区，各结构域分别表示为CH1、CH2、CH3或CL。
抗体的抗原决定部位由VH和VL构成，结合的特异性由该部位的 氨基酸序列决定。另一方面，与补体或各种细胞的结合等生物学活性 反映了各类Ig的恒定区结构的差异。重链和轻链的可变区的可变性大 致限于两种链中均存在的3个小的高变区，将这些区域称为互补决定 区(CDR；从N末端侧起分别为CDR1、CDR2、CDR3)。可变区的其余 部分称为框架区(FR)，较为恒定。
位于抗体的重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间的区域被 称为铰链区，该区域包含大量脯氨酸残基，包含连接两条重链的多个 链间S-S键。例如，人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各铰链区中分别 含有构成重链间的S-S键的半胱氨酸残基2个、4个、11个、2个。铰 链区是对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白分解酶的敏感性高的区域。在 用木瓜蛋白酶消化抗体的情况下，重链在比铰链区的重链间S-S键更靠 近N末端侧的位置被切断，被分解为2个Fab片段和1个Fc片段。Fab 片段由轻链和包含重链可变区（VH）、CH1结构域和铰链区的一部分 的重链片段构成。在用胃蛋白酶消化抗体的情况下，重链在比铰链区 的重链间S-S键更靠近C末端侧的位置被切断，生成F（ab’）2片段。 F（ab’）2片段是2个Fab’片段通过铰链区中的重链间S-S键进行键合 的二聚体结构的片段。Fab’片段由轻链和包含重链可变区（VH）、CH1 结构域和铰链区的一部分的重链片段构成，且该铰链区的部分中含有 构成重链间S-S键的半胱氨酸残基。Fab片段、F（ab’）2片段、Fab’ 片段均包含可变区，具有抗原结合活性。
本发明人成功制作出的本发明的抗人NGF抗体Fab’片段是具有以 下的特征的Fab’片段。
一种抗人NGF抗体Fab’片段，其包括由序列号6所示的氨基酸序 列构成的重链可变区和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链可变 区。
具体而言，本发明人使用人单克隆抗体开发技术“VelocImmune” (VelocImmune antibody technology；Regeneron公司(美国专利6596541 号))小鼠来制作抗体，通过使用各种生物学活性试验和物性试验的抗体 筛选，成功地鉴定了本发明的抗人NGF抗体Fab’片段。对于 Velocimmune技术而言，用目标抗原(例如，人βNGF)对内源性的免疫 球蛋白重链和轻链的可变区被对应的人可变区置换后的转基因小鼠进 行免疫，然后，获取表达抗体的小鼠的淋巴系细胞，通过与小鼠骨髓 瘤细胞进行细胞融合而制作杂交瘤。接着，针对是否产生特异性地与 目标抗原结合且具有所期望的中和活性的抗体对将该杂交瘤细胞进行 筛选。在此，产生的抗体为具有人抗体的可变区和小鼠抗体的恒定区 的抗体(本说明书中也称为嵌合抗体)。接着，在鉴定出特异性地与目标 抗原结合且具有所期望的中和活性的抗体的情况下，从该杂交瘤细胞 中分离出编码抗体的重链和轻链的可变区的DNA，将该DNA与编码 期望的类的人抗体重链和轻链的恒定区的DNA连接。使这样得到的编 码重链和轻链的基因在细胞内(例如，CHO细胞)表达而产生抗体分子。 利用该方法制作的抗体的重链和轻链是来源于人免疫球蛋白基因的 “全人”抗体的重链和轻链。
对于本领域技术人员而言，本发明的抗人NGF抗体Fab’片段可以 基于本申请说明书中公开的其重链可变区和轻链可变区的序列信息， 使用本领域中公知的方法容易地制作。优选的是，本发明的抗人NGF 抗体Fab’片段可以通过将其重链可变区和轻链可变区分别与人抗体的 重链恒定区的一部分（包括CH1结构域、和包含铰链区半胱氨酸的铰 链区的一部分）和轻链恒定区连接而制作成全人抗体Fab’片段。具体 而言，制作具有编码本发明的Fab’片段的重链可变区氨基酸(序列号6) 的碱基序列的重链可变区基因片段、和具有编码本发明的Fab’片段的 轻链可变区氨基酸(序列号4)的碱基序列的轻链可变区基因片段。然后， 使该重链和轻链的可变区基因与人抗体的适当类的重链恒定区部分和 轻链恒定区的各基因连接而制作全人抗体Fab’片段的基因。接着，将 该基因连接到适当的表达载体中，并导入培养细胞中。最后，对该培 养细胞进行培养，从而可以从培养上清中得到单克隆Fab’片段。
编码本发明的Fab’片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸的基 因片段，例如可以基于依据该重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列 而设计的碱基序列，利用本领域中公知的基因合成方法来合成。作为 这样的基因合成方法，可以使用WO90/07861中记载的抗体基因的合成 方法等本领域技术人员公知的各种方法。
接着，使上述的可变区基因片段与人抗体的恒定区基因连接而制 作全人抗体Fab’片段基因。人抗体的恒定区可以选择任何亚类的恒定 区(例如，作为重链的γ1、γ2、γ3或γ4的恒定区，作为轻链的λ或κ 链的恒定区)，但作为重链恒定区，可以优选使用人Igγ1，作为轻链恒 定区，可以优选使用人Igκ。
在制作该全人抗体Fab’片段基因之后，可以使用本领域中公知的 各种方法进行该基因向表达载体中的导入、表达载体向培养细胞中的 导入、培养细胞的培养、Fab’片段的纯化等。
作为与以上述方式得到的抗体基因连接的表达载体，可以列举例 如GS载体pEE6.4、pEE12.4(Lonza Biologics公司)，只要能够表达抗 体基因则没有特别限制。另外，也可以使用AG-γ1、AG-κ(例如，参考 WO94/20632)等预先具有人Ig恒定区基因的表达载体。
上述表达载体通过例如磷酸钙法、电穿孔法等导入培养细胞中。
作为导入表达载体的培养细胞，可以使用例如CHO-K1SV细胞、 CHO-DG44细胞、293细胞等培养细胞，利用常规方法对其进行培养即 可。
上述培养后，可以通过各种柱层析对培养上清中蓄积的Fab’片段 进行纯化，例如可以使用利用KappaSelect等的柱层析。
本发明的Fab’片段可以使用前述的重组表达法来制作，但也可以 先制作全长抗体，然后用胃蛋白酶进行消化，将所得到的F（ab’）2片 段用2-巯基乙醇等还原剂进行处理，从而制作Fab’片段。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段可以优选通过下述方法容易地获 得：使用本领域中公知的方法，合成包含编码序列号6所示的重链可 变区氨基酸序列的碱基序列的DNA、和包含编码序列号4所示的轻链 可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA，将它们与适当类的人抗体恒定 区基因连接，对于重链而言优选人Igγ1恒定区基因、对于轻链而言优 选人Igκ恒定区基因，构建全人抗体Fab’片段基因，使用本领域中公知 的各种方法，将该基因导入表达载体，将该表达载体导入培养细胞并 对该培养细胞进行培养，从得到的培养物中纯化Fab’片段。包含编码 序列号6所示的重链可变区氨基酸序列的碱基序列的DNA优选包含序 列号5所示的碱基序列。包含编码序列号4所示的轻链可变区氨基酸 序列的碱基序列的DNA优选包含序列号3所示的碱基序列。
本说明书中，“Fab’片段”为由轻链和包含重链可变区（VH）、 CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的1价抗体片段，该铰链 区的部分包含构成重链-轻链间的S-S键的半胱氨酸残基以外的至少1 个半胱氨酸残基（本说明书中也称为“铰链区半胱氨酸”）。铰链区 半胱氨酸可以作为后述的聚乙二醇的修饰位点使用。Fab’片段中铰链区 半胱氨酸的数目可以根据所使用的抗体的类而在1个～数个之间变动， 本领域技术人员可以容易地进行调整。例如，在制作人的IgG1类（通 常在铰链区中具有2个铰链区半胱氨酸）的Fab’片段时，在重链的铰 链区中，在最初的铰链区半胱氨酸的编码部位与第2个铰链区半胱氨 酸的编码部位之间插入终止密码子，由此可以制作在铰链区中具有1 个铰链区半胱氨酸的Fab’片段，在第2个铰链区半胱氨酸的编码部位 之后插入终止密码子，由此可以制作在铰链区中具有2个铰链区半胱 氨酸的Fab’片段。
包含由序列号6所示的氨基酸序列构成的重链可变区和人Igγ1恒 定区的部分的本发明的优选的抗人NGF抗体Fab’片段的重链片段，为 由序列号10、序列号14、或序列号16所示的氨基酸序列构成的重链 片段。包含编码由序列号10、序列号14、或序列号16所示的氨基酸 序列构成的抗人NGF抗体Fab’片段的重链片段的碱基序列的DNA，优 选包含序列号9、序列号13、或序列号15所示的碱基序列。包含由序 列号4所示的氨基酸序列构成的轻链可变区和人Igκ恒定区的本发明的 优选的抗人NGF抗体Fab’片段的轻链，为由序列号12所示的氨基酸 序列构成的轻链。包含编码由序列号12所示的氨基酸序列构成的抗人 NGF抗体Fab’片段的轻链的碱基序列的DNA，优选包含序列号11所 示的碱基序列。
作为包含由序列号10所示的氨基酸序列构成的重链片段、和由序 列号12所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的优选的抗人NGF抗 体Fab’片段，可列举出后述实施例中记载的全人1-15（N52D）抗体Fab’ 片段。作为包含由序列号14所示的氨基酸序列构成的重链片段、和由 序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的优选的抗人NGF 抗体Fab’片段，可列举出后述实施例中记载的全人1-15（N52D-A）抗 体Fab’片段。作为包含由序列号16所示的氨基酸序列构成的重链片段、 和由序列号12所示的氨基酸序列构成的轻链的本发明的优选的抗人 NGF抗体Fab’片段，可列举出后述实施例中记载的全人1-15（N52D-P） 抗体Fab’片段。
本发明也包括如下的抗人NGF抗体Fab’片段，所述抗人NGF抗 体Fab’片段包括：包含由序列号6的第31～35位氨基酸序列构成的 CDR1、由序列号6的第50～65位氨基酸序列构成的CDR2、和由序列 号6的第98～110位氨基酸序列构成的CDR3的重链可变区、以及包含 由序列号4的第24～39位氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的第 55～61位氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的第94～102位氨基 酸序列构成的CDR3的轻链可变区。另外，本领域技术人员也可以按 照前述的顺序容易地制作出这种Fab’片段。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段也可以通过其铰链区半胱氨酸键 合聚乙二醇（PEG）来进行修饰。PEG与Fab’片段的键合能够使用本 领域公知的方法来实施（例如欧州专利EP0948544）。在本发明中能够 使用直链或支链的任意平均分子量的PEG或其衍生物，本领域技术人 员可以根据使用目的容易地选择。例如在肿瘤组织、炎症反应中，与 正常组织相比血管透过性显著亢进，到达的物质具有漏出到血管外并 蓄积于肿瘤、炎症组织的倾向（EPR效果）。另外已知，分子量小的 物质易被血管再吸收，而分子量大的物质难以被再吸收。因此，为了 改善Fab’片段在病灶组织中的滞留性，可以与高平均分子量（例如约 40000Da）的PEG进行键合，在期望迅速排泄到体外的情况下，可以 与低平均分子量（例如、约10000Da）的PEG进行键合。另外，为了 使PEG与铰链区半胱氨酸的键合变得容易，可以使用PEG的衍生物。 例如可以如后述的实施例所述地使用键合有马来酰亚胺等硫醇反应基 团的PEG衍生物，使铰链区半胱氨酸的硫醇基与马来酰亚胺基进行共 价键合。一般而言，PEG的平均分子量为约500Da～约50000Da，优选 为约5000Da～约40000Da，更优选为约10000Da～约40000Da的范围。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段与人NGF结合。作为测定所得 到的抗人NGF抗体Fab’片段对人NGF的结合活性的方法，有ELISA、 FACS等方法。例如在使用ELISA的情况下，将人βNGF固定于ELISA 板，对其添加Fab’片段并进行反应后，使用辣根过氧化物酶（HRP） 等酶标记后的抗kappa抗体等第二抗体进行反应，洗涤后，通过使用检 测其活性的试剂（例如在HRP标记的情况下为TMB显色试剂）等的 活性测定，鉴定第二抗体的结合。另外，本发明的抗人NGF抗体Fab’ 片段也包括除与人NGF结合以外还与来源于其他动物的NGF（例如小 鼠NGF）结合的Fab’片段，也可以测定对这些蛋白质的结合活性。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段具有对人NGF的中和活性。在 本说明书中使用的情况下，抗人NGF抗体Fab’片段的“中和活性”是 指通过与NGF的结合来抑制经由NGF带来的任意生物活性的活性， 可以将NGF的一种或多种生物活性作为指标来进行评价。作为这样的 中和活性，可列举出例如NGF与作为其受体的trkA的结合抑制活性、 NGF-trkA信号介导细胞内钙内流抑制活性、NGF依赖性的细胞生存信 号抑制活性，可以通过使用后述实施例中记载的方法来进行评价。
为了更详细地评价本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的效果，可以 使用体内试验。例如，可以如后述实施例所述使用应用小鼠关节炎模 型的镇痛效果试验等来评价Fab’片段的体内药效，另外，也可以使用 病灶迁移性试验来评价其病灶组织滞留效果。
另外，也可以对本发明的抗人NGF抗体Fab’片段进行副作用风险 评价。例如，可以如后述实施例所述通过使用妊娠中的动物中的Fab’ 片段给药后的胎盘通过试验，对本发明的抗人NGF抗体Fab’片段对胎 儿造成影响的可能性进行评价。另外，可以如后述实施例所述使用与 NGF的免疫复合物（IC）形成试验来测定在本发明的抗人NGF抗体 Fab’片段与NGF之间形成的IC的尺寸，对诱发血栓形成的可能性进行 评价。
另外，作为评价本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的各种稳定性（例 如热稳定性、长期保存稳定性、高浓度稳定性）的方法，可以列举例 如利用差示扫描量热测定或保存中的聚集体形成的测定的方法。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段可以根据需要纯化后，利用常规 方法制剂化，并应用于与退行性关节病相伴的关节痛（OA疼痛）、与 风湿病相伴的关节痛、癌性疼痛、神经因性疼痛、慢性腰痛、术后疼 痛、带状疱疹后神经痛、有痛性糖尿病性神经障碍、骨折痛、膀胱痛 候群症等疼痛、间质性膀胱炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、子宮内膜 症等NGF参与发病的疾病的治疗。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段可以优选作为疼痛治疗剂、更优 选作为与退行性关节病相伴的关节痛治疗剂使用。作为这些治疗剂等 的剂型的例子，可以制成注射剂、点滴用剂等非口服剂，优选通过静 脉内给药、皮下给药等来给药。另外，制剂化时，可以在药学上容许 的范围内使用与这些剂型相应的载体、添加剂。
在上述制剂化时，本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的添加量根据 患者症状的程度、年龄、所使用的制剂的剂型、或抗体的结合效价等 而不同，但使用例如0.001mg/kg至100mg/kg左右即可。
本发明还提供包含编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的序列的 多核苷酸和包含该多核苷酸的表达载体。本发明还提供包含编码本发 明的抗人NGF抗体Fab’片段的重链可变区的序列的多核苷酸、和包含 编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的轻链可变区的序列的多核苷 酸、以及包含它们中的任意一者或两者的表达载体。本发明的表达载 体只要是可以在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中表达编码本 发明的Fab’片段或其重链可变区和/或轻链可变区的基因、并产生这些 多肽的载体，则没有特别限制。可列举出例如质粒载体、病毒载体（例 如腺病毒、逆转录病毒）等。本发明的表达载体优选包含含有编码前 述本发明的Fab’片段的重链片段或轻链的序列的多核苷酸，或者包含 含有编码本发明的Fab’片段的重链片段的序列的多核苷酸、和含有编 码本发明的Fab’片段的轻链的序列的多核苷酸。
本发明的表达载体可以含有编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段 的基因、或者编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的重链可变区和/ 或轻链可变区的基因、以及可与该基因功能性连接的启动子。作为用 于在细菌中表达编码本发明的Fab’片段或编码其重链可变区和/或轻链 可变区的基因的启动子，在宿主为埃希氏菌属细菌的情况下，可以列 举例如Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动 子、tac启动子等。作为酵母中的表达用启动子，可以列举例如PH05 启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子，作为芽孢杆菌属细 菌中的表达用启动子，可以列举SL01启动子、SP02启动子、penP启 动子等。另外，在宿主为哺乳动物细胞等真核细胞的情况下，可以列 举SV40来源的启动子、逆转录病毒的启动子、热激启动子等。
使用细菌、特别是大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，本发明的表 达载体可以进一步含有起始密码子、终止密码子、终止子区和可复制 单元。另一方面，使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主的情况下， 本发明的表达载体可以含有起始密码子、终止密码子。另外，这种情 况下，可以含有增强子序列、编码本发明的Fab’片段或其重链可变区 或轻链可变区的基因的5’侧和3’侧的非翻译区、分泌信号序列、剪接 位点、多聚腺苷酸化位点或可复制单元等。另外，可以根据目的含有 通常使用的选择标记(例如，四环素耐性基因、氨苄青霉素耐性基因、 卡那霉素耐性基因、新霉素耐性基因、二氢叶酸还原酶基因)。
本发明还提供导入有编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的基因 或编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的重链可变区和/或轻链可变 区的基因的转化体。这样的转化体例如可以通过用本发明的表达载体 转化宿主细胞来制作。作为转化体的制作中使用的宿主细胞，只要是 适合前述的表达载体且能够进行转化的宿主细胞则没有特别限定，可 以例示本发明的技术领域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等 各种细胞(例如，细菌(埃希氏菌属细菌、芽孢杆菌属细菌)、酵母(酵母 菌属、毕赤酵母菌属等)、动物细胞或昆虫细胞(例如，Sf9)等)。转化可 以通过本身公知的方法进行。
优选的是，本发明的转化体为使用含有包含编码本发明的Fab’片 段的重链可变区的序列的多核苷酸和包含编码本发明的Fab’片段的轻 链可变区的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞，或者为使 用含有包含编码本发明的Fab’片段的重链可变区的序列的多核苷酸的 表达载体和含有包含编码本发明的Fab’片段的轻链可变区的序列的多 核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞。更优选的是，本发明的转化体 为使用含有包含编码前述本发明的Fab’片段的重链片段的序列的多核 苷酸和包含编码该Fab’片段的轻链的序列的多核苷酸的表达载体转化 后的宿主细胞，或者为使用含有包含编码前述本发明的Fab’片段的重 链片段的序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该Fab’片段的轻 链的序列的多核苷酸的表达载体转化后的宿主细胞。
本发明还提供本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的生产方法，包括 使编码本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的基因或编码本发明的抗人 NGF抗体Fab’片段的重链可变区和/或轻链可变区的基因在宿主细胞中 表达的步骤、即包括使用上述转化体的步骤。优选的是，该方法中使 用的宿主细胞为使用前述本发明的表达载体转化后的宿主细胞，可以 分别含有或者同时含有包含编码本发明的Fab’片段的重链可变区的序 列的多核苷酸和包含编码该Fab’片段的轻链可变区的序列的多核苷 酸。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段的生产中，转化体可以在营养培 养基中培养。营养培养基优选含有转化体的生长所需的碳源、无机氮 源或有机氮源。作为碳源，可以例示例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀 粉、蔗糖等，作为无机氮源或有机氮源，可以例示例如铵盐类、硝酸 盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粕、马铃薯提 取液等。另外，也可以根据需要含有其他营养素(例如，无机盐(例如， 氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(例如，四环素、新 霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
转化体的培养通过本身公知的方法进行。培养条例如温度、培养 基的pH和培养时间可适当选择。例如，在宿主为动物细胞的情况下， 作为培养基，可以使用含有约5～20%的胎牛血清的MEM培养基 (Science,Vol.122,p.501,1952)、DMEM培养基(Virology,Vol.8,p.396, 1959)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.,Vol.199,p.519,1967)、199 培养基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.,Vol.73,p.1,1950)等。培养基的pH优 选为约6～8，培养通常在约30～40℃下进行约15～72小时，也可以根据 需要进行通气、搅拌。在宿主为昆虫细胞的情况下，可以列举例如含 有胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.8404, 1985)等，其pH优选为约5～8。培养通常在约20～40℃下进行15～100 小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。在宿主为细菌、放线菌、酵 母、丝状真菌的情况下，例如含有上述营养源的液体培养基是适当的。 优选pH为5～8的培养基。在宿主为大肠杆菌的情况下，作为优选的培 养基，可以例示LB培养基、M9培养基(Miller等、Exp.Mol.Genet,冷 泉港实验室,p.431,1972)等。该情况下，培养通常可以在14～43℃下进 行约3～24小时，根据需要同时可进行通气、搅拌。在宿主为芽孢杆菌 属细菌的情况下，通常可在30～40℃下进行约16～96小时，根据需要可 同时进行通气、搅拌。在宿主为酵母的情况下，作为培养基，可以列 举例如Burkholder基本培养基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.77,p.4505,1980)，pH优选为5～8。培养通常在约20～35℃下进行约 14～144小时，也可以根据需要进行通气、搅拌。
本发明的抗人NGF抗体Fab’片段可以通过对如上所述的转化体进 行培养而从该转化体中回收，优选进行分离、纯化。作为分离、纯化 方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法、透析、 超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量 差异的方法、离子交换层析、羟基磷灰石层析等利用带电的方法、亲 和层析等利用特异的亲和性的方法、反相高效液相色谱等利用疏水性 差异的方法、等电聚焦等利用等电点差异的方法等。
以上对本发明进行了全面记载，在此提供用于深化理解而参照的 特定实施例，但这些实施例的目的在于例示，并不限定本发明。
实施例
关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别说明，则 依照随附的操作规程进行实验。
（实施例1：对VelocImmune小鼠的免疫）
通过对VelocImmune小鼠进行免疫来获得对人NGF的抗体。为了 提高所得到的抗体的多样性，本发明人对多个免疫方法、给药途径、 佐剂、免疫时间等进行了研究。使用人βNGF（R&DSystem公司）作 为免疫原，对溶解人βNGF并与佐剂混和后用于免疫的方法、和将人 βNGF热变性（在0.5%SDS溶液下、80℃、处理10分钟）后与佐剂混 和进行免疫的方法进行了研究。作为给药途径，研究了足底给药和腹 腔内给药。作为佐剂，研究了TiterMax Gold(CytRx公司）、完全弗氏 佐剂（Sigma公司）、弗氏不完全佐剂（Sigma公司）、和RIBI佐剂 （Corixa公司）。另外，作为进一步添加的免疫激活剂，研究了CpG 寡聚核苷酸和磷酸铝凝胶（BRENNTAG公司）。作为免疫时间，以3 周至14周进行了研究。数次免疫后，从小鼠尾静脉进行采血，监测效 价，由此选择出产生与人NGF结合的抗体的VelocImmune小鼠。
使用以下的标准的ELISA方法来进行效价测定。在Maxisorp384 板(Nunc公司)的每1个孔中添加10ng的人βNGF，在4℃下孵育过夜 从而固相化。第二天，用洗涤液（TBST：含有0.05%Tween-20的tris 缓冲液（TBS））将板洗涤1次后，添加封闭剂（含有20%Blocking One(Nacalai Tesque公司)的TBST），并在室温下静置1小时。用TBST 洗涤液洗涤1次后，制作采集的血液的稀释系列并进行添加。在室温 下孵育1小时后，用TBST洗涤液洗涤3次，添加用含有5%Blocking One的TBST洗涤液稀释至2000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠 Ig抗体(HRP-goatanti-mouseIgantibody；Zymed公司）。在室温下孵育 1小时后，用TBST洗涤液洗涤3次。加入TMB显色试剂（Sumitomo Bakelite公司）并在室温下静置10分钟后，加入终止液（2mol/L硫酸） 终止反应，并测定450nm的吸光度。
（实施例2：产生抗人NGF抗体的杂交瘤的制作）
对确认到抗体价的上升后选择出的小鼠进行最终免疫（抗原的静 脉内给药或腹腔内给药）。依照常规方法摘除免疫后的小鼠的脾脏、 淋巴结等来收集淋巴细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融 合，由此制作杂交瘤。对杂交瘤进行有限稀释，进行单克隆化，并在 此基础上使用蛋白A或蛋白G柱（GE HEALTHCARE公司）从上清 中纯化抗体。
（实施例3：NGF-trkA结合抑制评价）
使人βNGF（R&D System公司）与EZ-LINK5-（生物素酰胺） 戊胺(PIERCE公司)在室温、暗处反应30分钟，进行生物素标记，用脱 盐柱除去过量的生物素，获得生物素标记人βNGF。需要说明的是，在 以下的实施例6和实施例7中确认了：所制成的生物素标记人βNGF 的生物活性与原人βNGF同等。
使用以下的方法测定抑制活性。在白色Maxisorp384板（Nunc公 司）的每1个孔中添加60ng的人trkA（R&D Systems公司），在4℃ 下孵育过夜从而固相化。第二天，用TBST洗涤液将板洗涤1次后，添 加封闭剂（含有20%Blocking One(Nacalai Tesque公司)的TBST），并 在室温下静置1小时。接着，将上述中制作的生物素标记人βNGF （0.2μg/ml）和实施例2中得到的抗体混和后，将所得物添加于封闭后 的trkA固相板。在室温下孵育1小时后，用TBST洗涤液洗涤3次， 添加碱性磷酸酶标记链霉亲和素（PIERCE公司）。在室温下孵育1小 时后，用TBST洗涤液洗涤3次，加入作为化学发光检测试剂的APU4 （BioFX公司），用EnVision计数器（PerkinElmer公司）测定其化学 发光量。
（实施例4：种属交叉反应性评价）
在抗体对小鼠βNGF具有交叉反应性的情况下，能够使用该抗体 进行小鼠病态模型下的药效评价。因此，在实施例3的方法中，使用 小鼠βNGF（R&D Systems公司）来制作生物素标记小鼠βNGF，由此 针对抗体对小鼠βNGF的交叉反应性进行评价。
（实施例5：结合特异性评价）
使用实施例1所述的ELISA法对抗体与NGF的结合特异性进行 评价。具体而言，使用同源性与NGF最高的家族分子即NT-3，在实施 例1的方法中将人NT-3（PeproTech公司）在每1个孔中添加20ng并 在板上进行固相化后，进行评价。
（实施例6：NGF-trkA信号抑制评价）
对抗体的NGF-trkA信号的抑制活性进行评价。NGF通过作为其 受体的trkA引起细胞内钙（Ca2+）浓度的上升。通常，在钙指示试剂 存在下使用细胞内Ca2+浓度测定系统（FLIPR；Molecular Devices公 司），则可以对该Ca2+浓度变化进行评价。
使用以下的方法对抑制活性进行测定。在实验前一天将稳定表达 人trkA的HEK293细胞（WO2009/054468）以达到2×104细胞/孔的方 式分注于96孔聚-D-赖氨酸-涂布板（日本Becton Dickinson公司）， 培养过夜。第二天，将培养基置换为含有钙指示试剂（Fluo4-AM；同 仁堂公司）的DMEM培养基（含有3.6mM氢氧化钠（NaOH）、2.5mM 丙磺舒（Sigma公司）），在37℃下静置30分钟。接着，用洗涤液（Hanks’ Balanced盐溶液（HBSS）（20mM2-[4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪基]乙磺 酸（HEPES）、3.6mM氢氧化钠、2.5mM丙磺舒（Sigma公司）、0.1% 牛血清白蛋白）将细胞洗涤2次，以150μl/孔将培养基置换为该洗涤液。 将细胞板设置于FLIPR内。通过FLIPR的操作，以50μl/孔的方式添加 实施例2中得到的抗体与NGF的混和液（NGF最终浓度100ng/ml）， 测定细胞内Ca2+浓度变化。计算出细胞内Ca2+浓度变化的最大值与最 小值的差，并将其作为测定数据进行保存。
（实施例7：NGF依赖性细胞生存信号抑制评价）
在以无血清条件培养天然表达trkA和p75受体的PC12细胞的情 况下，NGF可以将细胞的生存维持数天。使用以下的方法，评价抗体 对NGF依赖的细胞生存信号的抑制活性。
以每1个孔1×104细胞的方式将PC12细胞接种于96孔的胶原蛋 白涂布板（ASAHI TECHNO公司），用含有2.5%胎牛血清和15%灭活 马血清（Invitrogen公司）的F12K培养基（Invitrogen公司）在37℃、 5%CO2的条件孵育过夜。第二天，将培养基置换为仅为F12K的无血 清条件。1小时后，添加抗体和人βNGF（最终浓度50ng/ml），培养 72小时。然后，用抽吸装置除去培养液，通过细胞的内源性ATP定量 试剂（CellTiter Glo；Promega公司）测定细胞的生存能力。
（实施例8：Fab片段的制作）
使用Fab制备试剂盒（Pierce公司），在抗体1mg/ml中加入消化 酶木瓜蛋白酶结合凝胶，在37℃处理3小时。将处理后的反应液添加 于蛋白G柱（GE HEALTHCARE公司），通过使被切断的Fc和未反 应的IgG吸附于柱上而除去，回收洗脱组分，由此得到Fab片段。对 于所得到的Fab片段，以实施例3、实施例6、和实施例7中记载的试 验进行评价。
从实施例3～8的评价结果可以确认，命名为1-15的抗体（嵌合抗 体）具有高的中和活性、种属交叉反应性、结合特异性，并且即使在 成为1价的抗体片段的情况下也可保持高的中和活性。
（实施例9：抗体基因序列的确定）
对于鉴定后的1-15抗体，本发明人从杂交瘤克隆了编码抗体的重 链和轻链的基因。具体而言，准备1×105以上的杂交瘤克隆，将其用 RNeasy Mini Kit（QIAGEN公司）中附上的RLT缓冲液悬浮后，使用 QIAshredder(QIAGEN公司）进行细胞破碎。然后，按照实验方案提取 RNA，将提取出的RNA作为模板，使用DNA扩增试剂盒（SMARTer RACE cDNA Amplification kit；Clontech公司）进行cDNA的合成。使 用所得到的cDNA进行PCR反应，将重链和轻链的可变区进行延伸和 扩增。通过直接测序仪（ABI PRISM3100；Applied Biosystems公司） 对该PCR产物进行序列分析。然后，将PCR产物与pCR3.1-TOPO （Invitrogen公司）等PCR产物亚克隆用载体重组后分析基因序列，进 行序列确定。
将确定后的1-15抗体的重链可变区的碱基序列用序列号1表示， 将氨基酸序列用序列号2表示，将该抗体的轻链可变区的碱基序列用 序列号3表示，将氨基酸序列用序列号4表示。1-15抗体的重链可变 区的CDR1、CDR2、和CDR3分别为基于Kabat编号的重链可变区的 第31～35位、第50～65位和第95～102位区域，分别由序列号2的第31～35 位、第50～65位和第98～110位的氨基酸序列构成。1-15抗体的轻链可 变区的CDR1、CDR2、和CDR3分别为基于Kabat编号的轻链可变区 的第24～34位、第50～56位和第89～97位区域，分别由序列号4的第 24～39位、第55～61位和第94～102位的氨基酸序列构成。
（实施例10：可变区的糖链修饰位点的突变体制作）
前述的1-15抗体的重链可变区氨基酸（序列号2）中包含N-X- （T/S）的N型糖链修饰基序序列。具体而言，序列号2所示的重链可 变区中的基于Kabat编号的第52位Asn（N52）相当于糖链修饰位点。 存在糖链修饰位点时，在细胞培养过程中会发生糖链向抗体的添加， 已知糖链的添加依赖于培养条件、表达其的宿主。即，即使是建立的 相同的抗体产生细胞，糖链添加的程度也有可能由于培养条件（培养 基、细胞密度等）而改变，从而有可能难以获得品质均匀的抗体药品。 因此本发明人制作了在1-15抗体的重链可变区中的N52中引入了突变 的1-15（N52D）。
将制成的1-15（N52D）的重链可变区的碱基序列用序列号5表示， 将氨基酸序列用序列号6表示。1-15（N52D）抗体的重链可变区的 CDR1、CDR2、和CDR3分别为基于Kabat编号的重链可变区的第31～35 位、第50～65位和第95～102位区域，由序列号6的第31～35位、第50～65 位、和第98～110位的氨基酸序列构成。
（实施例11：全人抗体Fab’片段的制作）
使用前述的1-15和1-15（N52D）的重链可变区和1-15的轻链可 变区制作各全人抗体Fab’片段。
在1-15和1-15（N52D）的各重链可变区基因的5’侧连接信号序 列，然后在3’侧连接人Igγ1的恒定区基因(Man Sung Co等,(1992)J Immunol.Vol.148(4):1149-1154)，将该重链片段基因插入GS载体pEE6.4 （Lonza Biologics公司）中。在此，为了以Fab’片段的形式进行表达， 在重链恒定区基因中在基于EU索引的第226位Cys（对应于后述的序 列号8和10的氨基酸序列中的230位Cys）的密码子后插入终止密码 子。另外，在1-15的轻链可变区基因的5’侧连接信号序列，然后在3’ 侧连接人κ链的恒定区基因（ManSungCo等，如上），将该轻链基因 插入GS载体pEE12.4（Lonza Biologics公司）中。
利用瞬时表达和稳定表达这2种方法进行Fab’片段的表达。在瞬 时表达中，对于用FreeStyle293表达培养基（Invitrogen公司）培养至 约100万个/mL的FreeStyle293细胞（Invitrogen公司），使用293フ ェクチン（Invitrogen公司）对前述的重链片段和轻链的GS载体进行 转染，培养7天。在稳定表达中，将前述的两GS载体用NotI和PvuI 进行限制性内切酶切割，使用DNA连接试剂盒（宝生物公司）进行连 接，构建插入有重链片段和轻链两基因的GS载体。该表达载体编码重 链片段和轻链以及谷氨酰氨合成酶（Glutamine synthetase），通过对 CHO-K1SV细胞的转染使其进行表达。用各方法进行表达后，使用 KappaSelect（GE HEALTHCARE公司）来纯化培养上清，得到各Fab’ 片段。
将制成的全人1-15抗体Fab’片段（也称为1-15-Fab’）的重链片段 的碱基序列用序列号7表示，将氨基酸序列用序列号8表示。
将制成的全人1-15（N52D）抗体Fab’片段（也称为1-15（N52D） -Fab’）的重链片段的碱基序列用序列号9表示，将氨基酸序列用序列 号10表示。
各Fab’片段的轻链相同，其碱基序列由序列号11表示，氨基酸序 列由序列号12表示。
（实施例12：全人抗体Fab’片段的中和活性和表达量评价）
对于实施例11中获得的1-15-Fab’和1-15（N52D）-Fab’，以实施 例3和实施例6中记载的试验进行评价。在实施例3的试验中，1-15-Fab’ 和1-15（N52D）-Fab’的IC50分别为0.17μg/ml和0.18μg/ml。在实施 例6的试验中，1-15-Fab’和1-15（N52D）-Fab’的IC50分别为0.021μg/ml 和0.018μg/ml。从这些结果可以确认，1-15（N52D）-Fab’保持了与改 变前的1-15-Fab’同程度的中和活性，即使引入突变也不会对中和活性 造成影响。
另外，进行各Fab’片段的稳定表达，并对稳定表达细胞池培养的 上清中的抗体产生量进行测定。结果，1-15-Fab’和1-15（N52D）-Fab’ 的各培养上清中的浓度分别为86mg/L和106mg/L，显示出1-15（N52D） -Fab’是以比改变前的1-15-Fab’更高的量进行产生的抗体。
（实施例13：PEG化Fab’片段的制作与中和活性评价）
接着，本发明人对前述的1-15（N52D）-Fab’进行了PEG的引入。 用KappaSelect纯化后，将Fab’片段用TCEP盐酸盐 （Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐）进行 还原反应，由此得到能够PEG化的结构体。
具体而言，在用20mM磷酸钠缓冲液（pH6.8）调整为1.2mg/ml 的Fab’片段溶液中以达到1mM的方式添加TCEP，在37℃下反应2 小时，然后用20mM乙酸钠缓冲液（pH5.0）进行稀释，调整pH。使 所得物吸附于阳离子交换树脂（SP-5PW；东曹制），用NaCl梯度进 行洗脱，回收主峰。用20mM磷酸钠缓冲液（pH6.8）将所得到的Fab’ 片段稀释至1mg/ml，将pH调整为6.8后，在4℃下静置过夜以上的时 间，使其自然氧化。向其中添加40kDa PEG（SUNBRIGHTGL2-400MA； NOF公司)使得终浓度为0.1mM，在室温下静置2小时后，在4℃下静 置过夜。该PEG的末端具有马来酰亚胺基，因此与重链片段的羧基末 端的Cys（基于EU索引的C226；序列号10的第230位的Cys）迅速 反应。将所得物用20mM乙酸钠缓冲液（pH4.5）稀释，调整pH后， 再次使其吸附于阳离子交换树脂（SP-5PW；东曹制），用NaCl的梯 度进行洗脱，回收主峰。由此操作来纯化PEG化后的Fab’片段。也将 该PEG化后的1-15（N52D）-Fab’称为1-15（N52D）-Fab’-PEG。
对于PEG化前和PEG化后的1-15（N52D）-Fab’，用实施例3所 示的方法评价中和活性。结果，1-15（N52D）-Fab’的IC50为0.15μg/ml， 与此相对，1-15（N52D）-Fab’-PEG的IC50为0.12μg/ml（以Fab’片段 浓度计），可以确认1-15（N52D）-Fab’即使添加PEG，其中和活性也 不会受到影响。
另外，使用实施例6的方法，对1-15（N52D）-Fab’-PEG与现有 抗人NGF抗体Tanezumab的对人和小鼠NGF的中和活性进行比较。 结果，1-15（N52D）-Fab’-PEG的IC50对人NGF为0.051μg/ml、对小 鼠NGF为0.069μg/ml，与此相对，Tanezumab的IC50对人NGF为 0.17μg/ml、对小鼠NGF为0.23μg/ml，可以确认，1-15（N52D）-Fab’-PEG 对人和小鼠中任意一者的NGF都具有Tanezumab的3.3倍左右强的中 和活性。
（实施例14：利用小鼠佐剂诱导关节炎模型的镇痛效果试验）
本发明人对前述的1-15（N52D）-Fab’-PEG评价了对小鼠佐剂诱 导关节炎模型的镇痛效果。
在小鼠静脉内给药1-15（N52D）-Fab’-PEG（0.03mg/kg、0.1mg/kg、 0.3mg/kg、给药容量为10mL/kg），在后肢足底给药25μL弗氏完全佐 剂（Sigma公司）1mg/mL，引起疼痛。在引起24小时内测定20分钟 的站立行动。具体而言，使用SuperMex自发运动量测定系统（室町机 械），用红外线束传感器自动计量20分钟小鼠自发站立行动的次数 （Matson等、JPET320：194-201，2007）。作为比较对照，使用现有 抗体Tanezumab。结果，Tanezumab的静脉内给药的镇痛效果为ED50 ＝0.27mg/kg，与此相对，1-15（N52D）-Fab’-PEG为ED50＝0.11mg/kg， 发挥了镇痛效果，显示出约3倍的有效性。
（实施例15：大鼠胎盘通过试验）
在雌性大鼠的妊娠第17天静脉内给药1-15（N52D）-Fab’-PEG或 Tanezumab（100mg/kg、给药容量10mL/kg），测定3天后的母体和胎 仔血液中的抗体浓度。
抗体浓度的测定以下述方式进行。在多阵列板（标准）96板（Meso Scale Discovery公司）的每孔中添加25ng人βNGF（R&D Systems公 司），在室温下静置1小时，由此进行固相化。将板用TBST洗涤液洗 涤3次后添加封闭剂（1%酪蛋白TBS；thermofisher公司），在室温下 静置1小时。接着，在封闭后的人βNGF固相板中添加将经时采集的 血液稀释后的血液样品。在室温下边搅拌边反应60分钟后，用TBST 洗涤液洗涤3次，添加生物素标记抗人kappa抗体（免疫生物研究所）。 在室温下边搅拌边反应60分钟后，用TBST洗涤液洗涤3次，添加 SULFO-TAG标记链霉亲和素（Meso Scale Discovery公司）。在室温 下边搅拌边反应60分钟后，用TBST洗涤液洗涤3次，添加Read Buffer T(Meso Scale Discovery公司），用SECTOR Imager6000(Meso Scale Discovery公司）测定电化学发光量。
在3只大鼠母体中进行本试验的结果是，3天后的大鼠母体血中 1-15（N52D）-Fab’-PEG和Tanezumab的抗体浓度分别平均12.1μg/ml 和7.1μg/ml。另一方面，关于从各大鼠母体中各取出的3例胎仔（共9 例）的胎仔血中抗体浓度，1-15（N52D）-Fab’-PEG的血中浓度在全部 例中为检测限的0.01μg/ml以下，与此相对，Tanezumab的血中浓度为 平均5.39μg/ml。即，Tanezumab的胎仔迁移率为75.9%，与此相对， 1-15（N52D）-Fab’-PEG的胎仔迁移率为检测限的0.08%以下的迁移率。 由此可知，1-15（N52D）-Fab’-PEG可回避胎儿中NGF抑制所致的副 作用风险，是安全性优良的药剂。
（实施例16：免疫复合物（IC）的形成）
对1-15（N52D）-Fab’-PEG是否形成了IC、或所形成的IC的尺 寸为何种程度进行评价。具体而言，将1-15（N52D）-Fab’-PEG与1mg/ml 的人βNGF（R&D Systems公司）以1：1的摩尔比进行混和，在室温 下孵育3小时形成IC。使用测定动态光散射的设备Zetasizer Nano(Malvern公司)测定该反应液中IC的粒径和分布。分析使用Zeta sizar v6.01(Malvern公司），粒径以用强度（%）分析后的值（d.nm） 表示。
所测定的粒径如以下的表1所示。在该实验中，NGF单独的粒径 为平均6.2nm。Tanezumab单独则在11.7nm处出现峰位尺寸。将 Tanezumab和NGF孵育而形成IC后进行测定，峰位尺寸位移至91.3nm。 另一方面，在使用不与NGF结合的抗体作为对照抗体的情况下，峰位 尺寸仍为11.7nm。从位移宽度考虑，Tanezumab与NGF分别形成结合 有多个分子的巨大分子，推测形成了巨大尺寸的IC。与此相对，对1-15 （N52D）-Fab’-PEG与NGF的IC的形成进行测定的结果是，峰位尺 寸由18.1nm位移至24.4nm。从位移宽度考虑，反映出仅有1：1结合， 显示出1-15（N52D）-Fab’-PEG中未形成晶格。
表1
（实施例17：病灶组织迁移性）
对雄性DBA/1小鼠足关节皮下给药胶原蛋白（来源于牛关节的2 型胶原蛋白、10mg/mL；胶原蛋白技术研修会）与完全弗氏佐剂 （0.5mg/mL；DIFCO公司）的1：1的乳液来制作胶原诱导关节炎模型。 引起4周后再次施用乳液，使关节炎发病。观察后肢关节炎的发病程 度（计分、肿胀的大小），并对小鼠分组。对于1-15（N52D）-Fab’-PEG 和Tanezumab的1mg/ml PBS溶液，使用SAIVITM Rapid Antibody Labeling Kit、AlexaFluor（注册商标）680（Life Technologies公司）进 行荧光标记。将它们分别从尾静脉以2mg/kg进行给药（N＝4）。使用 IVIS Spectrum(Caliper/Xenogen公司），从给药后1小时至50小时为 止分析蓄积于肿胀的足底的荧光，将荧光强度数值化。
图1示出足底的抗体滞留量的经时变化。1-15（N52D）-Fab’-PEG 与Tanezumab相比显示出明显的病灶组织滞留效果，其效果持续至48 小时。从该结果可认为1-15（N52D）-Fab’-PEG可有效地发挥镇痛效 果，可在药效强度以上以低用量期待镇痛效果，另外，可选择性聚集 于病灶部位，因此可期待成为安全性优良的药剂。
（实施例18：Fab’片段的氨基酸添加体的制作）
为了改善PEG的引入效率，本发明人制作了在1-15（N52D）-Fab’ 中在重链片段的羧基末端的Cys残基之后添加了2个丙氨酸（A）或脯 氨酸（P）的Fab’片段，并进行表达和纯化。在这些Fab’片段的制作中， 使用与实施例11同样的方法，在此，在1-15（N52D）-Fab’的重链片 段的羧基末端Cys残基的密码子之后插入2个丙氨酸或脯氨酸的密码 子，并在其后插入终止密码子。
将添加丙氨酸后的1-15（N52D）-Fab’（全人1-15（N52D-A）抗 体Fab’片段；也称为1-15（N52D-A）-Fab’）的重链片段的碱基序列用 序列号13表示，将氨基酸序列用序列号14表示。将添加脯氨酸后的 1-15（N52D）-Fab’（全人1-15（N52D-P）抗体Fab’片段；也称为1-15 （N52D-P）-Fab’）的重链片段的碱基序列用序列号15表示，将氨基 酸序列用序列号16表示。需要说明的是，各Fab’片段的轻链与1-15 （N52D）-Fab’的轻链相同，其碱基序列由序列号11表示，氨基酸序 列由序列号12表示。
（实施例19：PEG化1-15（N52D-A）-Fab’的制作以及中和活性 和药理评价）
对于1-15（N52D-A）-Fab’，使用与实施例13同样的方法结合40kDa PEG，得到PEG化的1-15（N52D-A）-Fab’（以下也称为1-15（N52D-A） -Fab’-PEG）。
对于1-15（N52D-A）-Fab’-PEG，使用实施例3所示的方法评价 中和活性。其结果是，1-15（N52D）-Fab’-PEG的IC50为 0.081±0.034μg/ml，与此相对，1-15（N52D-A）-Fab’-PEG的IC50为 0.074±0.021μg/ml。另外，此时Tanezumab的IC50为0.410±0.099μg/ml。
接着，使用实施例6所示的方法比较中和活性。其结果是，1-15 （N52D）-Fab’-PEG的IC50对于人NGF为0.061±0.011μg/ml，与此相 对，1-15（N52D-A）-Fab’-PEG的IC50为0.064±0.028μg/ml。
另外，使用实施例14所示的方法评价佐剂诱导关节炎模型中的镇 痛效果。其结果是，1-15（N52D）-Fab’-PEG以ED50＝0.14mg/kg发 挥镇痛效果，与此相对，1-15（N52D-A）-Fab’-PEG以ED50＝0.21mg/kg 发挥镇痛效果。
由以上可以确认，即使在羧基末端的Cys残基之后添加2个丙氨 酸，其中和活性和药理活性也不会受到影响。
（实施例20：1-15（N52D-A）-Fab’-PEG的结合亲和性的评价）
通过等温滴定型热量测定（Isothermal titration calorimetry；ITC） 对1-15（N52D-A）-Fab’-PEG和Tanezumab对NGF抗原的结合热力学 进行研究（Scappaticci FA,J Natl CancerInst.2007,99： 1232-9.Velazquez-Campoy,A.,etal,CurrProtoc Cell Biol.2004,Chapter17, Unit17-18.）。全部测定使用GE healthcare公司制的Auto-iTC200来进 行。实验中，为了评价1价的Fab’片段与1分子的抗原间的结合，以 以下的浓度进行试验，试验全部在PBS溶剂中进行。具体而言，将装 入滴定用注射器的人βNGF44μM（R&D systems公司）分30次每次 1.4μL地滴定于充满抗体试样（3μM的1-15（N52D-A）-Fab’-PEG或 1.5μM的Tanezumab）的热量计池，检测此时产生的热量。使用装置附 属的软件，通过Single site binding model分析所得到的数据，由此估计 伴随抗原-抗体结合的结合亲和力（Kd）、结合比（n）、结合自由能 （ΔG）、结合焓（ΔH）、和结合熵（-TΔS）。结果如表2所示。
其结果是，Tanezumab的Kd值为20.41nM，与此相对，1-15 （N52D-A）-Fab’-PEG的Kd值为1.49nM，1-15（N52D-A）-Fab’-PEG 的结合亲和性比Tanezumab强10倍以上。
表2
Kd(nM) ΔG (cal/mil) H(cal/mol) -TS(cal/mo) Tanezumab 20.41 -10490 -4759 -5731 1-15(N52D-A)Fab’-PEG 1.49 -12041 -20806 8765
（实施例21：各种PEG尺寸的PEG化1-15（N52D-A）-Fab’的制 作和中和活性评价）
对于实施例18中制作的1-15（N52D-A）-Fab’，使用与实施例13 同样的步骤结合5kDa PEG或10kDa PEG。具体而言，用TCEP使以 20mM tris盐酸缓冲液（pH7.4）制备的Fab’片段溶液还原后，使用脱 盐柱回收Fab’片段。向所得到的Fab’片段中添加PEG（SUNBRIGHT GL2-50MA或SUNBRIGHT GL2-100MA；均为NOF公司），在4℃下 静置过夜。这样得到的结合了5kDaPEG或10kDaPEG的1-15（N52D-A） -Fab’分别称为1-15（N52D-A）-Fab’-5kPEG、1-15（N52D-A） -Fab’-10kPEG。
接着，使用实施例6所示的方法对各PEG化Fab’片段的中和活性 进行比较。作为比较对照，使用实施例19中制作的1-15（N52D-A） -Fab’-PEG（结合40kDaPEG；以下也称为1-15（N52D-A）-Fab’-40kPEG）。 本次实验中以50ng/ml的NGF最终浓度进行实施。其结果是，1-15 （N52D-A）-Fab’-5kPEG、1-15（N52D-A）-Fab’-10kPEG、和1-15 （N52D-A）-Fab’-40kPEG的IC50分别为0.030μg/ml、0.028μg/ml、和 0.023μg/ml。从该结果可知，PEG尺寸在5kDa至40kDa的尺寸之间不 会对Fab’片段的中和活性造成影响。
（实施例22：各种PEG尺寸的PEG化1-15（N52D-A）-Fab’的小 鼠PK评价）
进行各种PEG化1-15（N52D-A）-Fab’的小鼠PK评价。具体而 言，在静脉内给药0.3mg/kg的各种PEG化1-15（N52D-A）-Fab’，在 给药后1、4、8、12、24、48、72、96、和168小时分别进行采血。所 得到的血液中的被测抗体量使用夹心ELISA法进行测定。具体而言， 将被测抗体添加到固定有NGF的MSD板（Meso Scale Discovery公司 制）。用生物素标记抗人Kappa抗体识别与板结合的被测抗体，并将 其用SULFO-TAG标记链霉亲和素进行检测。用血中浓度的计算通过 用各标准品制作标准曲线而求出。由计算出的血中浓度计算血中半衰 期（T1/2：小时）。其结果是，1-15（N52D-A）-Fab’-5kPEG、1-15（N52D-A） -Fab’-10kPEG、和1-15（N52D-A）-Fab’-40kPEG的T1/2分别为13.8±2.2 小时、17.7±0.4小时、和39.2±3.7小时。
（实施例23：利用大鼠脚心切开模型进行的镇痛效果试验）
使用被认为可反映出临床中的术后疼痛的大鼠脚心切开后疼痛模 型(Brennan et al.Current Protocols in Pharmacology2004;5.34.1-5.34.8) 评价1-15（N52D-A）-Fab’-5kPEG和1-15（N52D-A）-Fab’-10kPEG对 术后疼痛的镇痛效果。
具体而言，各组8只，在大鼠静脉内给药1-15（N52D-A） -Fab’-5kPEG或-10kPEG（0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、给药容量为 1mL/kg），将右后肢脚心以距离脚后跟前端5mm部分为起点向脚尖方 向直线切开10mm后，马上用尼龙线进行2处褥式缝合，由此引起疼 痛。在引起5小时、1天、2天、3天、4天、和5天时测定手术部位 附近的疼痛阈值。测定中，使用Ugo Basile公司制爪触觉测试仪 （Dynamic plantar anesthesiometer），测定表示对于对大鼠脚心加压的 逃避行动的压力。作为比较对照，使用现有抗体Tanezumab。
其结果是，术后1天的Tanezumab的静脉内给药的镇痛效果为 ED50＝0.26mg/kg，与此相对，1-15（N52D-A）-Fab’-5kPEG或-10kPEG 均为ED50＝0.15mg/kg，发挥了镇痛效果，显示出约2倍的有效性。另 外，1-15（N52D-A）-Fab’-5kPEG或-10kPEG的显著的镇痛效果可分别 在直至术后3天或4天观察到。
（实施例24：凝集稳定性评价）
在pH5、pH6、pH7.4和pH9各条件下将1-15（N52D-A） -Fab’-40kPEG溶解至1mg/ml和10mg/ml。将它们分别置于50℃的条件， 对2周后的凝集稳定性进行评价。凝集性的评价通过尺寸排阻色谱来 进行，使用Agilent公司制1100进行测定。测定条件为，使用0.1M磷 酸钠（含有0.2M精氨酸）（pH6.8）作为移动相的缓冲液，柱使用TSK gel Super Sw3000（TOSOH，2.0mm ID×300mm）。检测波长为280nm。 在1mg/ml的试验中，使用Tanezumab作为比较抗体，其结果如表3所 示。在10mg/ml的试验中，使用Tanezumab和REGN475作为比较抗体， 其结果如表4所示。
其结果是，Tanezumab和REGN475在2周后观察到显著的凝集体 产生的上升，与此相对，1-15（N52D-A）-Fab’-40kPEG中基本未观察 到凝集体。从该结果可知，PEG化1-15（N52D-A）-Fab’成为保存稳定 性优良的药品的可能性高。
表3
表4
-未试验
产业上的可利用性
本发明的抗人NGF抗体、更具体而言是抗人NGF抗体Fab’片段， 对于人NGF参与发病的各种疾病的预防或治疗有用。