技术领域
本发明涉及生物医学、基因工程和检测领域，更具体地涉及一种高专一性 的测定小RNA的方法，该方法可应用于检测非编码RNA，从而对某些疾病的情 况或状态进行描述。
背景技术
MicroRNAs(小RNA)是一类新发现的非编码RNA，它通过序列专一性地结合 到和它互补反义的mRNA的3’非编码区(3’sUTR)来调控某个或某些目标mRNA 转录及稳定性。
大多数小RNA，如let-7RNA，miR-1，miR-34，miR-60及miR-87在无脊 椎动物及脊椎动物中均是高度保守的。这说明它们能识别多个位点及(或)多个 保守功能的基因的靶序列。
通过对秀丽线虫基因组的分析，发现了另一种小RNA的亚型-小时序 RNA(stRNA，如lin-4和let-7)。stRNA在调控发育过程中起到非常重要的作 用，例如：神经元再生、Dauer幼虫的形成、外阴形成以及下皮细胞的终极分 化。
小RNA通常由60～70个核苷酸的RNA前体折叠、剪切而成。一些小RNA 一经表达即可被检测到，而一些则仅在表达峰值时才可被检测到。
可能由于小RNA前体在其结合蛋白的保护下，使其不易被降解，因此通常 只有一个发卡结构的链被剪切下，并积累起来。推测这些结合蛋白可以调节小 RNA的转录抑制作用。小RNA的前体在DicerRNAseIII及Argonaute家族的酶 的参与反应后才能形成成熟的小RNA。
小RNA在生长、分裂、分化、发育、凋亡及疾病的发生等众多生物学活动 中起着极其重要的作用。迄今为止，在人的细胞里，已发现了1200多种小 RNA(http://www.mirbase.org/)，这些小RNA参与调控了至少60％人类基因。
小RNA是肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况的重要生物学标记。 血清或血浆中的与肿瘤相关小RNA已作为肿瘤诊断的生物学标记。小RNA的检 测及定量是某些靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安全性及功效的 评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。因此，能够确定各种小RNA在特定细 胞中的数量是相当重要的。
在一些情况下，小RNA的定量测定显得尤为重要。比如，比较不同组织中 的小RNA的含量，比较外因刺激前后(物理或化学治疗)组织中小RNA的量的变 化。由于序列相似的小RNA家族在同一细胞中均会存在，因此能否有个灵敏度 高，又具备专一性好的检测方法显得尤为重要。再者，如果能有应用于高通量 筛选样品的的方法如均质法、多重法那就再好不过了。
现今，已有多种的小RNA定量分析方法面世，其中包括小RNA芯片矩阵， 基于SYBR-GreenI的小RNA定量反转录PCR法(Raymond，C.K.，Roberts，B.S.， Garrett-Engele，P.，Lim，L.P.，andJohnson，J.M.(2005)Simple， quantitativeprimer-extensionPCRassayfordirectmonitoringof microRNAsandshort-interferingRNAs.RNA11，)，基于茎状环形的Taqman 法(ChenC，RidzonDA，BroomerAJ，ZhouZ，LeeDH，NguyenJT，Barbisin M，XuNL，MahuvakarVR，AndersenMR，LaoKQ，LivakKJ，GueglerKJ.2005. Real-timequantificationofmicroRNAsbystem-loopRT-PCR.Nucleic AcidsRes33(20)：e179)，微珠法及高通量测序等。
然而，以上所及的所有方法都各有缺陷。例如，基于杂交的测定法(微矩 阵或微珠)灵敏度及专一性均不理想；基于SYBR-GreenI的方法背景高，专一 性差；使用茎状环形的Taqman法专一性虽不太差，但价格昂贵，费工费时， 且有偏差，难于应用于高通量筛选。
EvaGreen是一种双链DNA绑定染料。它对PCR反应抑制低、溶解曲线佳、 光稳定性和热稳定性高，且不诱变，无细胞毒性。EvaGreen被应用于荧光定量 PCR和溶解曲线的测定(MaoF，LeungWY，XinX.2007.Characterizationof EvaGreenandtheimplicationofitsphysicochemicalpropertiesforqPCR applicatiohs.BMCBiotechnol.9；7：76.)。
虽然BioRad，Qiagen，Agilent等公司均有基于EvaGreen的PCR反应液 销售，且许多实验室也有使用自配的基于EvaGreen的反应液的报道，但没有 报道或暗示过EvaGreen可提高反应专一性。
综上所述，目前本领域尚缺乏高灵敏度、高专一性且价格低廉的检测小 RNA的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏度、高专一性且价格低廉的检测小RNA 的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种检测小RNA的方法，所述的方法包括步骤：
(a)对于待检测的小RNA样品，在小RNA的3’端添加polyA尾；
(b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物，从而使所述引 物与添加了polyA尾的小RNA进行退火；
(c)反转录所述的添加了polyA尾的小RNA，形成cDNA；
(d)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料 的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光 染料复合物，并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数 量，从而确定待检测的小RNA的存在与否和/或数量。
在另一优选例中，所述的检测包括定性检测和定量检测。
在另一优选例中，所述的检测包括通过对荧光强度的检测来达到定量检测小 RNA。
在另一优选例中，所述的待检测的小RNA样品是从待检测样本中抽提出的 RNA。
在另一优选例中，所述的抽提出的RNA是从含有或不含小RNA的样品中抽提 出的总RNA。
在另一优选例中，在步骤(d)中，通过检测EvaGreen染料的荧光值，来确定扩 增产物的有无或数量。
在另一优选例中，所述的正向引物具有以下特征：
(i)正向引物的3’端序列为与待检测的小RNA的5’端序列相同或基本相同，并 且3’端序列与cDNA的Tm值为45-65℃；
(ii)正向引物的5’端序列使得整个正向引物与cDNA的Tm值为45-75℃；和
(iii)正向引物的长度为8-50bp。
在另一优选例中，所述的反向引物具有以下特征：
(i)反向引物的3’端具有与待检测的小RNA的3’端序列互补的、长度为0-15个 碱基的第一互补区；
(ii)反向引物的中间序列为长度为8-30个碱基的polyT；
(iii)反向引物的5’端序列使得整个反向引物与cDNA的Tm值为45-75℃；和
(iv)反向引物的长度为12-50bp。
在另一优选例中，所述的待检测样本选自下组：动物样品、食物、饲料、和 药物。
在另一优选例中，所述的待检测样本选自下组：体液、乳制品、蔬菜、肉类、 肉制品、或水。
在另一优选例中，在步骤(a)，所述的添加PolyA尾是通过在Ploy(A)聚合酶的 催化下，在小RNA的3’端聚合加上AMP，从而形成polyA尾。
在另一优选例中，polyA尾具有8-200个A，较佳地10-100个A，最佳地12-50个 A。
在另一优选例中，所述的小RNA是长度15～200个核甘酸(更佳地，长度为 18-100bp)的RNA分子。较佳地，所述的小RNA是非编码RNA。
在另一优选例中，所述的方法中的polyA尾被选自下组的其他polyN尾替换： poly(C)尾，或poly(G)尾，或poly(U)尾；并且
在步骤(b)中，加入与所述的小RNA的polyN尾部互补或基本互补的引物，从而 使所述引物与添加了polyN尾的小RNA进行退火；和
在步骤(c)中，反转录所述的添加了polyN尾的小RNA，形成cDNA。
在本发明的第二方面，提供了一种提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专 一性的方法，包括步骤：在聚合酶链反应的反应体系中，添加EvaGreen荧光染料。
在另一优选例中，在所述的反应体系中，EvaGreen荧光染料在475纳米的光密 度值在0.01到2之间。
在本发明的第三方面，提供了一种EvaGreen荧光染料的用途，它用作提高聚 合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
在本发明的第四方面，提供了一种EvaGreen荧光染料的用途，它用于制备提 高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。
在本发明的第五方面，提供了一种获取待检测样本中非编码RNA信息的方法， 包括步骤：
(a)从所述的待检测样本抽提含有所述非编码RNA的RNA样品；
(b)对于步骤(a)抽提出的RNA，在非编码RNA的3’端添加polyA尾；
(c)加入与所述的非编码RNA的polyA尾部互补的引物，从而使得所述引物与 带polyA的非编码RNA进行退火；
(d)反转录所述的含polyA尾的非编码RNA，形成cDNA；
(e)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物，在含有EvaGreen荧光染料 的PCR反应体系中，对所述cDNA进行PCR扩增，从而形成双链DNA-EvaGreen荧光 染料复合物；并且在扩增过程之中或扩增过程之后，检测扩增产物的有无和/或数 量，从而获得所述非编码RNA的信息，其中所述信息包括所述非编码RNA是否存 在于所述样品中以及存在的数量。
在另一优选例中，所述的检测采用检测EvaGreen实时荧光变化的实时荧光定 量PCR法。
在另一优选例中，所述的方法中的polyA尾被选自下组的其他polyN尾替换： poly(C)尾，或poly(G)尾，或poly(U)尾。
在另一优选例中，利用所获得的非编码RNA的信息，可用于对检测对象(其中 包括但并不限于：哺乳动物如人)的某种疾病的情况或状态进行描述。该方法尤其 适用于以下情况：
a.在某种疾病的某个阶段，某个非编码RNA的表达量增加；
b.在某种疾病的某个阶段，某个非编码RNA的表达量减小。
上述两种情况包含了多数非编码RNA在某种疾病中的表达情况。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了EvaGreen实时荧光定量法检测小RNA的流程。从上至下各步 骤依次是：加poly(A)尾；RT引物与RNA退火；反转录反应；和使用正向引物 和反向引物进行PCR扩增。
图2显示了本发明一个实例中正向引物的结构。
图3显示了本发明一个实例中反向引物的结构。
图4显示了let-7a模板浓度梯度扩增曲线。
图5显示了小RNA模板的量与Cq值呈线性关系。
图6显示了SYBRGreen荧光定量PCR法与EvaGreen荧光定量PCR法的交 叉反应专一性与灵敏度比较结果。
图7显示了含有不同的荧光染料：EvaGreen(通道一)及SYBRGreen(通道二) 对于专一性结合(实线)以及非专一性结合(虚线)的引物与模板结合的影响的 融解曲线。图中，Trace1(曲线1)是EvaGreen和引物与专一性模板结合的荧 光值对温度求导的负数；Trace3(曲线3)是SYBRGreenI和引物与专一性模 板结合的荧光值对温度求导的负数；Trace2(曲线2)是EvaGreen和引物与非专 一性模板结合的荧光值对温度求导的负数；Trace4(曲线4)是SYBRGreenI和 引物与非专一性模板结合的荧光值对温度求导的负数。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，EvaGreen作为一种DNA结 合染料居然能够显著提高PCR反应中引物与模板结合的专一性。具体地，与不 添加另一常用的DNA结合染料SYBRGreenI相比，虽然两者灵敏度上无明显 区别，但是EvaGreen可以显著提高反应的专一性，因此EvaGreen特别适用于 区分和检测结构差异极小的小分子RNA。在此基础上，本发明开发了新的高专 一性测定小RNA的方法。
本发明提供了一种具有优势的小RNA检测、分类及定量的实验方法。本发 明的检测小RNA的方法适用于检测microRNAs(小RNAs)或其他小分子核苷酸， 如siRNA。
在此发明中，提供了一种基于EvaGreen的定量PCR法(尤其是实时定量PCR 法)，它适用于定量检测小RNA。基于EvaGreen的定量PCR法可以进一步扩展 应用于mRNA及基因表达的定量检测。
术语
如本文所用，术语“EvaGreen”，“EvaGreen”或“EvaGreen染料”可 互换使用，指是Biotium公司生产的一种商品名为EvaGreen的DNA结合染料， 它是一种同时适用于实时PCR和高分辨率熔解曲线(HRM)分析的染料。这种染料 通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机 制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度以下进行高分辨率 熔解曲线(HRM)分析。由于EvaGreen染料在光谱特性上类似于FAM以及SYBR GreenI，因此这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。此外，和SYBRGreenI 以及SYBRGreenER不同的是，EvaGreen染料非常稳定且无致突变性和细胞毒 性。
染料的结构信息在例如美国专利US7,776,567中有详细描述。
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用 下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以 是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然 的核苷酸如LNA或ZNA等。
引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。 引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板 的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与 模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能 与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物， 从而进行扩增。
如本文所用，术语“Poly(A)聚合酶”，是指一类酶，这类酶可以利用ATP 作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个AMP。Poly(A)聚合酶可以 从原核或真核生物中提取。由于这类酶的专一性不强，这类酶可以分别利用 CTP，或GTP，或UTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个CMP 或GMP，或UMP。如果非编码RNA是添加了的poly(C)尾，或是poly(G)尾，或是 poly(U)尾，在此发明中，与尾部互补的引物也相应变化。Poly(U)聚合酶是和 Poly(A)聚合酶不同，但类似的酶。它可以利用UTP作为底物，在RNA的3’ 羟基末端添加多个到几百个UMP。它也可以非特异性地分别利用ATP，或CTP， 或GTP作为底物，在RNA的3’羟基末端添加多个到几百个AMP或CMP，或GMP。 因此，在本发明中，Poly(A)聚合酶和Poly(U)聚合酶有同样的功效。
如本文所用，术语“polyA尾”，是本发明第一步中在RNA的3’端添加的寡 聚到多聚A(AMP，腺苷酸)。这个“polyA尾”可用“polyC尾”，“polyG尾”， “polyU尾”替代。相应地，在下一步引入的和尾部互补，或基本互补的引物的 序列也要变化。“polyA尾”也可以通过RNA链接酶(RNALigase)加上。
现参见图1，本发明的一种优选的技术方案包括以下步骤：
(1)从含有或不含小RNA的样品中抽提总RNA。在Poly(A)聚合酶的催 化下在小RNA的3’端聚合加上AMP，使小RNA形成一个polyA尾。
(2)加入与polyA互补的引物，退火。
(3)在反转录酶的催化下，反转录小RNA使之成为cDNA。
(4)使用正、反向引物及含有EvaGreen的荧光染料的PCR反应混合母液 对cDNA进行扩增
(5)在扩增过程中，实时检测EvaGreen染料的荧光值的变化。
本发明中，优选的引物结构如图2和图3所示。
正向引物一般可以分为2部分，3’端部分的引物与模板小RNA的5’端完 全互补，退火温度一般在45～65摄氏度之间，而引物的另一部分-5’端的附 加序列(尾)将整条引物的退火温度提高到50～75摄氏度之间(图2)。
反向引物则由3部分组成：第一部分，引物的3’端0～15个碱基与小RNA 的3’端完全互补；中间部分，约10～30个碱基为10～30个dT，与小RNA加 上的Poly(A)的尾互补；第三部分为一个0～40碱基的附加序列(尾)(图3)。 应理解，当第三部分为0碱基时，反向引物可以只有2部分构成。
PCR反应的进行需要含有EvaGreen的反应母液。反应程序可以是常规的2 个温度条件的(如95摄氏度变性；60摄氏度退火及延伸)或3个反应温度的条 件(如95摄氏度变性；50摄氏度退火及72摄氏度延伸)。反应须在含有镁离子、 dNTP、及EvaGreen——双链DNA绑定染料的缓冲体系中进行。
可用本发明方法检测的小RNA，其长度没有特别限制，通常为15-200bp， 较佳地为18-100bp，更佳地为19-40bp。
可用本发明方法检测的含小RNA的生物学样品没有特别限制。应理解，生 物学样品是十分广泛的一个概念，可以是一个或多个细胞，也可以是样本或培 养物(包括微生物培养物)，甚至包括合成来源的样本。通常，生物样本可以是 动物样品，包括人类样品如体液、固体样品如骨骼或组织。样品也可以是液态 或固态食物或饲料及药物，如乳制品、蔬菜、肉类及肉制品、水等。样品可以 来源于任何家养或野生动物，如有蹄类、熊类、鱼类、兔类、啮齿类等。
应用
小RNA的检测及定量是其靶基因及通路的发现、疾病机理的研究、药物安 全性及功效的评估、疾病诊断及预后评估的重要工具。比如，比较不同组织中 的小RNA的含量，比较外因刺激前后(物理或化学治疗)组织中小RNA的量的变 化。血清或血浆中小RNA也可作为肿瘤分类、疾病诊断、预测及评估预后情况 的重要生物学标记。
本发明的主要优点在于：
(a)专一性非常强。
(b)灵敏度高。
(c)同时适合高通量筛选和精细筛选。
(d)重复性高。
(e)价格便宜。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork： ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。
实施例1
在实时荧光定量PCR法中EvaGreen具有更高的专一性
本发明人试验了4×106，4×105，4×104，4×103，4×102，40，4，以及0 (NTC)(NTC为无底物对照)个分子的模板量(hsa-let7a，SEQIDNO：1或表1)， 使用正向引物(SEQIDNO：9或表1)及反向引物(SEQIDNO：10或表1)连同含 有EvaGreen的PCR反应母液进行实时荧光定量PCR反应。
表1小RNA以及引物序列
名称 SEQ ID No. 序列(5’-3’) hsa-let-7a 1 UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU hsa-let-7b 2 UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU hsa-let-7c 3 UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU
hsa-let-7d 4 AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU hsa-let-7e 5 UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU hsa-let-7f 6 UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU hsa-let-7g 7 UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU hsa-let-7i 8 UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU let-7a正向引物 9 CCCCGTGAGGTAGTAGGTTGTATA let-7b正向引物 10 CCGGAGGTAGTAGGTTGTGT let-7c正向引物 11 GCCGGTAGTAGGTTGTATGGT let-7d正向引物 12 CCCCAGGTAGTAGGTTGCAT let-7e正向引物 13 CGGGAGGTAGGAGGTTGTAT let-7f正向引物 14 CCCCCTGAGGTAGTAGATTGTATAG let-7g正向引物 15 CCCCGTGAGGTAGTAGTTTGTAC let-7i正向引物 16 CGGGAGGTAGTAGTTTGTGC let-7a反向引物 17 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAAC let-7b反向引物 18 TCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACC let-7c反向引物 19 GGATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTA let-7d反向引物 20 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT let-7e反向引物 21 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT let-7f反向引物 22 GGATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAA let-7g反向引物 23 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT let-7i反向引物 24 ATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACA c7a 25 AACTATACTTCCTACTACCTCT c7e 26 AACTATACTTCCTCCTACCTCT
结果如图4、图5和图6所示。其中，图5显示了灵敏度、线性及模板浓 度动态范围。
在测试含有EvaGreen的PCR的专一性实验中，针对人类let7家族的8 个小RNA成员(序列如SEQIDNo：1-8所示或表1所示)，本发明人分别使用 4×106个拷贝数的小RNA作为模板，用特异性PCR引物对(序列如SEQIDNO： 9-24所示或表1所示)进行PCR反应，并检测各小RNA成员对各个不同的PCR 引物的PCR反应的专一性及灵敏度。
本实施例同时采用了EvaGreen和SYBRGreen两种双链DNA结合染料，对 其专一性及灵敏度进行对比。如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低一个 Ct值，则非同族的反应相当于同族反应的50％，即其交叉反应为50％；同理， 如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低2个Ct值，则非同族的反应相当 于同族反应的25％，即其交叉反应为25％；以此类推，如果同族的反应的Ct值 比非同族的Ct值低3个Ct值，则非同族的反应相当于同族反应的12.5％，即 其交叉反应为12.5％；如果同族的反应的Ct值比非同族的Ct值低4个Ct值， 则非同族的反应相当于同族反应的6.25％，即其交叉反应为6.25％。在小RNA 检测实验中，普遍可以接受低于5％的交叉反应。
本实施例中，同时使用了EvaGreen及SYBRGreen两种双链DNA结合染料， 对let7家族的8个小RNA成员实时荧光定量反应的专一性及灵敏度进行对比。
结果如图6所示，在所有的49个交叉反应中，8个基于SYBRGreen染料 的定量PCR有大于5％的交叉反应，最高的交叉反应高于70％，相比之下，基于 EvaGreen染料的交叉反应均小于5％。因此，基于EvaGreen的实时荧光定量PCR 法的专一性高于基于SYBRGreen的实时荧光定量PCR法。
众所周知，小RNA的序列很短中，且不同小RNA的序列很相似，因此能区 分不同小RNA的专一性引物显得尤为重要。
令人非常意外的是，从图6以及表2A和2B可发现，在EvaGreen反应中， 表征非特异性交叉反应的相对值总和为15.1(见表2A)。与之相反，在SYBR GREEN反应中，表征非特异性交叉反应的相对值总和高达161(见表2B)。换言 之，对于同样的引物对，同样的小RNA，SYBRGreen的交叉反应居然比EvaGreen 的交叉反应高出10倍之多(161.3，14.8＝10.89)。即，使用EvaGreen把专一性 提高了一个数量级。
表2AEvaGreen测试结果
表2BSYBRGreen测试结果
注：在表2A和2B中，let-7a表示小RNAlet-7a；Let-7A表示针对小RNAlet-7a 的特异性引物对；依此类推。NTC表示无模板。
其中，将使用特异性引物时的配对配对反应的活性值定位为100，交叉反应 的活性值为相对于配对反应的活性值的比值。
结果汇总
在本实施例的小分子RNA的测定中，应用两种DNA结合染料EvaGreen和 SYBRGreen相比，测定的灵敏度比较接近，但EvaGreen的专一性明显高于SYBR Green。
实施例2
退火实验证明EvaGreen具有更高的专一性
分别使用EvaGreen(组A)或SYBRGreen的染料(组B)，500nM的let-7e 正向引物(SEQIDNO：13)与500nM的c7e(SEQIDNO：26)可形成完全配对的双 链结构(曲线1，3)，使用500nMc7a(SEQIDNO：25)作为对照与let-7e正向 引物形成非专一性的的双链结构(曲线2，4)。该反应在50mM的Tris(pH8.0)， 且含有2.5mM的氯化镁的缓冲液中进行。
结果如图7所示。无论使用EvaGreen或SYBRGreen染料，专一性结合的 的双链退火曲线峰值的温度均高于非专一性结合双链的峰值峰值的温度，这证 明专一性结合的退火温度较非专一性结合的高。然而，对于专一性结合与非专 一性结合的曲线峰值之间的温度差使用EvaGreen(TSeva)染料时明显大于使用 SYBRGreen(TSSYBR)。这个实验参数证明了在EvaGreen的染料中，引物的专一 性强。
另外，deva是在曲线1与曲线2在曲线1达到峰值的温度时的荧光落差； dSYBR是在曲线3与曲线4在曲线3达到峰值的温度时的荧光落差。落差的高表 明两个结合状态差别大，落差的小表明两个结合状态差别小。deva大于dSYBR说 明：非专一性结合在EvaGreen中要比在SYBRGreen中少。这两个退火实验 参数，从两个角度进一步验证了在PCR试验中观察到的现象，证实了我们的发 现有其物理学基础。
综上所述，退火实验进一步证明，EvaGreen法在退火时较SYBRGreen法 有更高的专一性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。