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1、(10)授权公告号 CN 102851334 B (45)授权公告日 2014.01.01 CN 102851334 B (21)申请号 201210225758.6 (22)申请日 2012.07.03 C12P 17/18(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 (72)发明人 刘建新 熊江林 叶均安 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 王江成 CN 102321631 A,2012.01.18, 权利要求 8. (54) 发明名称 一种黄曲霉毒素 B。
2、1 的发酵培养基及发酵方 法 (57) 摘要 本发明属于发酵工程技术领域， 特别涉及一 种产生黄曲霉毒素 B1 的发酵培养基和发酵方法。 一种黄曲霉毒素 B1 的发酵培养基， 该培养基的组 份中含有占培养基总重量 1 5% 的酵母提取物， 所述的发酵培养基为复苏培养基、 固体发酵培养 基或生长促进营养液。 一种黄曲霉毒素B1的发酵 方法， 包括菌种复苏和固体发酵培养两个步骤， 采 用黄曲霉菌种进行发酵， 采用本发明提供的发酵 培养基进行菌种复苏和固体发酵培养。按照本发 明提供的培养基和培养程序， 黄曲霉毒素 B1 发酵 培养基固体风干物中浓度可达 7349ppb， 相比现 有技术的发酵效价， 。
3、具有显著的进步。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 田颖 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 (10)授权公告号 CN 102851334 B CN 102851334 B 1/1 页 2 1. 一种黄曲霉毒素 B1 的发酵方法， 包括菌种复苏和固体发酵培养两个步骤， 采用黄 曲霉菌种进行发酵， 其特征在于包括如下步骤 ： a、 采用复苏培养基进行菌种复苏， 所述的复苏培养基各组分按重量百分比计包括 ： 520%蔗糖， 15%酵母提取物， 1 5% 麸皮浸提液， 1.5% 琼脂， 1 4g/L 。
4、硝酸钠， 0.2 0.8g/L 硫酸镁， 0.2 0.8 g/L 氯化钾， 0.6 1.2 g/L 磷酸氢二钾， 0.01g/L 五水硫酸亚铁， 余量为水， 培养基的初始 pH 为 5.5 7.0 ； b、 采用固体发酵培养基进行固体发酵培养， 所述的固体发酵培养基各组分按重量百分比计包括 ： 6080%籼米， 830%蔗糖， 4 10%豆粕， 15%酵母提取物， 15%麸皮， 按比例配制完后， 调节固体发酵培养基含水量为 5 10%。 2. 根据权利要求 1 所述的发酵方法， 其特征在于 ： 所述的固体发酵培养基中， 所述的 籼米、 豆粕和麸皮经粉碎， 过 20 40 目标准分样筛。 3. 。
5、根据权利要求 1 所述的发酵方法， 其特征在于 ： 所述麸皮浸提液的制备方法如下 ： 取1单位重量麸皮置于干净烧杯中， 然后加注4单位重量蒸馏水， 将麸皮和水充分混合均匀 后， 放置在 37恒温水浴锅中， 浸泡 10 12h， 取上清液放置于离心管中， 2000 3000rpm， 离心 5 10 分钟， 再将离心管中的上清液吸入到干净的烧杯中， 麸皮浸出物制备完毕。 权 利 要 求 书 CN 102851334 B 2 1/6 页 3 一种黄曲霉毒素 B1 的发酵培养基及发酵方法 技术领域 0001 本发明属于发酵工程技术领域， 特别涉及一种产生黄曲霉毒素 B1 的发酵培养基 和发酵方法。 背。
6、景技术 0002 黄曲霉毒素 （Aflatoxins） 是黄曲霉或寄生曲霉产生的一类真菌毒素， 为剧毒和强 致癌物， 于 1993 年被世界卫生组织 （WHO） 的癌症研究机构划定为类致癌物。目前已确定 的黄曲霉毒素有 20 多种， 而污染粮食的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 和 M1 等。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用， 严重时可导致肝癌甚至急 性中毒死亡。在天然污染的粮食中， 黄曲霉毒素 B1 毒性最大， 量也最多， 致癌性也最强。黄 曲霉毒素 B1 可在玉米， 花生， 花生油、 大米、 棉籽、 禽蛋、 肉、 奶 （奶制品） 和一些干果中检测 。
7、到， 尤其是高温高湿地区的粮油及制品中检出率和含量更高。如果含有黄曲霉毒素 B1 的食 品被人食用， 会引起急性黄曲霉毒素中毒或诱发肝癌。含有黄曲霉毒素 B1 的饲料被动物食 用， 常引起动物急性中毒或带来抗病力低等亚临床症状。此外， 乳用动物 （如 ： 奶牛） 还可将 饲料中的黄曲霉毒素 B1 转化为乳品中的黄曲霉毒素 M1， 进而带来乳品和乳制品的食品安 全问题。 0003 为了探索食品或饲料中黄曲霉毒素 B1 的含量控制方法， 需要开发出适合黄曲霉 生长 （复苏） 快、 活力高的培养基， 研究黄曲霉的生长特性和产毒规律。在进行食品或饲料中 黄曲霉毒素 B1 含量检测时， 实验需要的黄曲霉。
8、毒素 B1 标准品， 均来自国外纯品， 原因之一 在于国内黄曲霉发酵培养基中黄曲霉毒素 B1 含量偏低， 提取所需培养基量大， 成本高。另 外， 要深入研究黄曲霉毒素B1的致病机理， 也必须选用黄曲霉毒素B1含量高的培养物或黄 曲霉毒素 B1 的提取物， 进行动物实验， 建立各种动物模型， 对其致毒和解毒进行研究。 0004 目前， 国内部分研究者进行动物毒理研究所使用的黄曲霉毒素 B1， 常来自国外的 纯品， 价格昂贵 （如Sigma公司生产黄曲霉毒素B1价格为569RMB/mg） ， 试验成本高。 而目前 国内报道的黄曲霉培养物中黄曲霉毒素 B1 最高含量为 3312ppb（庄振宏， 20。
9、10） ， 毒素含量 较低， 单次实验所需培养物多， 对实验的干扰也大。 0005 综上所述， 有必要开发出黄曲霉毒素 B1 的发酵培养基及发酵方法， 研究黄曲霉的 生长特性， 探索出饲料和食品中黄曲霉毒素 B1 含量的最佳控制方法和开展黄曲霉素 B1 对 动物的致毒解毒实验研究。 发明内容 0006 本发明提供了一种产生黄曲霉毒素 B1 的发酵培养基， 用于解决目前传统培养基 的孢子活力低、 生长 （复苏） 周期长、 以及产毒量低的问题。 0007 本发明还提供了一种生产黄曲霉毒素 B1 的发酵方法。 0008 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 0009 一种黄曲霉毒素B1的发酵培。
10、养基， 该培养基的组份中含有占培养基总重量15% 说 明 书 CN 102851334 B 3 2/6 页 4 的酵母提取物， 所述的发酵培养基为复苏培养基、 固体发酵培养基或生长促进营养液。 0010 作为优选， 所述的复苏培养基各组分按重量百分比计包括 ： 5 20% 蔗糖， 1 5% 酵母提取物， 1 5% 麸皮浸提液， 1.5% 琼脂， 1 4g/L 硝酸钠， 0.2 0.8g/L 硫酸镁， 0.2 0.8 g/L 氯化钾， 0.6 1.2 g/L 磷酸氢二钾， 0.01g/L 五水硫酸亚铁， 余量为水， 培养基的 初始 pH 为 5.5 7.0。为了实现黄曲霉孢子的快速复苏， 发明人。
11、设计了由蔗糖、 酵母提取 物、 麸皮浸提液、 琼脂、 NaNO3和微量元素配制成新的黄曲霉复苏培养基， 试验显示利用本发 明复苏培养基， 黄曲霉孢子复苏所需的时间仅需二天， 比传统 Czapek s 培养基的复苏时间 缩短四天。 0011 作为优选， 所述的固体发酵培养基各组分按重量百分比计包括 ： 60 80% 籼米， 8 30% 蔗糖， 4 10% 豆粕， 1 5% 酵母提取物， 1 5% 麸皮， 按比例配制完后， 调节固体 发酵培养基含水量为 5 10%。作为优选， 所述的籼米、 豆粕和麸皮经粉碎， 过 20 40 目标 准分样筛。该固体发酵培养基可实现黄曲霉高效产黄曲霉毒素 B1。 0。
12、012 作为优选， 所述的生长促进营养液各组分按重量百分比计包括 ： 520%蔗糖， 1 5% 酵母提取物， 1 5% 麸皮浸提液， 1 4g/L 硝酸钠， 0.2 0.8g/L 硫酸镁， 0.2 0.8 g/ L 氯化钾， 0.6 1.2 g/L 磷酸氢二钾， 0.01g/L 五水硫酸亚铁， 余量为水， 培养基的初始 pH 为5.57.0。 该生长促进营养液用于补充发酵培养过程中营养物质和水分的损失， 可确保 黄曲霉菌在固体发酵培养基上高活力生长。 0013 作为优选， 所述麸皮浸提液的制备方法如下 ： 取 1 单位重量麸皮置于干净烧杯中， 然后加注 4 单位重量蒸馏水， 将麸皮和水充分混合。
13、均匀后， 放置在 37恒温水浴锅中， 浸泡 10 12h， 取上清液放置于离心管中， 2000 3000rpm， 离心 5 10 分钟， 再将离心管中的 上清液吸入到干净的烧杯中， 麸皮浸出物制备完毕。制备的麸皮浸出物要求现配现用。 0014 培养基的灭菌要求 ： 所述的复苏培养基、 固体发酵培养基及生长促进营养液， 分 别按比例配制好后 （其中复苏培养基还需经过电炉加热溶解琼脂） ， 置于锥形瓶中在 121 123， 0.12MPa， 灭菌 20min， 各培养基配制工作结束。 0015 复苏培养基的倒置 ： 在生物安全柜中， 将灭菌好的复苏培养基倒置在经过灭菌的 直径 10cm 培养皿中，。
14、 自然冷却。 0016 一种黄曲霉毒素 B1 的发酵方法， 包括菌种复苏和固体发酵培养两个步骤， 采用黄 曲霉菌种进行发酵， 采用本发明提供的发酵培养基进行菌种复苏和固体发酵培养。该方法 采用了上述改进后的培养基， 发酵选用的菌种为黄曲霉菌 （来自中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， 编号 3.4409） ， 发酵工艺采用常规的工艺。按照本发明提供的培养 基和培养程序， 黄曲霉毒素 B1 发酵培养基固体风干物中浓度可达 7349ppb， 相比现有技术 的发酵效价， 具有显著的进步。 0017 本发明的有益效果是 ： 本发明研制的黄曲霉复苏培养基， 霉菌生长速度快， 孢子 活力高， 复。
15、苏或传代的时间极大缩短， 提高了工作效率。本发明研制的固体发酵培养基， 营 养丰富， 菌体生长旺盛， 培养周期短， 仅需 12 14 天， 相对普通大米培养基， 培养时间缩短 3 4 天， 且黄曲霉毒素 B1 浓度显著提高。本发明提供的固体发酵培养基， 主要采用籼米、 麸皮、 豆粕、 蔗糖和酵母， 原料易得、 廉价。相对从国外进口的黄曲霉毒素 B1， 本发明提供的 培养基生产出的黄曲霉素 B1 价格可降低 80% 以上。本发明提供的发酵方法， 简单易行， 可 操作性强。 说 明 书 CN 102851334 B 4 3/6 页 5 具体实施方式 0018 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方。
16、案作进一步的具体说明。 应当理解， 本发 明的实施并不局限于下面的实施例， 对本发明所做的任何形式上的变通和 / 或改变都将落 入本发明保护范围。 0019 在本发明中， 若非特指， 所有的份、 百分比均为重量单位， 所有的设备和原料等均 可从市场购得或是本行业常用的。 0020 本发明的各实施例， 以中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的黄 曲霉 （Aspergillus flavus） 3.4409， 进行阐述。 0021 实施例 1-4 黄曲霉生长促进营养液的配制 0022 将表 1 所示的各组份混合后， 用盐酸溶液调节混合溶液的 pH 值为 5.5 7.0。 0023 表 1。
17、 0024 0025 现以实施例 2 为例， 配制 1L 生长促进营养液。称取 150g 蔗糖， 20g 酵母提取物， 20ml 麸皮浸提液， 2gNaNO3， 0.3gMgSO4， 0.3gKCl， 0.8gK2HPO4， 0.01gFeSO4.7H2O， 810ml 蒸馏 水， 置于 2000ml 锥形瓶中， 加热溶解所有原料后， 使用 5mol/L 浓度的盐酸调节 pH 值于 5.5 7.0。pH 调节完毕， 盖上棉塞， 在 121 123， 0.12MPa， 灭菌 20min。在生物安全柜 中冷却后， 生长促进营养液配制完成。 0026 所述麸皮浸提液的制备方法如下 （下同） ： 取 。
18、1 单位重量麸皮置于干净烧杯中， 然后 加注4单位重量蒸馏水， 将麸皮和水充分混合均匀后， 放置在37恒温水浴锅中， 浸泡10 说 明 书 CN 102851334 B 5 4/6 页 6 12h， 取上清液放置于离心管中， 2000 3000rpm， 离心 5 10 分钟， 再将离心管中的上清液 吸入到干净的烧杯中， 麸皮浸出物制备完毕。 0027 实施例 5-8 黄曲霉复苏培养基的配制 0028 一种黄曲霉复苏培养基， 将表 2 所示的各组份混合后， 用盐酸溶液调节混合溶液 的 pH 值为 5.5 7.0。 0029 表 2 0030 0031 现以实施例 6 的黄曲霉复苏培养基配方为例，。
19、 配制 1L 复苏培养基。称取 150g 蔗 糖， 20g 酵 母 提 取 物 ,20ml 麸 皮 浸 提 液， 2gNaNO3， 0.3gMgSO4， 0.3gKCl， 0.8gK2HPO4， 0.01gFeSO4.7H2O， 15g 琼脂粉， 795ml 蒸馏水， 置于 2000ml 锥形瓶中， 加热溶解所有原料后， 使用 5mol/L 浓度的盐酸调节 pH 值于 5.5 7.0。pH 调节完毕， 盖上棉塞， 在 121 123， 0.12MPa， 灭菌 20min。在生物安全柜中， 将灭菌的复苏培养基 60未凝固， 倒置在经过灭菌 的直径 10cm 培养皿中。自然冷却， 即复苏培养基制备。
20、完毕。 0032 黄曲霉菌种保藏的斜面培养基的配制。 0033 按照黄曲霉复苏培养基配方表， 配制所需菌种保藏培养基。将配制好的复苏培养 基， 在培养基 60未凝固时， 倒置在灭菌的试管中， 体积约为试管容量的 1/3， 倾斜试管， 自 然冷却， 即菌种保存培养基制备完毕。 0034 实施例 9-12 黄曲霉固体发酵培养基的配制 说 明 书 CN 102851334 B 6 5/6 页 7 0035 按照表 3 的配方， 配制所需培养基。 0036 表 3 0037 0038 原料准备 ： 将籼米、 豆粕和麸皮粉碎， 粒度要求能过 20 目标准分样筛， 但不可过 40 目标准分样筛， 即介于 。
21、20 40 目。 0039 现以实施例 10 的组份为例， 配制 1kg 的固体发酵培养基。称取 120g 蔗糖， 20g 酵 母提取物， 30g 麸皮， 750g 籼米， 80g 豆粕， 另量取 80ml 蒸馏水， 将上述原料混合均匀， 置于 3000ml 锥形瓶中， 盖上棉塞， 在 121 123， 0.12MPa， 灭菌 20min。在生物安全柜中， 将已 灭菌的固体培养基倒置在已灭菌的三角烧瓶中， 平铺厚度为 1cm， 或装载量为 50g/500ml 三 角瓶， 盖上已灭菌的瓶塞。至此， 黄曲霉发酵固体培养基配制完毕。 0040 实施例 13 黄曲霉的发酵培养 0041 1、 黄曲霉的。
22、复苏培养方法 ： 0042 安瓿瓶开启 ： 用 75% 的酒精脱脂棉对安瓿外表面进行消毒， 用酒精灯对顶端加热， 滴少许无菌水于加热顶端， 使之破裂， 然后用镊子敲下破裂的安瓿瓶顶端。 0043 冻干粉溶解 ： 使用无菌吸管吸取 0.3ml 生理盐水， 滴入安瓿瓶内， 轻轻振荡， 使冻 干菌体溶解呈悬浮状。 0044 菌种复苏 ： 用一次性无菌注射器吸取 0.5ml， 均匀点样于实施例 6 配制好的复苏培 养基平板上， 然后无菌玻璃棒将菌液涂抹分布均匀。将已接黄曲霉的复苏培养基置于 35 恒温培养箱中培养 48h， 即可生长出大量的菌丝， 达到试验要求， 复苏完毕。 0045 分别采用实施例 。
23、5、 7、 8 制得的复苏培养基， 黄曲霉复苏达到满足实验要求所需时 间分别为 52h、 46h 和 43h。 0046 2、 菌种保存 ： 在生物安全柜中， 使用无菌接种针， 灭菌冷却后， 挑取少量菌液， 在前 述制得的黄曲霉菌种保藏的斜面培养基斜面上呈 Z 字型划线， 盖上已灭菌的透气棉塞， 然 后置于 35恒温培养箱中培养 36h。待生长出较多的菌丝后， 放置在 4保鲜柜中保存， 每 两个月， 按照本方法传代一次。 0047 3、 黄曲霉在发酵培养基上发酵 0048 黄曲霉菌增殖培养 ： 使用无菌接种环， 在黄曲霉已复苏的琼脂平板上刮取菌丝， 然 说 明 书 CN 102851334 B。
24、 7 6/6 页 8 后多个复苏培养基上密集划线， 置于 35恒温培养箱中培养 48h。长满菌丝的琼脂平板， 用 作提供发酵所需的孢子。 0049 黄曲霉发酵用孢子液的准备 ： 在生物安全柜中， 吸取 2ml 无菌生理盐水， 注射到 已复苏黄曲霉琼脂平板上， 然后用无菌玻璃棒小心刮取菌丝， 吸取菌液， 置于 250ml 锥形瓶 中， 然后使用无菌生理盐水稀释， 直到菌液中黄曲霉孢子密度为 1.0106cfu/ml。 0050 用一次性注射器吸取2.5ml黄曲霉孢子液， 缓慢点样于实施例10配制好的固体培 养基， 同时使用无菌玻璃棒混合均匀， 盖上灭菌的透气棉塞， 置于 35恒温培养箱中培养。 。
25、同时， 在培养箱中放置一盆自来水， 将毛巾一端置于水中， 一端悬挂在网架上， 形成水帘， 以 控制培养箱中的相对湿度为 80 90%。 0051 每天检测记录培养箱中湿度， 以及锥形瓶中黄曲霉发酵状态。 0052 每间隔 3 天， 在生物安全柜中使用无菌玻璃棒将发酵培养基搅拌， 同时喷洒 2.5ml 生长促进营养液 （由实施例2制得） ， 以补充发酵过程中营养物质和水分的损耗， 确保黄曲霉 菌在固体发酵培养基上高活力生长并缩短培养时间 2 3 天。铺平发酵培养基后， 盖上无 菌棉塞， 置于 35恒温培养箱中继续培养。 0053 经过 12 14 天的发酵培养， 锥形瓶中培养基彻底发酵， 菌丝颜。
26、色呈深绿色， 发酵 培养结束。将培养物于 121 123， 0.12MPa， 灭菌 20 min， 然后烘干粉碎， 含有黄曲霉毒 素 B1 的培养物制备完毕。 0054 用高效液相色谱法 （GB/T 5009.23-2006） 检测发酵培养基中黄曲霉毒素 B1 的含 量。采用实施例 10 的固体发酵培养基， 发酵培养 12 天， 黄曲霉毒素 B1 在最终发酵培养基 风干样中浓度为 7351ppb。 0055 采用实施例 9、 11、 12 的固体发酵培养基， 在上述相同条件下进行发酵处理， 黄曲 霉毒素 B1 在最终发酵培养基风干样中浓度分别为 7151ppb、 7210ppb 和 7349p。
27、pb。 0056 实施例 14 黄曲霉的发酵培养 0057 具体方法同实施例 13， 采用的复苏培养基为实施例 6 制得， 采用的固体培养基由 实施例 10 制得， 不同之处在于 ： 黄曲霉发酵过程分别采用实施例 1、 3、 4 的生长促进营养液 进行喷洒， 在上述相同条件下进行发酵处理， 黄曲霉毒素 B1 在最终发酵培养基风干样中浓 度分别为 7320ppb、 7210ppb 和 7346ppb。 0058 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说 明 书 CN 102851334 B 8 。