技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及利用甲基化技术对提取自酪蛋白的ACE抑制十肽YQKFPQYLQY进行修饰，从而提高该多肽的稳定性。
背景技术
随着现代社会发展的不断进步，生活节奏的不断加快，生活方式也随之发生了很大变化，高脂高糖高盐食物的摄入越来越多，运动量却逐渐减少，这种不良的生活方式导致高血压患病率逐年增加，且呈现一定的年轻化趋势。
高血压有原发性高血压和继发性高血压两种类型。原发性高血压患者占总高血压患者的95％以上，由原发性高血压所引起的脑卒中、冠心病等，在总患病率和总死亡率中所占的比例日益增高。高血压发病期间，人们往往会服用一些辅助性降压药，目前，常用的降压药主要有受体阻滞剂、利尿降压药、钙通道阻滞剂(CCB)、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)等。这些降压药物在一定程度上确实起到了降压的作用，但同时也会给服药者带来很大的毒副作用。例如利尿降压药可能会造成患者血糖、血胆固醇、血尿酸和甘油三酯升高及血清钾降低等危害。β-受体阻滞剂会引起眩晕、疲惫、嗜睡、胃肠紊乱(恶心、腹泻)等，还可以引起严重的心动过缓、诱发急性心力衰竭或支气管哮喘、四肢冷厥及雷诺现象等。
人们发现通过水解某些食品蛋白质可以得到具有降压效果的多肽，这种来源于天然食品的ACE(angiotensin converting enzyme)抑制肽具有更高的安全性，而且对正常血压无降压作用，因此成为了目前预防和治疗高血压最具开发价值的产品之一。
在食源性生物活性肽中，又以乳源生物活性肽作用显著。它是指与乳中某些蛋白质肽链的某些片段相同或相似，在乳中固有的或在乳蛋白降解过程中产生的具有生物活性的肽类。随着不同功能的乳源性活性肽的发现，对乳蛋白质的研究已成为生理学界和营养学界的研究热点。
酪蛋白(casein)是乳中含量最丰富的蛋白质，在其大分子中含有多种具有生物活性的小分子片段，在不同蛋白酶的作用下，可释放出具有不同功能的分子片段，ACE抑制十肽就是其中的一种。近年来国内外研究结果表明，当乳中酪蛋白在生物体内或食品加工过程中用酶消化时，可以产生大量ACE抑制十肽，这些ACE抑制十肽具有无副作用、安全性高和易吸收等优点。
本课题组前期通过对酪蛋白进行胃蛋白酶及胰蛋白酶水解，从水解产物中分离纯化得到具有ACE抑制活性的片段，并对其进行测序，得到的ACE抑制十肽序列为YQKFPQYLQY。(具体过程参看专利CN 103275176 A)
N-甲基-α-氨基酸是很多具有生物活性生物天然产物的重要组成部分。对α-氨基酸的N-甲基化修饰会影响多肽与受体的相互作用，和没经过甲基化修饰的前体相比生物活性可能会发生改变。同时，包含N-甲基氨基酸的多肽类似物具有更高的抗蛋白酶降解能力。因此，N-甲基氨基酸常作为氨基酸和多肽衍生物构象研究的工具。
发明内容
本发明的目的是保持ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的降血压活性的同时，提高其热稳定性、酸碱稳定性和消化稳定性，以便于该ACE抑制十肽在工业化的生产及流通环节中能够保持其活性。本发明将ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的第三个氨基酸赖氨酸进行甲基化修饰后，衍生物能够满足上述要求，因而该甲基化衍生物适合于加工为保健食品或药品。
为实现本发明的目的所采用的技术方案如下：
一种ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物的制备方法，按照下述步骤进行：
1)称取1g王树脂放入反应器中，加入二氯甲烷溶胀半小时，然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一个氨基酸：1mmol当量的L型酪氨酸，1mmol的N,N-二异丙基碳二亚胺；1mmol的4-二甲氨基吡啶，6-10ml的富马酸二甲脂溶液，用氮气鼓泡反应3h；然后加入1ml吡啶，1ml乙酸酐，反应半小时，抽掉反应液，用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗净；
2)加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，并用茚三酮检测；
3)向反应器中加入序列中第二个氨基酸谷氨酰胺(Gln)3mmol，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及N,N-二异丙基碳二亚胺，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用二甲基甲酰胺洗净，并用茚三酮检测；
4)依步骤2、3的方式依次加入序列中第三个氨基酸Lys(Me)、第四个氨基酸Phe、第五个氨基酸Pro、第六个氨基酸Gln、第七个氨基酸Tyr、第八个氨基酸Leu、第九个氨基酸Gln、第十个氨基酸L-Tyr，直至最后第十个氨基酸L-Tyr反应结束，其中第三个氨基酸为经过甲基化的赖氨酸；
5)加6-10ml的95％三氟乙酸切割液，震荡反应2h，将氨基酸的侧链保护基团裂解 下来，得到粗肽产物；
6)分析提纯和质谱检测：用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪检测该序列分子量的正确性，用高效液相色谱将粗肽提纯至90％纯以上；
7)收集步骤6)纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩冻干，冻干成白色粉末得到ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物。
所述ACE抑制十肽的赖氨酸甲基化衍生物：其命名为YQK(Me)FPQYLQY，其氨基酸序列为Tyr-Gln-Lys(Me)-Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr。
相对于现有技术,本发明具有如下有益效果：
1.本发明是在前期研究所获得的酪蛋白源ACE抑制十肽α2f(98-107)：YQKFPQYLQY的基础上，对序列上的赖氨酸进行甲基化修饰得到的新的ACE抑制十肽YQK(Me)FPQYLQY。经体外实验和体内实验证实，该多肽具有抑制血管紧张素转换酶的活力和降血压功能。
2.在ACE抑制十肽的甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的制备上，不采用水解蛋白——纯化多肽——基团修饰这一传统技术路线，而是采用固相合成技术进行化学合成，其中赖氨酸先甲基化修饰，而后再连接到多肽序列上。
3.本发明的活性多肽YQK(Me)FPQYLQY的热稳定性、酸碱稳定性和消化稳定性较原序列均有所提高。稳定性的提高，使得修饰后的ACE抑制十肽在生产加工、贮藏、运输和销售的过程中性质更加稳定，因而更适合开发为保健食品或药物。同时，修饰后的ACE抑制十肽酸碱稳定性和消化稳定性更好，使其在消化道内更不易被人体消化酶所降解，从而能够稳定发挥降血压的作用。
4.本发明的ACE抑制十肽的甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY制备方法简单，易于提纯，纯度高。
附图说明
图1所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的ACE抑制率；
图2所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的ACE抑制率；
图3所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY对SHR大鼠血压的影响；
图4所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY对Wistar大鼠血压的影响；
图5所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY对SHR大鼠血压的影响；
图6所示为灌胃ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY对Wistar大鼠血压的影响；
图7所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的热稳定性结果；
图8所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的热稳定性结果；
图9所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的酸碱稳定性结果；
图10所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的酸碱稳定性结果；
图11所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY模拟胃液消化稳定性结果；
图12所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY模拟肠液消化稳定性结果；
图13所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的模拟胃液消化稳定性结果；
图14所示为ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的模拟肠液消化稳定性结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物YQK(Me)FPQYLQY的制备
1.称取1g wang树脂放入反应器中，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸：1mmol当量的L型酪氨酸，1mmol的DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)；1mmol的4-二甲氨基吡啶，适量6-10ml的富马酸二甲脂溶液，用氮气鼓泡反应3h；然后加入1ml吡啶，1ml乙酸酐，反应半小时，抽掉反应液，用DMF(二甲基甲酰胺)、DCM洗净；
2.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；
3.向反应器中加入序列中第二个氨基酸：3mmol谷氨酰胺(Gln)，3mmol 1-羟基苯并三 氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
4.依步骤2、3的方式依次加入序列中第三个氨基酸Lys(Me)、第四个氨基酸Phe、第五个氨基酸Pro、第六个氨基酸Gln、第七个氨基酸Tyr、第八个氨基酸Leu、第九个氨基酸Gln、第十个氨基酸L-Tyr，直至最后第十个氨基酸L-Tyr(L型酪氨酸)反应结束，其中，第三个氨基酸为经过甲基化的赖氨酸(Lys)；
具体步骤为：a.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第三个氨基酸：3mmol Lys(Me)，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
b.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第四个氨基酸：3mmol Phe，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
c.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第五个氨基酸：3mmol Pro，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
d.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第六个氨基酸：3mmol Gln，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
e.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第七个氨基酸：3mmol Tyr，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
f..加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第八个氨基酸：3mmol Leu，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
g.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第九个氨基酸：3mmol Gln，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
h.加入6-10ml哌啶去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；向反应器中加入序列中第十个氨基酸：3mmol L-Tyr，3mmol 1-羟基苯并三氮唑及DIC，氮气鼓泡反应一小时，抽掉液体，用DMF洗净，茚三酮检测；
5.加一定量6-10ml的质量百分比95％三氟乙酸切割液，震荡反应2h，将氨基酸的侧链 保护基团裂解下来，得到粗肽产物；
6.分析提纯和质谱检测：用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪检测该序列分子量的正确性，用高效液相色谱将粗肽提纯至90％纯以上；
7.收集纯化好的目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩冻干，冻干成白色粉末得到ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物。
实验例1
紫外分光光度法测定ACE抑制十肽体外活性的具体步骤如下：
取5mmol/L HHL溶液200μL与100μL ACE抑制十肽混合，置于37℃水浴中，预热5min，加入0.1U/mL ACE溶液20μL，于37℃恒温水浴中反应30min；然后，向反应体系中加入1mol/L HCl溶液250μL以终止反应。再加入1.7mL，经15s振荡混匀后离心(4000r/min，15min，4℃)，吸取1.0mL乙酸乙酯层，在120℃的烘箱中经30min蒸干，再将它重新溶于3mL的去离子水中，在波长228nm处测定吸光度。
由公式计算ACE抑制十肽的抑制率，其中A代表反应中ACE抑制剂与ACE同时存在下的吸光度；B代表反应中不加抑制剂时的吸光度，即对照；C代表ACE和HHL空白反应的吸光度，即空白。
采用上述的紫外分光光度法测定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的体外活性，其结果如图1，2所示
由图1所拟合的一元二次方程y＝-0.0004x2+0.0392x-0.0047(R2＝0.9687)，经过计算可得出ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的IC50值为15.25μg/mL。
由图2所拟合的一元二次回归方程为y＝-0.0004x2+0.0418x-0.0895(R2＝0.9850)，经过计算可得出ACE抑制十肽YQKFPQYLQY的赖氨酸甲基化衍生物的IC50值为16.81μg/mL。
实验例2：
用合成的ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY分别灌胃原发性高血压大鼠(SHR)检测其对SHR大鼠血压的影响。选用12周龄的雄性SHR大鼠32只，体重为(260±15)g，自由采食饮水，保持环境温度(23±1)℃，相对湿度60％±5％，预饲养一周。将大鼠随机分为4组，每组8只，分别为空白组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，分别灌胃生理盐水(10mL/Kg mb)、低、中、高剂量的合成产物(相对应的灌胃剂量为1、3、9mg/Kg mb)，另取Wistar大鼠10只，随机分为2组，每组5只，分别作为空白组和正常对照组，灌胃生理盐水和高剂量的合成产物。采用BP-2006A型 只能无创血压计(北京软隆科技有限责任公司)，测定大鼠的尾动脉收缩压(SBP)。测定前，将大鼠固定于鼠网保温套中于39℃恒温预热，使大鼠的尾动脉扩张，血流畅通。测定灌胃后1-8h的尾动脉血压，连续测定3次，取平均值。其对血压的影响如图3-图6所示。
由图3、图5可以看出，ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化衍生物对原发性高血压大鼠(SHR)均具有很好的降血压作用，与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)，由图4、图6可知，ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化衍生物对正常大鼠(Wistar大鼠)血压无影响(P>0.05)。
因此，无论体外还是体内实验，ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化衍生物YQK(Me)FPQYLQY均有较好的降血压作用，经过甲基化修饰后的肽片段的体外ACE抑制活性略有下降，但其体内降压效果持平。
实验例3
精确称取一定量样品配置成相同浓度，分别在4、20、37、60、80℃条件下保温60min，然后分别测定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨基酸甲基化修饰衍生物YQK(Me)FPQYLQY的ACE抑制率，其结果如图7、8所示。YQKFPQYLQY及其氨基酸甲基化衍生物具有较好的耐热稳定性，由图7、8可以看出甲基化衍生物的ACE抑制率波动幅度比原序列更小，经甲基化修饰后温度稳定性有所提高。
精确称取一定量样品用pH值分别为1、3、5、7、9、11的磷酸缓冲溶液配制成相同浓度，在4℃条件下分别放置0h、1h、2h、3h，然后分别测定ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物的ACE抑制率，其结果如图9、10所示。ACE抑制率均呈现下降趋势，强酸强碱条件下的样品的抑制率下降较为明显；酪蛋白源ACE抑制十肽YQKFPQYLQY在偏中性的条件下活性稳定性最强，强酸强碱条件下的活性损失较为明显，尤其是pH1条件下处理处理3h后与0h相比ACE抑制活性下降最为明显且具有显著性差异。经赖氨酸甲基化修饰后，衍生物的酸碱稳定性均有所提高，赖氨酸甲基化衍生物在碱性条件下ACE抑制活性比原序列YQKFPQYLQY更稳定。
根据中国药典第五部的要求，配制人工胃肠液。取人工胃液和人工肠液溶解ACE抑制十肽成一定浓度。经过人工胃液处理的样品于37℃条件下放置0h、1h和2h，人工肠液处理的样品于37℃条件下放置0h和4h，然后10000r/min，4℃条件下离心20min，取上清液，测定上清液的ACE抑制活性，其结果如图11-12所示。ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后抑制率略有下降，其结果如图13-14所示，但活性差异不显著(P>0.05)，说明ACE抑制十肽YQKFPQYLQY及其赖氨酸甲基化修饰衍生物具有良好的耐胃蛋白酶及胰蛋白酶消化稳定性。
由实验例1和实验例2可知原ACE抑制十肽YQKFPQYLQY经赖氨酸甲基化修饰之后体内外的抑制活性均略有下降，但体内的降压效果与原序列相比是持平的；结合实验例3可知ACE抑制十肽YQKFPQYLQY经赖氨酸甲基化修饰后稳定性均有所提高，尤其是酸碱稳定性提高较为明显。