技术领域
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与水稻剑叶形态调控基因NAL1有关的分子标 记及其获得方法。
背景技术
水稻叶片形态一直以来备受育种家关注，在水稻株型育种上具有重要的地位。改善水稻 叶形能够增大叶面积指数和提升叶片光合效率，为稳产、高产提供可靠的保障。叶片是水稻 植株的重要组成部分，是进行光合作用的主要场所；微卷直立的叶片形态是理想植株的重要 形态特征之一，已被直接或间接的应用于水稻理想株型育种。叶片适度的内卷能使叶片挺直 以减少披垂现象的发生，在生长发育后期作用明显，有利于改善水稻基部的受光条件，进而 提高植株光能的利用率，实现增产的目的。大量证据表明，叶片形态是受到体内遗传机制和 体外环境因子的双重调节。了解水稻叶形态建成的遗传规律，对于遗传上控制植株形态，发 展叶片发育的重要理论，改良叶平展度或卷曲度等遗传性状，提高水稻产量和品质有重要的 理论意义和实用价值。
近年来，随着分子生物学的快速发展和突变体研究技术的广泛应用，科学家借助于拟南 芥、金鱼草和玉米等模式植物在叶发育方面的研究，取得了一系列重要进展。关于水稻叶形 调控的研究相对较晚，但也已取得一些进展，Zhang等(2009)利用EMS诱变处理日本晴得到 一个单隐性卷叶突变体sll1，并通过图位克隆技术获得叶形调控基因SLL1，该基因编码一个 SHAQKYF类的MYB家族的转录因子，通过调控远轴面维管组织分化中的程序化死亡来控 制叶形的卷曲程度。Hibara等(2009)分离到反卷叶调控基因ADL1，该基因通过编码类似钙蛋 白酶的半胱氨酸蛋白酶调控近轴面泡状细胞的发育从而控制叶形的发育；Hu等（2010）以化 学诱变获得的水稻窄叶突变体，通过图位克隆技术将叶片宽度控制基因NRL1定位于第12染 色体，并成功分离该基因；Zhao等（2010）利用反卷叶突变体也成功克隆了控制水稻叶片反 卷的调控基因LC2。Zou等（2011）利用T-DNA插入方法筛选到一个反卷叶水稻突变体oul1， 并成功克隆相关的调控基因Roc5，该基因通过编码一个与亮氨酸链式结构VI家族同源的转 录因子，通过调控上表面泡状细胞的数量与大小，从而达到控制叶片的形态建成。Shi等（2007） 和Li等（2010）同样利用T-DNA插入诱变中花11，分别在第3、第4染色体上克隆到控制 叶片卷曲极性不同的基因OsAGO7和ACL1；另外还有2个由Huang等(2011)和Yamaguchi 等(2004)克隆的披叶调控基因DL2和DL。水稻叶宽调控基因NAL1最早由Qi等（2008）水 稻窄叶突变体中克隆，认为该基因通过调控生长素极性运输来影响叶片形态发育。随后多位 科学家利用不同的遗传材料对该等进行研究。ChenML(2012)、TakaiT(2013)和FujitaD（2013） 等利用美国javanica品种D50和籼稻品种HB277，粳稻Koshihikari和籼稻品种Takanari，新 株型热带粳稻品种和籼稻IR64分别构建重组自交系和染色体片段置换系克隆了与NAL1基因 等位的叶宽相关qFLW4、光合效率相关GPS基因和枝梗数相关SPIKE基因。籼粳亚种间该 等位基因的编码序列中差异比较保守，主要存在3个单碱基的替换差异，因此而造成了对株 型和穗型等多个性状发育调控的影响差异。这些叶片形态调控基因的克隆及功能研究，将有 助于水稻育种家在育种过程中通过生物设计对叶型和株型进行改良，从而实现优化高效的育 种目的。但总体而言，在水稻中分离到控制叶形发育相关基因的数量还相对偏少，加之功能 研究进展的缓慢，目前尚不能建立起有效的基因调控网络体系，难以更好的从分子水平上揭 示叶片发育的分子机理。目前，从分子水平对单子叶模式作物及主要粮食作物的水稻的叶形 态建成机制研究还正处于起步阶段，对叶形发育的调控机理研究尚显不足，在一定程度上阻 碍了通过分子调控来建立理想株型的实施、超级稻高产育种的机理的探索和应用。这将 是摆在我们面前的一项艰巨的任务和长久的挑战。
叶片形态对大多数作物来说是一种非常重要的农艺性状，大部分叶片形态发生改变之后 都会直接或间接影响到植物体的光合作用、蒸腾作用、极性运输和抗逆性等生理功能。研究 表明，水稻叶片与其籽粒同化物的形成有密切的联系，因此，对水稻产量的形成亦有重要的 影响（YoshidaS,1981）。鉴于此作用，水稻中叶片形态改良一直都是株型育种中至关重要的 一个目标，遗传学家与育种家花费巨大的精力用来研究叶片形态的遗传特性，以期提高水稻 的产量，研究中遇到的困难不少，但随着研究的深入和科学技术的进步及技术手段的丰富， 取得的成绩斐然，最值得令人称赞的是卷叶性状在水稻品种改良中的成功运用。
上文中涉及的参考文献如下：
1.黄耀祥,1990,水稻育种超高产的研究,作物杂志,(4):1-2；
2.郎有忠,张祖建,顾兴友,杨建昌,朱庆森,2004,水稻卷叶性状生理生态效应的研究 叶I.剑叶姿态、群体构成及光分布特征,作物学报,30(8):739-744；
3.沈福成,1983,关于水稻卷叶性状在育种中利用的几点看法,贵州农业科学,(5):6-8；
4.袁隆平.杂交水稻超高产育种.杂交水稻，1997,12(6):1-6；
5.MingliangChenJuLuoGaonengShaoXiangjinWeiShaoqingTangZhonghua ShengJianSongPeisongHu(2012)FinemappingofamajorQTLforflagleafwidthinrice, qFLW4,whichmightbecausedbyalternativesplicingofNAL1.PlantCellRep,31:863–872（ MingliangChenJuLuoGaonengShaoXiangjinWeiShaoqingTangZhonghuaSheng JianSongPeisongHu(2012).NAL1可变剪接调控水稻剑叶宽度主效QTLqFLW4的精细定位. 植物细胞通报，31:863–872）；
6.HuJ.,ZhuL.,ZengD.L.i,GaoZ.Y.,etal.2010,Identificationandcharacterizationof NARROWANDROLLEDLEAF1,anovelgeneregulatingleafmorphologyandplantarchitecture inrice.PlantMolBiol,73:283–292（HuJ.,ZhuL.,ZengD.L.i,GaoZ.Y.,etal.2010,1个调控水 稻叶形和株型的重要基因NAL1的分离与鉴定.植物分子生物学,73:283–292）；
7.FujitaD,TagleAG,EbronLA,FukutaY,KobayashiN(2012)Characterizationof nearisogeniclinescarryingQTLforhighspikeletnumberwiththegeneticbackgroundofanindica ricevarietyIR64(OryzasativaL.).BreedSci62(1):18–26（FujitaD,TagleAG,EbronLA,FukutaY, KobayashiN(2012)带有多穗粒数QTL的籼稻品种IR64背景近等基因系的鉴定.育种科学， 62(1):18–26）；
8.HuangJ,CheS,JinL,etal..2011,Thephysiologicalmechanismofadroopingleaf2 mutationinrice.PlantScience,180:757-765（HuangJ,CheS,JinL,etal..2011,水稻披叶突变体 dl2的生理机制.植物科学,180:757-765）；
9.Khush,G.S..1990,Varietalneedsfordifferentenvironmentsandbreedingstrategies （Khush,G.S..1990,不同环境的品种需求和育种策略）；
10.MuraliharanKS,SiddiqEA.Newfrontiersinriceresearch.Directorateofriceresearch, Hyderabad,India,68-75（MuraliharanKS,SiddiqEA.水稻研究前沿，印度海得拉巴水稻研究 理事会，68-75.）；
11.Ken-ichiroHibara,MariObara,EmiHayashida.etal.2009,TheADAXIALIZEDLEAF1 genefunctionsinleafandembryonicpatternformationinrice.DevelopmentalBiology,(334): 345-354（Ken-ichiroHibara,MariObara,EmiHayashida.etal.2009,近轴面基因ADL1基因在 水稻叶片和胚胎模式形成中的功能研究.发育生物学,(334):345-354）；
12.LiangpingZou,XuehuiSun,ZhiguoZhang,2011.LeafRollingControlledbythe HomeodomainLeucineZipperClassGeneRoc5inRice.PlantPhysiology,156(3):1589-1602 （LiangpingZou,XuehuiSun,ZhiguoZhang,2011.水稻异亮氨酸拉链结构IV基因Roc5对卷叶 调控。植物生理学,156(3):1589-1602）；
13.LingLi,Zhen-YingShi,LinLi,etal.2010,OverexpressionofACL1increasedbulliform cellsandinducedabaxialcurlingofleafbladesinrice.MolecularPlant,3(5):807-817（LingLi, Zhen-YingShi,LinLi,etal.2010,通过ACL1基因过表达增加水稻泡状细胞形成叶片反向卷 曲。分子植物,3(5):807-817）；
14.QiJ,etal.(2008)MutationofthericeNarrowleaf1gene,whichencodesanovelprotein, affectsveinpatterningandpolarauxintransport.PlantPhysiol147(4):1947–1959（QiJ,etal.(2008) 水稻窄叶突变基因Nal1通过编码主效蛋白影响叶脉发育和生长素极性运输。植物生理学, 147(4):1947–1959）；
15.ShiZ.Y.,WangJ.,WanX.S.,ShenG.Z.,WangX.Q.,andZhangJ.L.,2007, Over-expressionofriceOsAGO7geneinducesupwardcurlingoftheleafbladethatenhanced erect-leafhabit,Planta,226:99-108（ShiZ.Y.,WangJ.,WanX.S.,ShenG.Z.,WangX.Q.,and ZhangJ.L.,2007,OsAGO7基因过表达导致叶片正卷直立。植物，226:99-108）；
16.Shu-QingZhao,JiangHu,Long-BiaoGuo,QianQian,Hong-WeiXue.2010,Riceleaf inclination2,aVIN3-likeprotein,regulatesleafanglethroughmodulatingcelldivisionofthecollar. CellResearch,20:935-947（Shu-QingZhao,JiangHu,Long-BiaoGuo,QianQian,Hong-WeiXue. 2010,水稻叶倾角基因LC2通过编码VIN3类似蛋白调控叶枕细胞分裂改变叶片角度。细胞研 究，20:935-947）；
17.YoshidaS.,1981,Grownanddevelopmentofthericeplant,Infundamentalsofricecrop science,Philippines:IRRI,LosBanos,1-61（YoshidaS.,1981,水稻生长与发育。水稻作物学基 础，菲律宾国际水稻研究所,LosBanos,1-61）；
18.YamaguchiT,NagasawaN,KawasakiS,etal.2004,TheYABBYgeneDROOPINGLEAF regulatescarpelspecificationandmidribdevelopmentinrice[J].PlantCell,16:500-509 （YamaguchiT,NagasawaN,KawasakiS,etal.2004,YABBY家族基因DL1调控水稻心皮和叶脉 发育。植物细胞，16:500-509）；
19.ZhangG.H.,XuQ.,QianQ.,ZhuX.D.,andXueH.W.,2009,SHALLOT-LIKE1Isa KANADITranscriptionFactorThatModulatesRiceLeafRollingbyRegulatingLeafAbaxialCell Development,PlantCell,21:719-735（ZhangG.H.,XuQ.,QianQ.,ZhuX.D.,andXueH.W., 2009,转录因子SLL1通过水稻叶片近轴面细胞发育调节叶片卷曲度。植物细胞，21:719-735）。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻剑叶宽度调控基因NAL1有关的分子标记及 其开发方法和用途，本发明所得的分子标记NAL1-NarI为水稻剑叶宽度调控基因NAL1的基因 标记，能用于水稻剑叶形态的辅助选择育种。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种与水稻剑叶宽度调控基因NAL1的基因标记，以 水稻作为物种，该分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′：
NAL1-NarI正向（F）：CCCTCTATTCATTTGCATTCATC；
反向（R）：GGCTGTCCACAATGACAATAAA；
本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤：
1）、以粳稻品种日本晴作为宽叶基因供体亲本与籼稻高产品种93-11进行杂交、回交和自 交，从而获得作为后代的宽剑叶水稻单株（即，从而获得作为杂交后代的水稻剑叶宽度较93-11 增加的宽叶单株）；
2）、用CTAB（十六烷基三乙基溴化铵，HexadecyltrimethylammoniumBromide）法提取 水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA；
3）、采用CAPS（揭示的是特异PGR片段的限制性长度变异的信息）分子标记方法进行水 稻剑叶宽度基因标记的筛选；
4）、开发出一个CAPS分子标记NAL1-NarI。
本发明还同时提供了上述分子标记NAL1-NarI的用途：用于水稻宽剑叶株系/或其后代辅 助选择育种。
作为本发明的分子标记NAL1-NarI的用途的改进：当筛选日本晴和籼稻93-11的后代时， 选择后代中带型与日本晴带型一致的单株用于育种。
与水稻剑叶宽度有关的分子标记NAL1-NarI，具体是用下述方法得到的：
1）、根据基因NAL1的核苷酸序列，设计、开发CAPS分子标记，用于检测日本晴和93-11 间剑叶宽度调控基因的多态性；通过测序以进一步确定引物（分子标记）NAL1-NarI区间的 序列在宽叶基因供体日本晴和93-11等位基因之间的差异；通过杂交、回交和自交结合标记 辅助选择，获得93-11背景的宽叶水稻新种质；
即，通过测序检测出两亲本的基因序列内部在分子标记限定的片段上存在差异；
2）、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组DNA；
3）、采用CAPS分子标记方法进行水稻剑叶宽度调控基因标记筛选宽叶的水稻新种质；
4）、鉴定出一个CAPS分子标记NAL1-NarI，经多态性检测，发现其与水稻剑叶宽度相 关联。利用该标记可以用来鉴定水稻叶片宽度。
采用CAPS分子标记NAL1-NarI进行水稻剑叶宽度筛选的方法具体是：
(1)、CAPS标记在不同剑叶宽度品种日本晴和93-11间的DNA多态性分析：
根据基因NAL1的核苷酸序列，设计、开发CAPS分子标记NAL1-NarI，用于检测日本 晴和93-11之间剑叶宽度的多态性。备注说明：引物（分子标记）可委托上海申能博彩公司 合成，在PTC-225PCR仪上进行PCR扩增。
PCR反应体系为：20ng/ul水稻基因组DNA1ul,10×PCRBuffer2.0ul,25mMMgCl22.0ul, 2mMdNTP2.0ul,10uM正反向引物各1.0ul,5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2O10.8ul，总体 系20ul。
反应程序：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40 个循环；72℃补齐10分钟；产物检测：在含有0.5％ug/ulEB的2.0％的琼脂糖凝胶电泳， 紫外灯下观察并照相记录结果。
(2)、CAPS标记NAL1-NarI的序列区间在不同叶宽的日本晴和93-11间的基因组序列 差异：
根据获得的CAPS分子标记NAL1-NarI，用于PCR扩增不同叶宽的日本晴和93-11间的 基因组序列，PCR扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序分析。PCR扩增参照上 述(1)进行，PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的PCR产物回收试剂盒 （离心柱型，目录号：DP1403）。
（3）、利用CAPS分子标记NAL1-NarI开展宽叶水稻的辅助选择育种：
宽叶基因供体亲本日本晴，与93-11进行杂交，通过回交、自交结合标记辅助选择，将 日本晴的宽叶基因NAL1导入到93-11中，选择分离群体中带型与日本晴带型一致的单株用 于育种改良，获得了若干份93-11背景的带日本晴NAL1基因的材料在齐穗期检测剑叶宽度， 发现其剑叶宽度比93-11显著增加。
水稻叶宽是水稻剑叶形态的重要指标，是理想株型的重要组成部分。本发明采用分子生 物学方法以带有宽叶基因的日本晴为材料，发展和筛选新的、而且稳定的能增加水稻剑叶宽 度的分子标记及其方法，用于理想株型的辅助选择育种；由于研究所用的材料宽叶基因能增 加籼稻背景的剑叶宽度，其对我国水稻叶形改良和理想株型的分子设计育种具有普遍性。
本发明创造了水稻剑叶宽度调控基因NAL1的CAPS标记NAL1-NarI。利用这种方法， 不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，可以有目标地将日本晴的宽叶基因NAL1 在实验室内选择获得并有目的地进行多个理想株型基因的聚合，从而培育出具有理想株型的 水稻新品种。在本发明中，当所得植株经检测出现日本晴的条带时，我们判定其属于宽叶水 稻；当所得植株经检测出现93-11的条带或同时出现特青+日本晴的条带时，我们判定其属于 窄叶的水稻。
本发明可适用大部分的籼稻（如93-11）和粳稻（如日本晴）之间的标记选择。
因此，本发明结果在水稻理想株型育种实践中具有重要意义。其优点具体归纳如下：
（1）本发明的能调控水稻剑叶宽度调控基因NAL1分子标记，是在通过含宽叶基因的 粳稻日本晴与籼稻93-11的杂交、回交中筛选获得的，能显著增加剑叶宽度，而且稳定存在， 可用于宽叶水稻理想株型的辅助选择育种。
（2）本发明依据的是水稻剑叶宽度调控基因NAL1的核苷酸序列发展而获得的CAPS 分子标记，极大提高了辅助选择的效率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是CAPS标记NAL1-NarI在粳稻日本晴、籼稻93-11、F1的电泳谱带图；
其中，图1-1是未经NarI酶切前CAPS标记NAL1-NarI扩增片段；图1-2是CAPS标 记NAL1-NarI扩增片段用NarI酶切后的片段多态性。
图2是引物NAL1-NarI的PCR扩增产物在日本晴和特青间的NarI酶切序列差异；
图2-1是CAPS分子标记NAL1-NarI日本晴扩增片段序列及NarI酶切差异位点；
图2-2是CAPS分子标记NAL1-NarI93-11扩增片段序列及NarI酶切差异位点；
图2-3是93-11的CAPS分子标记NAL1-NarI扩增片段NarI酶切后片段大小。
图3是CAPS标记NAL1-NarI鉴定获得的13份日本晴和93-11杂交后用93-11连续回交 后不同株系的电泳谱带图（不同叶片宽度的后代选择单株及其CAPS标记NAL1-NarI多态 性）；
其中，图3-1是不同株系的未经NarI酶切前CAPS标记NAL1-NarI扩增片段；图3-2 是不同株系的CAPS标记NAL1-NarI扩增片段用NarI酶切后的片段多态性；
注:NPB-日本晴;WL-宽叶单株；NL-窄叶纯合单株;NF-窄叶杂合单株。
图4是CAPS标记NAL1-NarI辅助选育的13份材料在齐穗期的叶宽数据（）不同NarI 酶切带型的后代单株剑叶宽度；
注:WL-宽叶单株；NL-窄叶纯合单株；NF-窄叶杂合单株。
对上述图1～4中符号分别作如下说明：
NPB代表：宽叶基因供体亲本的粳稻日本晴；
93-11代表：宽叶基因供体亲本籼稻93-11；
F1代表：日本晴/93-11的F1植株；
WL代表：日本晴和93-11杂交F1代，连续用93-11回交后代，经CAPS标记NAL1-NarI 筛选后获得宽叶基因纯合植株；
NL代表：日本晴和93-11杂交F1代，连续用93-11回交后代，经CAPS标记NAL1-NarI 筛选后获得窄叶基因纯合植株；
NF代表：日本晴和93-11杂交F1代，连续用93-11回交后代，经CAPS标记NAL1-NarI 筛选后获得窄叶杂合植株。
具体实施方式
实施例1、用CAPS标记NAL1-NarI鉴定粳稻日本晴和籼稻93-11的多态性
具体做法是：从中国水稻研究所种质资源库中选取水稻材料日本晴和93-11，用日本晴和 93-11杂交获得其F1，利用引物CAPS标记NAL1-NarI扩增并用NarI酶切鉴定其多态性（图 1）。
一、提取DNA
1）、配制DNA提取缓冲液：
按顺序依次加1体积的DNA提取溶液（0.35Msorbitol;0.1MTris,pH8.2;0.005MEDTA； 其余为水），1体积的核裂解液（0.2MTris,pH7.5;0.05MEDTA;2MNaCl;0.055MCTAB； 其余为水）和0.4体积的5％（质量浓度）sarkosyl溶液（即十二酰-N-甲基甘氨酸钠的水溶 液）；最后加入亚硫酸氢钠，配制成DNA提取缓冲液；亚硫酸氢钠在DNA提取缓冲液中的 终浓度为0.02M。
上述DNA提取溶液的制备方法为：在0.35mol的sorbitol（山梨糖醇）、0.1mol的Tris（三 羟甲基氨基甲烷，pH8.2）、0.005mol的EDTA（乙二胺四乙酸）加水定容至1L。
上述核裂解液的制备方法为：在0.2mol的Tris（三羟甲基氨基甲烷，pH7.5）、0.05mol 的EDTA（乙二胺四乙酸）、2mol的NaCl（氯化钠）、0.055mol的CTAB（十六烷基三甲基溴 化铵）加水定容至1L。
2）、对上述日本晴、93-11、F1（日本晴和93-11杂交一代）的水稻剑叶分别进行如下处 理：）
①、称取0.1g的水稻剑叶用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的上述步骤1）配制的 DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。再加700μl的氯仿:异戊醇（24:1的体积比），并混匀。 10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷（至4℃）的异丙醇，轻轻 混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。
③、再用70％（体积%）的已醇200μl洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。
④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μlTE缓冲液或纯水中。
⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳 检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获 得完整的DNA。
二、PCR扩增
1）、反应体系：
水稻基因组DNA20ng/ul1ul，10×PCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul， 10uM正反向引物各1.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2O10.8ul，总体系20ul。
NAL1-NarI正向（F）：CCCTCTATTCATTTGCATTCATC；
反向（R）：GGCTGTCCACAATGACAATAAA；
2）、反应程序：
95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72 ℃补齐10分钟。
三、电泳检测及回收
1）电泳检测：
取扩增产物20ul，用2.0％的琼脂糖凝胶（含有0.5％ug/ulEB）电泳，紫外灯下观察并 照相记录结果。如图1-1所示。
在图1-1中，日本晴、93-11和日本晴与93-11杂交获得的F1均为607bp的条带。
2）PCR产物回收：
PCR产物（607bp的目标条带）的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的PCR产 物回收试剂盒（离心柱型，目录号：DP1403），参照产品说明要求进行。
四、NarI酶切反应及酶切产物电泳检测：
1）、NarI酶切反应体系：
取PCR回收产物10ul（20ng/ul），10×PCRNEBuffer2.0ul(美国NEB公司生产，型号： B7001S)，限制性内切酶NarI1.0ul（5U/ul；美国NEB公司生产，型号：SR0191S），ddH2O 7.0ul，总体系20ul。在37℃的水浴锅中酶切2小时。
2）、酶切产物电泳检测：
取酶切产物20ul，用2.0％的琼脂糖凝胶（含有0.5％ug/ulEB）电泳，紫外灯下观察并 照相记录结果。如图1-2所示。
根据图1，我们能得出下述结论：CAPS分子标记NAL1-NarI能够检测93-11和日本晴 之间的多态性，日本晴的PCR扩增产物片段不能被限制性内切酶NarI酶切，酶切后只含已 个607片段；而93-11的PCR扩增产物片段含有限制性内切酶NarI识别位点，能被NarI酶 切为212bp和395bp大小的两个片段。由此表明CAPS分子标记NAL1-NarI能用于93-11和 日本晴之间的分子检测及其后代的标记辅助选择。
实施例2、用CAPS分子标记NAL1-NarI鉴定含宽叶基因的粳稻日本晴和窄叶基因93-11 的序列差异
具体做法是：应用CAPS分子标记NAL1-NarI对日本晴和93-11的基因组DNA进行PCR 扩增，扩增产物及扩增产物的NarI酶切后产物均委托上海英骏生物技术有限公司进行测序， 比较其序列的差异（图2）。
一、提取DNA
同实施例1。
二、PCR扩增
同实施例1。
三、电泳检测、回收及测序
电泳检测、回收同实施例1；回收的PCR产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序， 测序结果见图2-1和2-2。
四、NarI酶切反应及酶切产物电泳检测
同实施例1。
五、NarI酶切片段回收及测序
1个日本晴和2个93-11NarI酶切产物电泳后各片段分别回收（同实施例1）；回收的PCR 产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序。日本晴扩增片段酶切前后序列大小一致；而 93-11被NarI酶切为212bp和395bp大小的两个片段（图2-3）。
根据图2，我们能得出以下结论：日本晴和93-11的CAPS分子标记NAL1-NarI扩增产 物存在单碱基差异（如图2-1和图2-2方框所示），这是我们能够使用CAPS分子标记NAL1-Nar I检测出其多态性的原因所在，该差异正位于限制性内切酶NarI识别位点（GG/CGCC）上（如 图2-1和图2-2方框所示）。日本晴方框中的序列GGTGCC不能被限制性内切酶NarI所识别， 而93-11方框中的序列GGCGCC能被所识别，也就是说日本晴的CAPS分子标记NAL1-NarI 扩增片段不能被限制性内切酶NarI酶切，而93-11的CAPS分子标记NAL1-NarI扩增片段 则能被限制性内切酶NarI酶切为两个大小不等的片段。这正是我们能用于其后代标记辅助选 择的遗传基础。
实施例3、利用CAPS分子标记NAL1-NarI开展宽叶水稻的辅助选择育种
具体做法是：含宽叶基因的供体亲本日本晴，与籼稻品种93-11依次进行杂交、回交和 自交，对所得后代结合CAPS分子标记NAL1-NarI的辅助选择，选择分离群体中带型与日本 晴带型一致的单株用于剑叶宽度的育种改良。
一、提取DNA
同实施例1。
二、PCR扩增
同实施例1。
三、电泳检测及回收
同实施例1。
四、NarI酶切反应及酶切产物电泳检测
同实施例1。
五、CAPS分子标记NAL1-NarI开展宽叶的辅助选择育种
宽叶基因的供体粳稻品种日本晴与普通籼稻品种93-11进行杂交、回交和自交，结合 CAPS分子标记NAL1-NarI的辅助选择，选择分离群体中带型与日本晴带型一致的单株（WL） 进一步用于育种改良（图3-2），淘汰带型与93-11的带型一致和同时具有日本晴和93-11带 型的个体（NL和NF单株），育种材料的剑叶宽度根据齐穗期剑叶的平均宽度进行检测。
分析表明，所选择的带日本晴带型的8个单株均比轮回亲本93-11及杂合带型的单株剑 叶宽度明显增加（图4）。该实验结果表明：CAPS分子标记NAL1-NarI可以用于水稻剑叶宽 度的辅助选择育种。
备注说明：
图3和图4中的“WL、NL和NF”均为日本晴和93-11依次进行杂交、回交和自交获得 的，选择了代表三种不同带型的单株与其剑叶宽度进行比较验证。
对比例1、利用CAPS分子标记NAL1-NarI判别水稻剑叶宽度
具体做法是：将实施例3中被淘汰的带型，即与93-11的带型一致和杂合带型（同时具 有日本晴和93-11带型）的个体继续进行种植，通过对其后代在齐穗期时剑叶的剑叶宽度进 行测定，进一步分析CAPS分子标记NAL1-NarI辅助选择的可靠性。
一、提取DNA
同实施例1。
二、PCR扩增
同实施例1。
三、电泳检测及回收
同实施例1。
四、NarI酶切反应及酶切产物电泳检测
同实施例1。
五、CAPS分子标记NAL1-NarI判别水稻剑叶宽度
随机选择了在实施例3中被淘汰3个带型与93-11一致的单株NL-1、NL-2和NL-3继续 种植，经CAPS分子标记NAL1-NarI检测，其后代均表现与93-11一致的带型，分别收获这 些单株齐穗期时的剑叶宽度。另外，随机选择其中1个杂合带型（H—同时具有日本晴和93-11 带型）的个体NF-2用于继续种植，在其后代中随机选取16个单株，CAPS分子标记NAL1-Nar I检测表明，该16个单株中有4个单株表现93-11带型（Y），8个单株表现杂合带型（H），4 个表现日本晴带型（N），符合1:2:1的分离关系；待植株齐穗后，分别检测这些单株的剑叶 宽度。表1是这19个单株（株系）的剑叶平均宽度，3个与93-11带型一致的单株均表现与 93-11的剑叶宽度；而在带型杂合NF-2的16个后代单株中，有12个单株表现类似与93-11 的剑叶宽度（其中，4个单株的带型表现93-11带型，8个单株的带型表现杂合带型）；4个呈 日本晴带型的单株，其剑叶平均宽度显著高于93-11。该实验结果表明：CAPS分子标记 NAL1-NarI可以用于判别93-11和日本晴杂交后代的剑叶宽度。
表1.水稻剑叶平均宽度及其对应的基因型
注：括号中字母代表该单株的基因型，N为日本晴带型Y为93-11带型，H为杂合带型。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110>中国水稻研究所
<120>水稻剑叶宽度调控基因NAL1分子标记及其应用
<160>2
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NAL1-NarI正向引物
<400>1
ccctctattcatttgcattcatc23
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>NAL1-NarI反向引物
<400>2
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