一种高专一性的测定小RNA的方法.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110054104.7 (22)申请日 2011.03.08 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 生元科技有限公司 地址 中国香港德辅道中249253号东宁大 厦 9 楼 (72)发明人 谭若颖 吴鸿菲 龚祖埙 丁航海 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限 公司 31266 代理人 祝莲君 雷芳 WO 2008092016 A2,2008.07.31, Mao F et al.Characterization of EvaGreen and the implica

2、tion of its physicochemical properties for qPCR applications.BMC Biotechnology .2007, 第 7 卷 ( 第 76 期 ), Shi R et al.Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR.BioTechniques .2005, 第 39 卷 ( 第 4 期 ), (54) 发明名称 一种高专一性的测定小 RNA 的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种高专一性测定小 RNA 的方 法。具体地， 本发明方法包括步骤 ：

3、(a) 在小 RNA 的 3 端添加 polyA 尾 ； (b) 加入与所述的小 RNA 的 polyA 尾部互补或基本互补的引物， 进行退火 ； (c) 对小 RNA 进行反转录， 形成 cDNA ； (d) 在含 有 EvaGreen 荧光染料的 PCR 反应体系中， 对所述 cDNA 进行 PCR 扩增， 从而形成双链 DNA-EvaGreen 荧光染料复合物， 以及通过检测扩增产物来确定 待检测的小 RNA 的存在与否和 / 或数量。和现有 的定量检测小 RNA 的方法相比， 本发明方法可显 著提高检测小 RNA( 包括非编码 RNA) 的专一性。 (51)Int.Cl. (56)对比

4、文件 审查员 张艳青 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书10页 序列表7页 附图3页 CN 102676637 B 2016.02.03 CN 102676637 B 1/2 页 2 1.一种检测小 RNA 的方法， 其特征在于， 所述的方法包括步骤 ： (a) 对于待检测的小 RNA 样品， 在小 RNA 的 3 端添加 polyA 尾 ； (b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物， 从而使所述引物与添加 了 polyA 尾的小 RNA 进行退火 ； (c) 反转录所述的添加了 polyA 尾的小 RNA， 形成 cDNA ；

5、 (d)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物， 在含有EvaGreen荧光染料的PCR反 应体系中， 对所述 cDNA 进行 PCR 扩增， 从而形成双链 DNA-EvaGreen 荧光染料复合物， 并且 在扩增过程之中或扩增过程之后， 检测扩增产物的有无和 / 或数量， 从而确定待检测的小 RNA 的存在与否和 / 或数量 ； 其中， 所述的正向引物具有以下特征 ： (i) 正向引物的 3 端序列为与待检测的小 RNA 的 5 端序列相同或基本相同， 并且 3 端序列与 cDNA 的 Tm 值为 45-65 ； (ii) 正向引物的 5 端序列使得整个正向引物与 cDNA 的 Tm 值

6、为 45-75 ； 和 (iii) 正向引物的长度为 8-50bp ； 并且， 所述的反向引物具有以下特征 ： (i) 反向引物的 3 端具有与待检测的小 RNA 的 3 端序列互补的、 长度为 0-15 个碱基 的第一互补区 ； (ii) 反向引物的中间序列为长度为 8-30 个碱基的 polyT ； (iii) 反向引物的 5 端序列使得整个反向引物与 cDNA 的 Tm 值为 45-75 ； 和 (iv) 反向引物的长度为 12-50bp。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤(d)中， 通过检测EvaGreen染料的荧 光值， 来确定扩增产物的有无或数量。 3.如权利要求

7、 1 所述的方法， 其特征在于， 在步骤 (a)， 所述的添加 PolyA 尾是通过在 Ploy(A) 聚合酶的催化下， 在小 RNA 的 3 端聚合加上 AMP， 从而形成 polyA 尾。 4.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的小 RNA 是非编码 RNA。 5.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的待检测样本选自下组 ： 动物样品、 食 物、 饲料、 和药物。 6.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的待检测的小RNA样品是从待检测样本 中抽提出的 RNA。 7.如权利要求6所述的方法， 其特征在于， 在所述的反应体系中， EvaGreen荧光染料在

8、475 纳米的光密度值在 0.01 到 2 之间。 8.如权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述的抽提出的 RNA 是从含有或不含小 RNA 的样品中抽提出的总 RNA。 9.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的检测包括定性检测和定量检测。 10.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的检测包括通过对荧光强度的检测来 达到定量检测小 RNA。 11.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的待检测样本选自下组 ： 体液、 乳制 品、 蔬菜、 肉类、 肉制品、 或水。 12.一种获取待检测样本中非编码 RNA 信息的方法， 其特征在于， 包括步骤 ： 权

9、利 要 求 书 CN 102676637 B 2 2/2 页 3 (a) 从所述的待检测样本抽提含有所述非编码 RNA 的 RNA 样品 ； (b) 对于步骤 (a) 抽提出的 RNA， 在非编码 RNA 的 3 端添加 polyA 尾 ； (c) 加入与所述的非编码 RNA 的 polyA 尾部互补的引物， 从而使得所述引物与带 polyA 的非编码 RNA 进行退火 ； (d) 反转录所述的含 polyA 尾的非编码 RNA， 形成 cDNA ； (e)使用与所述cDNA互补的正向引物和反向引物， 在含有EvaGreen荧光染料的PCR反 应体系中， 对所述 cDNA 进行 PCR 扩增，

10、 从而形成双链 DNA-EvaGreen 荧光染料复合物 ； 并且 在扩增过程之中或扩增过程之后， 检测扩增产物的有无和 / 或数量， 从而获得所述非编码 RNA 的信息， 其中所述信息包括所述非编码 RNA 是否存在于所述样品中以及存在的数量 ； 其中， 所述的正向引物具有以下特征 ： (i) 正向引物的 3 端序列为与待检测的小 RNA 的 5 端序列相同或基本相同， 并且 3 端序列与 cDNA 的 Tm 值为 45-65 ； (ii) 正向引物的 5 端序列使得整个正向引物与 cDNA 的 Tm 值为 45-75 ； 和 (iii) 正向引物的长度为 8-50bp ； 并且， 所述的反

11、向引物具有以下特征 ： (i) 反向引物的 3 端具有与待检测的小 RNA 的 3 端序列互补的、 长度为 0-15 个碱基 的第一互补区 ； (ii) 反向引物的中间序列为长度为 8-30 个碱基的 polyT ； (iii) 反向引物的 5 端序列使得整个反向引物与 cDNA 的 Tm 值为 45-75 ； 和 (iv) 反向引物的长度为 12-50bp。 13.如权利要求 12 所述的方法， 其特征在于， 所述的检测采用检测 EvaGreen 实时荧光 变化的实时荧光定量 PCR 法。 权 利 要 求 书 CN 102676637 B 3 1/10 页 4 一种高专一性的测定小 RNA

12、的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医学、 基因工程和检测领域， 更具体地涉及一种高专一性的测定 小 RNA 的方法， 该方法可应用于检测非编码 RNA， 从而对某些疾病的情况或状态进行描述。 背景技术 0002 MicroRNAs(小RNA)是一类新发现的非编码RNA， 它通过序列专一性地结合到和它 互补反义的 mRNA 的 3 非编码区 (3 s UTR) 来调控某个或某些目标 mRNA 转录及稳定性。 0003 大多数小 RNA， 如 let-7RNA， miR-1， miR-34， miR-60 及 miR-87 在无脊椎动物及脊 椎动物中均是高度保守的。这说明它们能识别多个位点

13、及 ( 或 ) 多个保守功能的基因的靶 序列。 0004 通过对秀丽线虫基因组的分析， 发现了另一种小 RNA 的亚型 - 小时序 RNA(stRNA， 如 lin-4 和 let-7)。stRNA 在调控发育过程中起到非常重要的作用， 例如 ： 神经元再生、 Dauer 幼虫的形成、 外阴形成以及下皮细胞的终极分化。 0005 小 RNA 通常由 60 70 个核苷酸的 RNA 前体折叠、 剪切而成。一些小 RNA 一经表 达即可被检测到， 而一些则仅在表达峰值时才可被检测到。 0006 可能由于小 RNA 前体在其结合蛋白的保护下， 使其不易被降解， 因此通常只有一 个发卡结构的链被剪切下

14、， 并积累起来。推测这些结合蛋白可以调节小 RNA 的转录抑制作 用。小 RNA 的前体在 Dicer RNAse III 及 Argonaute 家族的酶的参与反应后才能形成成熟 的小 RNA。 0007 小 RNA 在生长、 分裂、 分化、 发育、 凋亡及疾病的发生等众多生物学活动中起着极 其重要的作用。 迄今为止， 在人的细胞里， 已发现了1200多种小RNA(http:/www.mirbase. org/)， 这些小 RNA 参与调控了至少 60人类基因。 0008 小 RNA 是肿瘤分类、 疾病诊断、 预测及评估预后情况的重要生物学标记。血清或血 浆中的与肿瘤相关小 RNA 已作为肿

15、瘤诊断的生物学标记。小 RNA 的检测及定量是某些靶基 因及通路的发现、 疾病机理的研究、 药物安全性及功效的评估、 疾病诊断及预后评估的重要 工具。因此， 能够确定各种小 RNA 在特定细胞中的数量是相当重要的。 0009 在一些情况下， 小 RNA 的定量测定显得尤为重要。比如， 比较不同组织中的小 RNA 的含量， 比较外因刺激前后 ( 物理或化学治疗 ) 组织中小 RNA 的量的变化。由于序列相似 的小 RNA 家族在同一细胞中均会存在， 因此能否有个灵敏度高， 又具备专一性好的检测方 法显得尤为重要。 再者， 如果能有应用于高通量筛选样品的的方法如均质法、 多重法那就再 好不过了。

16、0010 现今， 已有多种的小 RNA 定量分析方法面世， 其中包括小 RNA 芯片矩阵， 基于 SYBR-Green I的小RNA定量反转录PCR法(Raymond， C.K.， Roberts， B.S.， Garrett-Engele， P.， Lim， L.P.， and Johnson， J.M.(2005)Simple， quantitative primer-extensionPCR assay for direct monitoring ofmicroRNAsand short-interfering RNAs.RNA 11， )， 基 于茎状环形的 Taqman 法 (Che

17、n C， Ridzon DA， Broomer AJ， Zhou Z， Lee DH， Nguyen JT， 说 明 书 CN 102676637 B 4 2/10 页 5 BarbisinM， Xu NL， Mahuvakar VR， Andersen MR， Lao KQ， Livak KJ， Guegler KJ.2005. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.NucleicAcids Res 33(20) ： e179)， 微珠法及高通量测序等。 0011 然而， 以上所及的所有方法都各有缺陷。例如， 基于

18、杂交的测定法 ( 微矩阵或微 珠)灵敏度及专一性均不理想 ； 基于SYBR-Green I的方法背景高， 专一性差 ； 使用茎状环形 的 Taqman 法专一性虽不太差， 但价格昂贵， 费工费时， 且有偏差， 难于应用于高通量筛选。 0012 EvaGreen是一种双链DNA绑定染料。 它对PCR反应抑制低、 溶解曲线佳、 光稳定性 和热稳定性高， 且不诱变， 无细胞毒性。 EvaGreen被应用于荧光定量PCR和溶解曲线的测定 (Mao F， Leung WY， Xin X.2007.Characterization ofEvaGreen and the implication of its

19、 physicochemical properties for qPCRapplicatiohs.BMC Biotechnol.9 ； 7 ： 76.)。 0013 虽然 BioRad， Qiagen， Agilent 等公司均有基于 EvaGreen 的 PCR 反应液销售， 且许 多实验室也有使用自配的基于 EvaGreen 的反应液的报道， 但没有报道或暗示过 EvaGreen 可提高反应专一性。 0014 综上所述， 目前本领域尚缺乏高灵敏度、 高专一性且价格低廉的检测小 RNA 的方 法。 发明内容 0015 本发明的目的就是提供一种高灵敏度、 高专一性且价格低廉的检测小 RNA 的

20、方 法。 0016 在本发明的第一方面， 提供了一种检测小 RNA 的方法， 所述的方法包括步骤 ： 0017 (a) 对于待检测的小 RNA 样品， 在小 RNA 的 3 端添加 polyA 尾 ； 0018 (b)加入与所述的小RNA的polyA尾部互补或基本互补的引物， 从而使所述引物与 添加了 polyA 尾的小 RNA 进行退火 ； 0019 (c) 反转录所述的添加了 polyA 尾的小 RNA， 形成 cDNA ； 0020 (d) 使用与所述 cDNA 互补的正向引物和反向引物， 在含有 EvaGreen 荧光染料的 PCR反应体系中， 对所述cDNA进行PCR扩增， 从而形成

21、双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物， 并且在扩增过程之中或扩增过程之后， 检测扩增产物的有无和 / 或数量， 从而确定待检测 的小 RNA 的存在与否和 / 或数量。 0021 在另一优选例中， 所述的检测包括定性检测和定量检测。 0022 在另一优选例中， 所述的检测包括通过对荧光强度的检测来达到定量检测小 RNA。 0023 在另一优选例中， 所述的待检测的小 RNA 样品是从待检测样本中抽提出的 RNA。 0024 在另一优选例中， 所述的抽提出的 RNA 是从含有或不含小 RNA 的样品中抽提出的 总 RNA。 0025 在另一优选例中， 在步骤(d)中， 通过检测EvaGre

22、en染料的荧光值， 来确定扩增产 物的有无或数量。 0026 在另一优选例中， 所述的正向引物具有以下特征 ： 0027 (i) 正向引物的 3 端序列为与待检测的小 RNA 的 5 端序列相同或基本相同， 并且 3 端序列与 cDNA 的 Tm 值为 45-65 ； 0028 (ii) 正向引物的 5 端序列使得整个正向引物与 cDNA 的 Tm 值为 45-75 ； 和 说 明 书 CN 102676637 B 5 3/10 页 6 0029 (iii) 正向引物的长度为 8-50bp。 0030 在另一优选例中， 所述的反向引物具有以下特征 ： 0031 (i) 反向引物的 3 端具有与

23、待检测的小 RNA 的 3 端序列互补的、 长度为 0-15 个 碱基的第一互补区 ； 0032 (ii) 反向引物的中间序列为长度为 8-30 个碱基的 polyT ； 0033 (iii) 反向引物的 5 端序列使得整个反向引物与 cDNA 的 Tm 值为 45-75 ； 和 0034 (iv) 反向引物的长度为 12-50bp。 0035 在另一优选例中， 所述的待检测样本选自下组 ： 动物样品、 食物、 饲料、 和药物。 0036 在另一优选例中， 所述的待检测样本选自下组 ： 体液、 乳制品、 蔬菜、 肉类、 肉制品、 或水。 0037 在另一优选例中， 在步骤 (a)， 所述的添加

24、 PolyA 尾是通过在 Ploy(A) 聚合酶的催 化下， 在小 RNA 的 3 端聚合加上 AMP， 从而形成 polyA 尾。 0038 在另一优选例中， polyA 尾具有 8-200 个 A， 较佳地 10-100 个 A， 最佳地 12-50 个 A。 0039 在另一优选例中， 所述的小 RNA 是长度 15 200 个核甘酸 ( 更佳地， 长度为 18-100bp) 的 RNA 分子。较佳地， 所述的小 RNA 是非编码 RNA。 0040 在另一优选例中， 所述的方法中的 polyA 尾被选自下组的其他 polyN 尾替换 ： poly(C) 尾， 或 poly(G) 尾，

25、或 poly(U) 尾 ； 并且 0041 在步骤 (b) 中， 加入与所述的小 RNA 的 polyN 尾部互补或基本互补的引物， 从而使 所述引物与添加了 polyN 尾的小 RNA 进行退火 ； 和 0042 在步骤 (c) 中， 反转录所述的添加了 polyN 尾的小 RNA， 形成 cDNA。 0043 在本发明的第二方面， 提供了一种提高聚合酶链反应中引物与模板的结合专一性 的方法， 包括步骤 ： 在聚合酶链反应的反应体系中， 添加 EvaGreen 荧光染料。 0044 在另一优选例中， 在所述的反应体系中， EvaGreen 荧光染料在 475 纳米的光密度 值在 0.01 到

26、 2 之间。 0045 在本发明的第三方面， 提供了一种 EvaGreen 荧光染料的用途， 它用作提高聚合酶 链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。 0046 在本发明的第四方面， 提供了一种 EvaGreen 荧光染料的用途， 它用于制备提高聚 合酶链反应中引物与模板的结合专一性的试剂。 0047 在本发明的第五方面， 提供了一种获取待检测样本中非编码 RNA 信息的方法， 包 括步骤 ： 0048 (a) 从所述的待检测样本抽提含有所述非编码 RNA 的 RNA 样品 ； 0049 (b) 对于步骤 (a) 抽提出的 RNA， 在非编码 RNA 的 3 端添加 polyA 尾 ； 005

27、0 (c) 加入与所述的非编码 RNA 的 polyA 尾部互补的引物， 从而使得所述引物与带 polyA 的非编码 RNA 进行退火 ； 0051 (d) 反转录所述的含 polyA 尾的非编码 RNA， 形成 cDNA ； 0052 (e) 使用与所述 cDNA 互补的正向引物和反向引物， 在含有 EvaGreen 荧光染料的 PCR反应体系中， 对所述cDNA进行PCR扩增， 从而形成双链DNA-EvaGreen荧光染料复合物 ； 并且在扩增过程之中或扩增过程之后， 检测扩增产物的有无和 / 或数量， 从而获得所述非 说 明 书 CN 102676637 B 6 4/10 页 7 编码

28、RNA 的信息， 其中所述信息包括所述非编码 RNA 是否存在于所述样品中以及存在的数 量。 0053 在另一优选例中， 所述的检测采用检测 EvaGreen 实时荧光变化的实时荧光定量 PCR 法。 0054 在另一优选例中， 所述的方法中的 polyA 尾被选自下组的其他 polyN 尾替换 ： poly(C) 尾， 或 poly(G) 尾， 或 poly(U) 尾。 0055 在另一优选例中， 利用所获得的非编码RNA的信息， 可用于对检测对象(其中包括 但并不限于 ： 哺乳动物如人 ) 的某种疾病的情况或状态进行描述。该方法尤其适用于以下 情况 ： 0056 a. 在某种疾病的某个阶段

29、， 某个非编码 RNA 的表达量增加 ； 0057 b. 在某种疾病的某个阶段， 某个非编码 RNA 的表达量减小。 0058 上述两种情况包含了多数非编码 RNA 在某种疾病中的表达情况。 0059 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在 此不再一一累述。 附图说明 0060 图 1 显示了 EvaGreen 实时荧光定量法检测小 RNA 的流程。从上至下各步骤依次 是 ： 加 poly(A) 尾 ； RT 引物与 RNA 退火 ； 反转录反应 ； 和使用正向引物和反

30、向引物进行 PCR 扩增。 0061 图 2 显示了本发明一个实例中正向引物的结构。 0062 图 3 显示了本发明一个实例中反向引物的结构。 0063 图 4 显示了 let-7a 模板浓度梯度扩增曲线。 0064 图 5 显示了小 RNA 模板的量与 Cq 值呈线性关系。 0065 图 6 显示了 SYBR Green 荧光定量 PCR 法与 EvaGreen 荧光定量 PCR 法的交叉反应 专一性与灵敏度比较结果。 0066 图 7 显示了含有不同的荧光染料 ： EvaGreen( 通道一 ) 及 SYBR Green( 通道二 ) 对于专一性结合 ( 实线 ) 以及非专一性结合 ( 虚

31、线 ) 的引物与模板结合的影响的融解曲 线。图中， Trace 1( 曲线 1) 是 EvaGreen 和引物与专一性模板结合的荧光值对温度求导的 负数 ； Trace 3( 曲线 3) 是 SYBR Green I 和引物与专一性模板结合的荧光值对温度求导的 负数 ； Trace 2( 曲线 2) 是 EvaGreen 和引物与非专一性模板结合的荧光值对温度求导的负 数 ； Trace 4( 曲线 4) 是 SYBR Green I 和引物与非专一性模板结合的荧光值对温度求导的 负数。 具体实施方式 0067 本发明人经过广泛而深入的研究， 意外地发现， EvaGreen 作为一种 DNA

32、结合染料 居然能够显著提高PCR反应中引物与模板结合的专一性。 具体地， 与不添加另一常用的DNA 结合染料SYBR Green I相比， 虽然两者灵敏度上无明显区别， 但是EvaGreen可以显著提高 反应的专一性， 因此 EvaGreen 特别适用于区分和检测结构差异极小的小分子 RNA。在此基 说 明 书 CN 102676637 B 7 5/10 页 8 础上， 本发明开发了新的高专一性测定小 RNA 的方法。 0068 本发明提供了一种具有优势的小 RNA 检测、 分类及定量的实验方法。本发明的检 测小 RNA 的方法适用于检测 microRNAs( 小 RNAs) 或其他小分子核苷

33、酸， 如 s iRNA。 0069 在此发明中， 提供了一种基于EvaGreen的定量PCR法(尤其是实时定量PCR法)， 它适用于定量检测小 RNA。基于 EvaGreen 的定量 PCR 法可以进一步扩展应用于 mRNA 及基 因表达的定量检测。 0070 术语 0071 如本文所用， 术语 “EvaGreen” ，“Eva Green” 或 “EvaGreen 染料” 可互换使用， 指 是 Biotium 公司生产的一种商品名为 EvaGreen 的 DNA 结合染料， 它是一种同时适用于实时 PCR 和高分辨率熔解曲线 (HRM) 分析的染料。这种染料通过一种被称为 “按要求释放” 的

34、全 新机制， 选择性的结合双链 DNA。这一机制保证了较低的 PCR 抑制作用， 同时也允许在染料 饱和浓度以下进行高分辨率熔解曲线 (HRM) 分析。由于 EvaGreen 染料在光谱特性上类似 于FAM以及SYBRGreen I， 因此这种染料兼容所有商业化的qPCR仪器。 此外， 和SYBR Green I 以及 SYBR GreenER 不同的是， EvaGreen 染料非常稳定且无致突变性和细胞毒性。 0072 染料的结构信息在例如美国专利 US7,776,567 中有详细描述。 0073 如本文所用， 术语 “引物” 指的是在与模板配对， 在 DNA 聚合酶的作用下能以其为 起点进

35、行合成与模板互补的 DNA 链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的 RNA、 DNA， 也 可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如 LNA 或 ZNA 等。 0074 引物 “大致上” ( 或 “基本上” ) 与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必 须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸， 但引物的序列不必与模板的序列完全互补。 比如， 在一个 3 端与模板互补的引物的 5 端加上一段与模板不互补的序列， 这样的引物仍 大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合， 非完全互补的引物也可以 与模板形成引物 - 模板复合物， 从而进行扩增。 0075 如本文所

36、用， 术语 “Poly(A) 聚合酶” ， 是指一类酶， 这类酶可以利用 ATP 作为底物， 在 RNA 的 3 羟基末端添加多个到几百个 AMP。Poly(A) 聚合酶可以从原核或真核生物中提 取。由于这类酶的专一性不强， 这类酶可以分别利用 CTP， 或 GTP， 或 UTP 作为底物， 在 RNA 的 3 羟基末端添加多个到几百个 CMP 或 GMP， 或 UMP。如果非编码 RNA 是添加了的 poly(C) 尾， 或是poly(G)尾， 或是poly(U)尾， 在此发明中， 与尾部互补的引物也相应变化。 Poly(U) 聚合酶是和 Poly(A) 聚合酶不同， 但类似的酶。它可以利用

37、 UTP 作为底物， 在 RNA 的 3 羟基 末端添加多个到几百个 UMP。它也可以非特异性地分别利用 ATP， 或 CTP， 或 GTP 作为底物， 在 RNA 的 3 羟基末端添加多个到几百个 AMP 或 CMP， 或 GMP。因此， 在本发明中， Poly(A) 聚 合酶和 Poly(U) 聚合酶有同样的功效。 0076 如本文所用， 术语 “polyA 尾” ， 是本发明第一步中在 RNA 的 3 端添加的寡聚到多 聚 A(AMP， 腺苷酸 )。这个 “polyA 尾” 可用 “polyC 尾” ，“polyG 尾” ，“polyU 尾” 替代。相应 地， 在下一步引入的和尾部互补，

38、 或基本互补的引物的序列也要变化。 “polyA 尾” 也可以通 过 RNA 链接酶 (RNA Ligase) 加上。 0077 现参见图 1， 本发明的一种优选的技术方案包括以下步骤 ： 0078 (1) 从含有或不含小 RNA 的样品中抽提总 RNA。在 Poly(A) 聚合酶的催化下在小 RNA 的 3 端聚合加上 AMP， 使小 RNA 形成一个 polyA 尾。 说 明 书 CN 102676637 B 8 6/10 页 9 0079 (2) 加入与 polyA 互补的引物， 退火。 0080 (3) 在反转录酶的催化下， 反转录小 RNA 使之成为 cDNA。 0081 (4)使用

39、正、 反向引物及含有EvaGreen的荧光染料的PCR反应混合母液对cDNA进 行扩增 0082 (5) 在扩增过程中， 实时检测 EvaGreen 染料的荧光值的变化。 0083 本发明中， 优选的引物结构如图 2 和图 3 所示。 0084 正向引物一般可以分为 2 部分， 3 端部分的引物与模板小 RNA 的 5 端完全互补， 退火温度一般在 45 65 摄氏度之间， 而引物的另一部分 -5 端的附加序列 ( 尾 ) 将整条 引物的退火温度提高到 50 75 摄氏度之间 ( 图 2)。 0085 反向引物则由 3 部分组成 ： 第一部分， 引物的 3 端 0 15 个碱基与小 RNA 的

40、 3 端完全互补 ； 中间部分， 约 10 30 个碱基为 10 30 个 dT， 与小 RNA 加上的 Poly(A) 的尾 互补 ； 第三部分为一个 0 40 碱基的附加序列 ( 尾 )( 图 3)。应理解， 当第三部分为 0 碱 基时， 反向引物可以只有 2 部分构成。 0086 PCR反应的进行需要含有EvaGreen的反应母液。 反应程序可以是常规的2个温度 条件的 ( 如 95 摄氏度变性 ； 60 摄氏度退火及延伸 ) 或 3 个反应温度的条件 ( 如 95 摄氏度 变性 ； 50 摄氏度退火及 72 摄氏度延伸 )。反应须在含有镁离子、 dNTP、 及 EvaGreen双 链

41、DNA 绑定染料的缓冲体系中进行。 0087 可用本发明方法检测的小 RNA， 其长度没有特别限制， 通常为 15-200bp， 较佳地为 18-100bp， 更佳地为 19-40bp。 0088 可用本发明方法检测的含小 RNA 的生物学样品没有特别限制。应理解， 生物学样 品是十分广泛的一个概念， 可以是一个或多个细胞， 也可以是样本或培养物 ( 包括微生物 培养物 )， 甚至包括合成来源的样本。通常， 生物样本可以是动物样品， 包括人类样品如体 液、 固体样品如骨骼或组织。 样品也可以是液态或固态食物或饲料及药物， 如乳制品、 蔬菜、 肉类及肉制品、 水等。 样品可以来源于任何家养或野生

42、动物， 如有蹄类、 熊类、 鱼类、 兔类、 啮 齿类等。 0089 应用 0090 小 RNA 的检测及定量是其靶基因及通路的发现、 疾病机理的研究、 药物安全性及 功效的评估、 疾病诊断及预后评估的重要工具。比如， 比较不同组织中的小 RNA 的含量， 比 较外因刺激前后 ( 物理或化学治疗 ) 组织中小 RNA 的量的变化。血清或血浆中小 RNA 也可 作为肿瘤分类、 疾病诊断、 预测及评估预后情况的重要生物学标记。 0091 本发明的主要优点在于 ： 0092 (a) 专一性非常强。 0093 (b) 灵敏度高。 0094 (c) 同时适合高通量筛选和精细筛选。 0095 (d) 重复性

43、高。 0096 (e) 价格便宜。 0097 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件， 例如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor 说 明 书 CN 102676637 B 9 7/10 页 10 Laboratory Press， 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0098 实施例 1 0099 在实时荧光定量 PCR 法中 EvaGreen 具有更高的专一性 0100

44、本发明人试验了 4106， 4105， 4104， 4103， 4102， 40， 4， 以及 0(NTC)(NTC 为 无底物对照 ) 个分子的模板量 (hsa-l et7a， SEQ ID NO ： 1 或表 1)， 使用正向引物 (SEQ ID NO ： 9 或表 1) 及反向引物 (SEQ ID NO ： 10 或表 1) 连同含有 EvaGreen 的 PCR 反应母液进行 实时荧光定量 PCR 反应。 0101 表 1 小 RNA 以及引物序列 0102 名称 SEQ ID No. 序列 (5 -3 ) hsa-let-7a 1 UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU hsa

45、-let-7b 2 UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU hsa-let-7c 3 UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 0103 hsa-let-7d 4 AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU hsa-let-7e 5 UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU hsa-let-7f 6 UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU hsa-let-7g 7 UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU hsa-let-7i 8 UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU let-7a 正向引物 9 CCCCGTGAGGTAGTAGGTTGTATA let-7b

46、正向引物 10 CCGGAGGTAGTAGGTTGTGT let-7c 正向引物 11 GCCGGTAGTAGGTTGTATGGT let-7d 正向引物 12 CCCCAGGTAGTAGGTTGCAT let-7e 正向引物 13 CGGGAGGTAGGAGGTTGTAT let-7f 正向引物 14 CCCCCTGAGGTAGTAGATTGTATAG let-7g 正向引物 15 CCCCGTGAGGTAGTAGTTTGTAC let-7i 正向引物 16 CGGGAGGTAGTAGTTTGTGC let-7a 反向引物 17 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAAC

47、 说 明 书 CN 102676637 B 10 8/10 页 11 let-7b 反向引物 18 TCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACC let-7c 反向引物 19 GGATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTA let-7d 反向引物 20 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT let-7e 反向引物 21 GATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACT let-7f 反向引物 22 GGATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAA let-7g 反向引物 23 GATATTCGCACGCATTTT

48、TTTTTTTTTTAACT let-7i 反向引物 24 ATATTCGCACGCATTTTTTTTTTTTTTAACA c7a 25 AACTATACTTCCTACTACCTCT c7e 26 AACTATACTTCCTCCTACCTCT 0104 结果如图 4、 图 5 和图 6 所示。其中， 图 5 显示了灵敏度、 线性及模板浓度动态范 围。 0105 在测试含有 EvaGreen 的 PCR 的专一性实验中， 针对人类 let 7 家族的 8 个小 RNA 成员 ( 序列如 SEQ ID No ： 1-8 所示或表 1 所示 )， 本发明人分别使用 4106个拷贝数的小 RNA 作为

49、模板， 用特异性 PCR 引物对 ( 序列如 SEQ ID NO ： 9-24 所示或表 1 所示 ) 进行 PCR 反应， 并检测各小 RNA 成员对各个不同的 PCR 引物的 PCR 反应的专一性及灵敏度。 0106 本实施例同时采用了 EvaGreen 和 SYBR Green 两种双链 DNA 结合染料， 对其专一 性及灵敏度进行对比。如果同族的反应的 Ct 值比非同族的 Ct 值低一个 Ct 值， 则非同族的 反应相当于同族反应的 50， 即其交叉反应为 50 ； 同理， 如果同族的反应的 Ct 值比非同 族的 Ct 值低 2 个 Ct 值， 则非同族的反应相当于同族反应的 25， 即其交叉反应为 25； 以 此类推， 如果同族的反应的 Ct 值比非同族的 Ct 值低 3 个 Ct 值， 则非同族的反应相当于同 族反应的 12.5， 即其交叉反应为 12.5 ； 如果同族的反应的 Ct 值比非同族的 Ct 值低 4 个 Ct 值， 则非同族的反应相当于同族反应的 6.25， 即其交叉反应为 6.25。在小 RNA 检 测实验中， 普遍可以接受低于 5的交叉反应。 0