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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210331228.X (22)申请日 2012.09.07 C07H 17/04(2006.01) C07H 1/08(2006.01) C07G 99/00(2009.01) (73)专利权人 中国林业科学研究院林产化学工 业研究所 地址 210042 江苏省南京市锁金五村 16 号 (72)发明人 黄立新 谢普军 张彩虹 游凤 王成章 周昊 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 CN 102085472 A,2011.06.08, CN 102060893 A,2011.05.18,。
2、 CN 101664664 A,2010.03.10, JP 特开2002-128678 A,2002.05.09,全文. GR 20050100601 B,2007.03.12, 全文 . EP 1795201 A1,2007.06.13, 全文 . 傅珊， 等 . 油橄榄叶中橄榄苦苷的分离纯 化 .生物加工过程 .2011, 第 9 卷 ( 第 4 期 ), 第 31-34 页 . 谢普军， 等 . 响应面法超声辅助提取优化 橄榄苦苷工艺的研究 .天然产物研究与开 发 .2012, 第 24 卷第 939-944 页 . (54) 发明名称 一种油橄榄叶提取物的制备方法及所用装置 (57)。
3、 摘要 本发明公开了一种油橄榄叶提取物的制备方 法及所用装置， 步骤为 ： 将油橄榄叶先使用混合 溶剂， 经超声减压沸腾提取， 真空抽滤， 得到澄清 液 ； 再进行石油醚萃取除去脂溶性杂质并收集下 层清液， 通过旋转蒸发至溶剂无醇味， 再稀释， 稀 释液通过大孔树脂纯化后， 静置一段时间使橄榄 苦苷及黄酮类物质吸附充分， 再使用适当浓度的 乙醇 - 水混合溶剂将橄榄苦苷洗脱并收集目标 液， 将收集的目标溶液经过葡聚糖凝胶的纯化， 静 置后用乙醇 - 水溶液洗脱， 再收集含有效成分的 洗脱液， 将其旋转蒸发至无醇味， 最后通过干燥获 得的提取物， 其中橄榄苦苷含量达 8592% 和总黄 酮含量达。
4、 2535%。操作简单， 提取时间短， 效率 高， 产品回收率高， 品质好且稳定。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 贾丹 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 (10)授权公告号 CN 102850416 B (45)授权公告日 2015.04.01 CN 102850416 B 1/1 页 2 1.一种油橄榄叶提取物的制备方法， 其特征在于， 步骤为 ： 第一步， 提取 ： 称取粉碎后的油橄榄叶采用超声减压沸腾法进行提取， 超声功率为 240-1200W， 真空度为 30-90kPa， 提取溶剂为乙醇 - 水溶液， 提。
5、取温度为乙醇水溶液的回流 温度， 提取时间为 1-30min ； 第二步， 萃取 ： 将第一步得到的提取液真空抽滤， 收集清液以萃取剂萃取后收集下层萃 取液， 所述的萃取剂为乙醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正己烷或石油醚中的任意一种 ； 第三步， 柱分离 ： 将第二步得到的下层萃取液旋转蒸发得到浓缩液， 浓缩液用水稀释 后用大孔树脂吸附， 吸附充分后， 以去离子水洗脱出去水溶性杂质， 再以乙醇 - 水溶液将橄 榄苦苷洗脱， 得到纯化后含有目标产物的收集液 ； 将收集的液体再通过葡聚糖凝胶树脂进 一步纯化， 并使用乙醇 - 水溶液进行洗脱， 收集包含有目标产物的溶液 ； 所述的大孔树脂为 DM130。
6、， DM301， D101， AB-8 或 DA201 中的任意一种树脂， 所述的凝胶树脂为 G-10， G-25 和 Sephadex LH-20 中的任意一种树脂， 洗脱流速在 1-8mL/min ； 第四步， 干燥 ： 将纯化后的目标溶液进行旋转蒸发后将浓缩液进行真空冷冻或喷雾干 燥制粉， 得到油橄榄叶提取物， 每克油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的质量百分比 85-92%。 2.如权利要求 1 所述的油橄榄叶提取物的制备方法， 其特征在于， 旋转蒸发的温度为 30-50。 权 利 要 求 书 CN 102850416 B 2 1/5 页 3 一种油橄榄叶提取物的制备方法及所用装置 技术领域 0。
7、001 本发明涉及天然产物化学有效成分提取纯化技术领域， 涉及的是一种含高纯度的 橄榄苦苷及总黄酮油橄榄叶提取物的制备工艺方法。 背景技术 0002 油橄榄是木樨科， 又名齐墩果， 亚热带常绿乔木， 耐旱， 耐寒， 是生长能力很强的长 寿树种。主要分布在地中海国家， 如希腊， 意大利， 西班牙等国家， 现世界各地几乎均有栽 培。 20世纪60年代开始引入中国， 现广泛分布地在云南、 甘肃、 广东、 广西、 四川、 陕西等地。 0003 油橄榄因其果实能榨取橄榄油而闻名， 橄榄油含有诸多的生物活性物质， 如不饱 和脂肪酸、 维生素 E、 橄榄苦苷、 羟基酪醇等。一些研究者发现橄榄叶中橄榄苦苷的含。
8、量明 显高于果实和树皮。在过去， 油橄榄叶就经常用做治疗疟疾。此外， 还有的文献报道称橄榄 叶提取物在美洲和欧洲用作膳食补充剂以增强免疫功能。 但每年也有成千上万吨的因修剪 和采收的废弃油橄榄叶没有得到充分利用而被直接燃烧或扔掉从而造成了环境的破坏。 因 此， 对油橄榄叶的开发具有提高其附加值及保护环境等重要意义。 0004 橄榄苦苷是一种裂环烯醚萜苷类多酚化合物， 广泛存在于各种木犀科的木犀榄 属、 丁香属、 女贞属等植物中， 如油橄榄叶， 素馨花， 丁香花女贞叶中都含有橄榄苦苷。 0005 橄榄苦苷含有诸多的药理活性， 如抗氧化、 抗炎、 抗菌、 抗病毒、 抗癌、 抗肿瘤和降 血糖等， 并。
9、逐渐应用于医药、 保健食品、 化妆品等行业且应用前景广阔。 0006 橄榄苦苷分子量为 540.5， CAS ： 32619-42-4， 结构式如下 ： 0007 0008 目前， 针对从油橄榄叶中提取分离橄榄苦苷的报道较多， 但目前没有适合一种操 作简单、 时间短、 效率高且适合工业化生产的工艺方法。 在国内， 从一些相关文献报道可知， 研究橄榄苦苷的提取方法， 主要有传统的热提取、 超声波辅助提取， 微波辅助、 超临界 CO2提 取等。而在国外， 研究人员的研究主要集中于橄榄苦苷的生理活性， 对其提取制备的方法 鲜有报道， 主要也是以热浸提及超声提取橄榄苦苷的研究为主。然而单一的提取方法往。
10、往 存在各自内在的缺陷， 如溶剂提取法耗能大， 耗材多， 耗时长， 提取效率低， 工业污染大 ； 超 临界 CO2萃取仪器投资费用高且难以应用于极性较强的物质及一次处理量较小 ； 微波辅助 提取， 对溶剂有选择性 ( 一般需使用极性溶剂 ) 且产生的巨大热量可能至橄榄苦苷分解 ； 超声辅助提取在提取过程中也会产生大量的热一方面也可能导致热敏性活性物质分解， 另 说 明 书 CN 102850416 B 3 2/5 页 4 一方面增加杂质的含量。因此， 常用单一的提取方法或多或少存在一定的弊端。中国专 利 200710107642.1 公开了一种油橄榄叶提取物的生产工艺， 使用乙醇或甲醇提取， 。
11、温度为 2565， 所用热提取时间为 36144 h， 或超声提取 20180min， 再经膜分离和离子交换分 离纯化得到的橄榄苦苷含量仅为 2-6%， 中国专利 201010181196.0 公开了一种橄榄苦苷的 制备方法， 所使用超临界流体 CO2萃取方法， 萃取时间为 3 h， 压力为 60 Mpa， 再经过 AB-8 大孔树脂和重结晶， 最后橄榄苦苷的得率约 98%。中国专利 200910311350.9 公开了一种橄 榄叶提取物制备的方法， 所需的提取时间为 510 h， 再经石油醚、 乙酸乙酯萃取， 反相柱液 相制备， 得到最后的橄榄苦苷含量超过 90%， 中国专利 2009101。
12、17588.8 公开了从油橄榄叶 中同步制备橄榄苦苷和橄榄总黄酮的工艺方法， 所用提取时间为 0.53 h。再通过串联的 大孔树脂分离纯化后再干燥， 最后得到的橄榄苦苷含量在 20-90% 范围内。而从一些国外专 利可知， 美国专利5714150公开了一种油橄榄叶提取物的制备方法， 从油橄榄叶中在70%乙 醇， 提取时间至少 4 h， 2080的温度下热提取橄榄苦苷， 最后其含量在 30-40% ； 美国专利 20030152656 公开了油橄榄叶提取物制备方法， 油橄榄叶粉碎后， 加入 MgSO4使其酶失活， 再用非极性溶剂 ( 石油醚、 正己烷、 氯仿和苯中的一种或几种的混合物 )， 并在。
13、 70的温度 下常压沸腾提取 2 h， 过滤再旋蒸以去除溶剂得浸膏 1， 再用水在常压沸腾下提取浸膏 1， 过 滤、 旋蒸， 得到浸膏 2， 再加入乙醇和食品级的活性炭在常压沸腾下提取浸膏 2， 过滤， 旋转 蒸发浓缩， 形成最后的浸膏产品3， 总共所需的浸提时间约为48-72 h， 最后油橄榄叶提取物 中橄榄苦苷含量仅为 6-10%。 0009 此外， 油橄榄叶中主要含有两类物质分别是裂环烯醚萜苷类和总黄酮类， 而裂环 烯醚萜苷类主要是以橄榄苦苷为主， 而黄酮种类达 20 多种， 主要以木犀草素和芹菜素含量 居多。从现有申请的专利可知， 有关油橄榄叶总黄酮提取的文献较少， 而且从油橄榄叶中 。
14、提取分离出的总黄酮的含量一般在 5% 左右， 黄酮含量高的不超过 25%。例如， 仅有的中国 专利 200910117588.8 涉及到总黄酮的提取 , 采用的是传统提取方法， 时间长 ( 达 3h)， 且 提取效率低等。然而通过本专利中采用新型组合提取及分离技术， 在获得高纯度的橄榄苦 苷的同时， 也可以获得高纯度的总黄酮， 其含量最高可达约 35% ； 有关前期的提取时间只需 310min, 并且一次提取效率可达 90% 以上。 0010 从以上一些国内外的专利可知， 使用的橄榄苦苷和总黄酮的提取方法多为热浸 提， 且提取时间大多为 310 h， 长则几十个小时， 不仅时间长， 而且效率较。
15、低， 不能同时获 得含高纯度的橄榄苦苷和总黄酮， 他们前期提取时间的延长大大增加了企业产品的生产周 期， 不利于企业经济效益和产品竞争力的提高。其中以上有些专利也有使用超临界流体萃 取橄榄苦苷， 这不仅增加了投资成本， 而且操作条件苛刻且操作复杂。 发明内容 0011 本发明提供了一种油橄榄叶提取物有关橄榄苦苷和总黄酮的制备方法， 解决了一 定纯度橄榄苦苷及总黄酮的生产工艺中提取时间长， 效率低等问题， 缩短生产周期。 0012 本发明所采用的技术方案如下 ： 一种油橄榄叶提取物的制备方法， 步骤为 ： 0013 第一步， 提取 ： 称取粉碎后的油橄榄叶采用超声减压沸腾法进行提取， 超声功率为。
16、 2401200W， 真空度为 3090kPa， 提取溶剂为乙醇 - 水溶液， 提取温度为乙醇 - 水溶液的回 流温度， 提取时间为 130min ； 说 明 书 CN 102850416 B 4 3/5 页 5 0014 第二步， 萃取 ： 将第一步得到的提取液真空抽滤， 收集清液以萃取剂萃取后收集下 层萃取液 ； 0015 第三步， 柱分离 ： 将第二步得到的下层萃取液旋转蒸发得到浓缩液， 浓缩液用水稀 释后用大孔树脂吸附， 吸附充分后， 以去离子水洗脱出去水溶性杂质， 再以乙醇 - 水溶液将 橄榄苦苷洗脱， 得到纯化后含有目标产物的收集液 ； 将收集的液体再通过葡聚糖凝胶树脂 进一步纯化。
17、， 并使用乙醇 - 水溶液进行洗脱， 收集包含有目标产物的溶液。 0016 第四步， 干燥 ： 将纯化后的目标溶液进行旋转蒸发后将浓缩液进行真空冷冻或喷 雾干燥制粉， 得到油橄榄叶提取物， 每克油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的质量百分比8592%， 总黄酮含量达 2535%wt。 0017 旋转蒸发的温度为 3050。 0018 所述的萃取剂为乙醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正己烷或石油醚中的任意一种。 0019 所述的大孔树脂的 DM130， DM301， D101， AB-8 或 DA201 中的任意一种树脂， 和葡萄 糖凝胶树脂的 G-10， G-25 和 Sephadex LH-20 中的任意一。
18、种树脂， 洗脱流速在 18mL/min。 0020 用于所述的油橄榄叶提取物的制备方法中的装置， 水浴锅内设有反应器， 反应器 内设有超声探头、 温度控制器， 反应器与冷凝器连接， 冷凝器与真空泵连接， 冷凝器与真空 泵之间设有真空表与控制阀。 0021 超声探头和超声控制器连接。 0022 有益效果 ： 0023 1、 本发明采用在超声辅助作用下相对低温减压沸腾提取， 在超声及低温减压的耦 合协同作用下， 不仅提高了提取效率而且显著缩短了时间 (310 min)， 缩短产品的生产周 期， 提高企业的经济效益。 0024 2、 在相对低温下减小了杂质的溶入(如蛋白质、 多糖、 色素等)保证了橄。
19、榄苦苷品 质稳定且含量高。 0025 3、 保护了提取过程活性物质不被热缩破坏分解， 氧化或聚合。 0026 4、 两次高效的柱分离， 不仅可以提高橄榄苦苷的含量， 而且对总黄酮的富集有利。 0027 5、 本发明工艺稳定， 收率高， 一次提取效率能达 90% 以上 ； 重现性好， 产品品质好， 真空冷冻或喷雾干燥后得到油橄榄叶提取物， 其中橄榄苦苷的含量高达 8592%, 总黄酮含 量达 2535% ； 适合工业化生产。 附图说明 0028 图 1 为本发明的提供的工艺流程图。 0029 图 2 为橄榄苦苷超声 - 减压提取装置。 0030 在图 2 中 1. 超声控制器 ; 2. 超声探头。
20、 ; 3. 聚四氟乙烯 ; 4. 真空表 ; 5. 控制 阀 ; 6. 真空泵 ; 7. 冷凝管 ; 8. 温度计 ; 9. 数显温度 ; 10. 烧瓶 ; 11. 水浴锅。 0031 图 3 为橄榄苦苷提取液的高效液相图 ( 进样量 12l)。 0032 图 4 为 AB-8 大孔树脂纯化后的高效液相图 ( 进样量 3l)。 0033 图 5 为 G-25 葡聚糖凝胶树脂纯化后的高效液相图 ( 进样量为 2l)。 0034 图 6 为经树脂纯化后橄榄苦苷的质谱图。 说 明 书 CN 102850416 B 5 4/5 页 6 具体实施方式 0035 一种油橄榄叶提取物的制备方法 ： 0036。
21、 (1) 提取 ： 称取一定量的油橄榄叶粉 （提取装置如图 2 所示） ， 再加入适量沸石， 用 极性溶剂在油橄榄叶与溶剂的比例为 1:101:30(w/v)， 提取温度为 4050， 提取时间为 130 min, 超声功率为 2401200 W， 体系真空度为 3090 kPa 的条件下， 进行超声减压沸 腾提取， 所述的极性溶剂为乙醇和去离子水的混合液。 0037 (2) 萃取 ： 将上述 (1) 的提取液经过真空抽滤， 收集的清液转移至分液漏斗加入 石油醚萃取， 静置 10min， 收集下层清液。 0038 (3) 柱分离 ： 将 (2) 的收集液在 3050进行旋转蒸发回收溶剂， 得到。
22、一定量的 浓缩液， 再加适量的去离子水稀释， 经 AB-8 大孔树脂先吸附， 等吸附充分后， 树脂用去离子 水洗脱除去水溶性杂质， 再直接使用浓度为 30%90% 乙醇以一定的流速将橄榄苦苷洗脱下 来。将收集纯化后的溶液再进行葡聚糖凝胶纯化， 洗脱液使用 2040% 的乙醇水溶液， 最后 收集目标溶液。 0039 (4) 干燥 ： 将(3)中最后纯化后的收集液在3050进行旋转蒸发回收洗脱液， 进 行真空冷冻或喷雾干燥制粉， 可得到每克油橄榄叶粉中橄榄苦苷纯度可达 85% 以上， 总黄 酮含量达 2535%。 0040 步骤(1)中所述的极性溶剂味乙醇-水混合物， 优选质量分数为75%85%的。
23、乙醇。 0041 步骤 (2) 中石油醚萃取的次数为 2 次。 0042 步骤 (3) 中使用乙醇洗脱液的浓度为 65%75%， 乙醇 - 水洗脱液浓度为 2530%。 0043 步骤 (4) 中真空冷冻干燥时间为 10 h。 0044 实施例 1 0045 (1) 提取 ： 将自然阴干的油橄榄叶 100 g， 用粉碎机粉碎， 置于超声减压提取装置 中， 加入适量沸石， 2 L 的75%乙醇， 温度50， 超声功率为600 W， 真空度为70 kPa， 时间为 5 min 的条件下进行超声 - 减压沸腾提取。 0046 (2) 萃取 ： 将收集的提取液加入容量 5 L 的分液漏斗中， 再分别加。
24、入 500 ml 石油 醚萃取 3 次， 静置 10 min， 收集分层液的下层液。 0047 (3) 柱分离 ： 从分液漏斗收集的下层液， 在 45下旋蒸回收醇溶剂至浓缩液无醇 味， 再加入400ml去离子水稀释， 再经AB-8大孔树脂分离， 吸附30 min后， 用70%乙醇洗脱， 收集 58 柱体积的收集液。将收集液通过葡聚糖凝胶树脂进一步的纯化， 静置 30min, 用 25% 乙醇 - 水洗脱， 收集目标溶液。 0048 (4) 干燥 ： 将纯化后收集液于 45减压回收乙醇溶剂至无醇味， 在真空冷冻下干 燥后， 得到 45 g 油橄榄叶粉， 其中橄榄苦苷含量为 88.3%， 总黄酮的。
25、含量达 30.3%。 0049 所得产品用反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 分析检测， 色谱条件 ： C18ODS2 色谱柱 （4.6 mm200 mm， 5 m） , 柱温 ： 30， 流动相 ： 甲醇 - 水体积比为 0.40:0.60， 测定波 长 ： 232 nm， 流速 ： 1 mLmin-1。总黄酮的含量是通过紫外分光光度法 (UV-Vis) 测定的。 0050 实施例 2 0051 (1) 提取 ： 称取自然阴干的油橄榄叶 300 g， 通过粉碎机粉碎， 放于超声减压提取 装置中， 加入适量沸石， 3.5 L 的75%乙醇， 温度45， 超声功率为720 W， 真空度为75 。
26、kPa， 时间为 7 min 的条件下进行超声 - 减压沸腾提取。 说 明 书 CN 102850416 B 6 5/5 页 7 0052 (2) 萃取 ： 将收集的提取液加入容量 5 L 的分液漏斗中， 再分别加入 850 ml 石油 醚萃取 3 次， 静置 15 min， 收集分层液的下层液。 0053 (3) 柱分离 ： 从分液漏斗收集的下层液， 在 50下旋蒸回收乙醇溶剂并使浓缩液 无醇味， 再加入750 ml去离子水稀释， 再经AB-8大孔树脂分离， 吸附30 min后， 用70%乙醇 洗脱， 收集 58 柱体积的收集液， 将收集液通过葡聚糖凝胶树脂进一步的纯化， 静置 30min,。
27、 用 28% 乙醇 - 水洗脱， 收集目标溶液。 0054 (4) 干燥 ： 将纯化后收集液于 40减压回收乙醇溶剂至无醇味， 在喷雾干燥后， 得到 140 g 油橄榄叶粉， 其中橄榄苦苷含量为 89.6%， 总黄酮的含量达 32.8% 0055 所得产品用反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 分析检测， 色谱条件 ： C18ODS2 色谱柱 （4.6 mm200 mm， 5 m） ,柱温 ： 30， 流动相 ： 甲醇-水体积比为0.40:0.60， 测定波长 ： 232 nm， 流速 ： 1 mLmin-1。总黄酮的含量是通过紫外分光光度法 (UV-Vis) 测定的。 0056 实施例 3 。
28、0057 (1) 提取 ： 称取自然阴干的油橄榄叶 500 g， 通过粉碎机粉碎， 放于超声减压提取 装置中， 加入适量沸石， 5 L 的75%乙醇， 温度50， 超声功率为720 W， 真空度为80 kPa， 时 间为 7 min 的条件下进行超声 - 减压沸腾提取。 0058 (2) 萃取 ： 将收集的提取液加入容量5 L的分液漏斗中， 再分别加入1200 ml石油 醚萃取 3 次， 静置 10 min， 收集分层液的下层液。 0059 (3) 柱分离 ： 从分液漏斗收集的下层液， 在 50下旋蒸回收乙醇溶剂并使浓缩液 无醇味， 再加入 1000 ml 去离子水稀释， 再经 AB-8 大孔。
29、树脂分离， 吸附 45 min 后， 用 75% 乙醇洗脱， 收集 58 柱体积的收集液， 将收集液通过葡聚糖凝胶树脂进一步的纯化， 静置 30min, 用 30% 乙醇 - 水洗脱， 收集目标溶液。 0060 (4) 干燥 ： 将纯化后收集液于 45减压回收乙醇溶剂至无醇味， 在真空冷冻干燥 后， 得到 240 g 油橄榄叶粉， 其中橄榄苦苷含量为 90.9%， 总黄酮含量达 28.7% 0061 所得产品用反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 分析检测， 色谱条件 ： C18ODS2 色谱柱 （4.6 mm200 mm， 5 m） ,柱温 ： 30， 流动相 ： 甲醇-水体积比为0.40:0.60， 测定波长 ： 232 nm， 流速 ： 1 mLmin-1。总黄酮的含量是通过紫外分光光度法 (UV-Vis) 测定的。 说 明 书 CN 102850416 B 7 1/4 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102850416 B 8 2/4 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102850416 B 9 3/4 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102850416 B 10 4/4 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 102850416 B 11 。